李 瓊， 馬 常 嘯， 陳 麗 紅， 楊 光 銳*

(1.大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連 116024；2.大連醫(yī)科大學 醫(yī)學科學研究院，遼寧 大連 116044)

0 引 言

生物鐘是生命活動的內在節(jié)律，是生物體對周期性變化的環(huán)境，尤其是晝夜變化所做出的適應性反應.光作為最重要的授時因子在調節(jié)體內時鐘，以使其與外界環(huán)境相適應中起著至關重要的作用[1].當發(fā)生晝夜紊亂時，體內時鐘與外界時鐘不同步，可能引起一定的時差反應[2].盡管時差現(xiàn)象在自然界中并不常見，但隨著科技的飛速發(fā)展，現(xiàn)代社會已有很多人受到時差、熬夜、晝夜顛倒等生物鐘紊亂的影響.

小鼠作為最重要的哺乳類模式生物，廣泛應用于時差等生物鐘紊亂的研究.有實驗表明，不同品系小鼠的行為節(jié)律，包括自由運動周期(free running period，F(xiàn)RP)[3]、調整時差的速度等具有顯著的差異.比如，BALB/c小鼠的FRP明顯短于C57BL/6小鼠[3-4]；同時，BALB/c小鼠調整時差的速度總體上快于C57BL/6小鼠[5-7].即使同一品系的小鼠，在不同的實驗環(huán)境中，甚至在同一實驗中也存在一定的個體差異.有證據顯示，面對單次向前6 h時差(+6，即相當于向東跨越6個時區(qū))處理，C57BL/6小鼠需要4～9 d不等的時間去調整自身的行為節(jié)律[8-10].另外，時差的方向對機體的適應能力以及健康也有不同的影響，人群樣本研究表明，向東飛行產生的時差比向西飛行更有損健康[11].小鼠也有類似的情況，據報道，長期暴露于頻繁的提前時差(相當于向東跨時區(qū)旅行)干擾下的老年小鼠的壽命顯著短于延遲時差組的同齡小鼠[12].

盡管人們早就知道長期生物鐘紊亂有損健康，對小鼠也有大量關于生物鐘紊亂降低機體免疫力，誘發(fā)或加重心血管疾病、代謝性疾病、神經退行性病變等眾多慢性重大疾病的報道[13]，但到目前為止，偶發(fā)時差對正常小鼠健康的影響還知之甚少，主要原因是單次或數(shù)次時差處理仍然是比較弱的有害刺激，也鮮有足夠敏感的檢測輕微生物鐘紊亂的客觀指標.另外，短期內數(shù)次重復的時差是否會在一定程度上提高小鼠調整生物鐘的能力也尚不清楚.為此本文給予C57BL/6小鼠多次向前6 h時差或向后6 h時差(-6，即相當于向西跨越6個時區(qū))處理，利用跑輪活動數(shù)據計算出小鼠調整每一次時差所需時間，以了解小鼠適應能力的動態(tài)變化.

1 材料和方法

1.1 實驗動物

6周齡雄性C57BL/6小鼠(長生生物技術有限公司，遼寧本溪)飼養(yǎng)于配有跑輪的鼠籠，每籠一只，所有鼠籠均放置于燈光可控的通風柜中(普百康科技發(fā)展有限公司，湖北武漢)，小鼠適應2周后開始進行實驗.實驗前及實驗的全過程，小鼠自由飲水和攝食.除時差處理外，小鼠均處于正常晝夜環(huán)境中(12 h光照/12 h黑暗)，開燈時，光亮度在跑輪最低點的層面大約為100 lx.

該動物研究得到了大連理工大學動物保護與使用委員會的審查和批準.

1.2 跑輪活動

使用ClockLab軟件(Actimetrics，美國)記錄小鼠在實驗全過程跑輪活動的情況，每10 min記錄一次.小鼠每天活動的起始點定義為該天第一個活動數(shù)大于或者等于當天活動峰值數(shù)的10%，并且在之后的連續(xù)6個活動數(shù)中至少有3個滿足這一條件[9]；每天活動結束點的定義與之相反，即最后一個活動數(shù)小于或者等于峰值數(shù)的10%，并且在之前的6個活動數(shù)中至少有3個滿足這一條件[14-15].經歷時差時，行為節(jié)律與新光暗周期重新同步化定義為當天活動起始點或結束點與時差前一天活動起始點或結束點相差小于0.5 h[14].由于掩蔽效應的存在，向前時差重新同步化的天數(shù)以活動起始點的時間來計算，向后時差的同步根據活動結束點來計算[16].用小鼠活動開始(或結束)的時間點與實際關燈(或開燈)時間點的差值即相位角(θ)來表示小鼠的行為節(jié)律在當前光暗周期下的適應和穩(wěn)定程度，其中正值表示時差提前，負值表示時差延遲[9].

1.3 時差計劃

小鼠飼養(yǎng)2周后隨機分為A、B兩組(每組7只).A組小鼠先經歷4次+6時差，隨后經歷3次-6時差(分別命名為A1～A4，A′1～A′3).B組小鼠先經歷3次-6時差，隨后經歷2次+6時差(分別命名為B1～B3，B′1～B′2).相鄰時差間隔的天數(shù)大于等于每組中調整時差最慢的小鼠同步所需要的天數(shù).

1.4 統(tǒng)計學分析

利用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據都采取雙尾檢驗.兩組數(shù)據之間比較使用t檢驗；多組數(shù)據間的比較利用單因素方差分析和雙因素方差分析，結合Tukey檢驗.所有柱圖結果用均值±標準誤差表示.p<0.05表示有統(tǒng)計學差異.

2 結果分析

2.1 先+6時差后-6時差處理對小鼠行為節(jié)律的影響

在A組時差模型中，小鼠先經歷4次+6時差(圖1(a)，圓點代表小鼠活動的開始點，紅色箭頭代表該小鼠行為節(jié)律在這一天重新適應)，隨著時差次數(shù)的增加，相位角的最大值有逐漸降低的趨勢(圖1(b)，黃色箭頭代表光暗周期發(fā)生了相移).小鼠調整時差所需的時間分別為(5.33±0.21)d、(4.29±0.40)d、(2.57±0.50)d、(1.29±0.20)d(圖1(c))，總體上逐漸減少(A3vs.A1，p=0.007；A4vs.A1，p<0.001；A4vs.A2，p=0.003)，尤其是最后一次+6時差后，7只小鼠中有5只幾乎立刻適應了新的時間，另外2只也在2 d內調整完時差.

隨后給予小鼠反向，即-6時差處理(圖2(a))，并采用每天活動的結束點來分析小鼠重新適應新的光暗周期的能力(圖2(b)).結果顯示小鼠調整3次時差所需的時間依次為(5.71±0.61)d、(3.57±0.30)d、(2.86±0.26)d(圖2(c))；其中A′2、A′3相較A′1顯著縮短(A′2vs.A′1，p=0.008；A′3vs.A′1，p=0.005)，但A′2與A′3無統(tǒng)計學差異.

2.2 先-6時差后+6時差處理對小鼠行為節(jié)律的影響

在B組時差模型中，小鼠先經歷3次-6時差(圖3(a))，隨著時差次數(shù)的增加，相位角的最大值有下降趨勢(圖3(b))，小鼠調整3次時差所需的時間分別為(5.83±0.40)d、(4.67±0.33)d、(3.00±0.36)d(圖3(c)).其中，B3與B1、B2相比縮短的趨勢具有顯著性差異(B3vs.B1，p=0.012；B3vs.B2，p=0.024).

隨后給予小鼠兩次+6時差處理(圖4(a))，兩次時差間的相位角的最大值基本相同(圖4(b))，但調整時差所需的時間具有顯著性差異[B′1，(13.17±0.65)d；B′2，(8.83±0.65)d，p=0.007](圖4(c)).

2.3 反向時差對小鼠行為節(jié)律的影響

A、B兩組小鼠在第一階段單向時差處理過程中，調整行為節(jié)律的速度逐步提高，且提高的程度相近.然而，在第二階段，即經歷反向時差時，兩組小鼠的行為表現(xiàn)出顯著的差異(圖5(a)、(b)).A組小鼠先經歷+6時差再經歷-6時差，兩個階段的第一次時差所需的調整時間無統(tǒng)計學差異(A1vs.A′1，p=0.779)，但是B組小鼠調整第一次反向時差需要花費大約13 d，大大超出調整B1時差所需的時間(p<0.001)，也超出A組第一次反向時差所需的調整時間(p<0.001，圖5(c)).

3 結果討論

大量流行病學調查結果顯示，長期生物鐘紊亂與心血管疾病[17]、代謝性疾病[18]、腫瘤[19]、神經退行性病變[20]等眾多人類常見重大慢性疾病的發(fā)生發(fā)展相關[21].動物實驗研究也證實了它們之間的因果關系.然而，在經歷一次或少數(shù)幾次晝夜紊亂干擾之后，盡管機體會產生一定程度的時差反應，但并沒有可靠的證據表明會導致器質性病變的發(fā)生，為研究短時間內進行數(shù)次時差處理是否可以提高機體調整生物鐘或倒時差的能力，記錄了C57BL/6小鼠在多次+6和-6時差中的跑輪活動情況，并計算了每次調整時差所需時間，以大致反映不同次數(shù)時差間小鼠適應能力的差別.首先，與預期的一樣，兩組小鼠在分別經歷第一次+6和-6時差時，行為節(jié)律重新與光暗周期同步化所需要的時間基本相同，這也與先前的報道一致[9]，說明盡管兩個方向的時差對機體健康的影響不同[12]，但行為學上兩組小鼠調整時差所需的時間基本一致.在接下來重復同向的時差過程中，無論是正向時差或是反向時差，小鼠行為節(jié)律重新與光暗周期同步化所需要的時間都有所減少，這表明至少在行為學上，對于6 h的時差來說，小鼠調整生物鐘的能力隨著時差次數(shù)增加而增強.

隨后，給予兩組小鼠反向時差處理，即先前經歷+6時差的小鼠行-6時差處理，反之亦然.結果顯示先經歷+6時差的小鼠，在經歷第一次反向時差，即-6時差時，調整行為節(jié)律所需的時間并未進一步減少，而是與初次經歷+6時差時類似.在先經歷-6時差，后經歷+6時差的小鼠，適應第一次+6時差所需的時間竟然顯著延長至13 d.這或許因為小鼠已經適應了第一階段的單向時差，突然給予反方向的時差將變得不適應，推測如果兩個階段間隔時間足夠長，將看不到這一現(xiàn)象；類似地，相鄰的同向時差間隔時間足夠長也將看不到適應性增強的情況，但間隔多久才能完全消除之前的印記，以及這些現(xiàn)象的分子基礎是什么，都有待進一步研究.

4 結 語

本實驗通過對C57BL/6小鼠進行短期數(shù)次同向的時差處理，發(fā)現(xiàn)無論是向前或是向后的時差，都能夠逐步提高小鼠調節(jié)行為節(jié)律的能力；但隨后給予反向時差時，小鼠的適應能力并不會進一步提高，還會被大大削弱.這些結果都表明小鼠調節(jié)時差的能力與時差的次數(shù)和方向的變化密切相關，也提示對于經常輪班工作，比如三班倒的人群來說，單向循環(huán)的輪班制相對健康.