徐 鴿，趙雪丹，陳躍來

(1上海中醫(yī)藥大學(xué)·上海 201210；2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院·上海 200032)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡婦女常見的生殖內(nèi)分泌代謝性疾病，主要表現(xiàn)為排卵障礙和高雄激素血癥，患病率占育齡婦女的5%～10%[1]，約占不排卵婦女的75%[2]，是引起無排卵性不孕的主要原因。PCOS患者不孕的原因主要是不排卵和卵母細(xì)胞質(zhì)量差等。PCOS患者經(jīng)過不同方案治療糾正內(nèi)分泌代謝紊亂、促排卵后，雖然可以獲得較高的排卵率，但早期流產(chǎn)率高達(dá)50%，最終妊娠率只有40%～50%[2]。妊娠失敗與胚胎種植失敗密切相關(guān)，而胚胎種植失敗的主要原因在于不良的子宮內(nèi)膜容受性。PCOS 患者機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)分泌和代謝的異?？捎绊懽訉m內(nèi)膜容受性，克羅米芬促排卵治療使內(nèi)膜的異常發(fā)育進(jìn)一步加重和容受性標(biāo)志分子的異常表達(dá)[3]，是 PCOS患者生殖功能低下和不良妊娠結(jié)局發(fā)生率高的重要原因。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)電針關(guān)元、三陰交、足三里可改善PCOS大鼠高雄激素血癥，并能調(diào)節(jié)卵巢雄激素受體的表達(dá)，改善卵泡發(fā)育[4-5]。本次研究在前期研究基礎(chǔ)上，觀察PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的病理變化以及不同穴位電針對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜性激素受體表達(dá)的影響，探討PCOS子宮內(nèi)膜病變及針刺對其影響的機(jī)制和穴位特異性，以期為臨床治療提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康清潔級6周齡雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量(160±20)g，購自上海市斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號：SCXK(滬)2012-0002。環(huán)境濕度40%～60%,溫度20～23 ℃,每日光照12 h,自由飲水,喂飼標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的審批，符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查規(guī)范(倫理編號：PZSHUTCM190308006)。

1.2 主要試劑與儀器 來曲唑片：江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；羧甲基纖維素(CMC)：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；雄激素受體(AR)抗體、雌激素受體(ER)抗體：武漢賽維爾生物科技有限公司。華佗牌SDZ-V型電針治療儀：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司；華佗牌0.25 mm×25 mm一次性使用無菌針灸針：蘇州醫(yī)療用品廠有限公司。DM 2000型顯微鏡：德國萊卡公司；Eclipse Ti-SR正置熒光顯微鏡：日本尼康公司；Image-pro plus 6.0圖像分析軟件：Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA。

1.3 動(dòng)物分組、模型制備及處理 60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為正常對照組、模型組、“三陰交”組、“足三里”組、“關(guān)元”組、綜合組，每組10只。根據(jù)Kafali方法[6]，來曲唑溶于1% 羧甲基纖維素(CMC)中，除正常對照組外，其余5組大鼠按照1 mg/(kg·d)劑量灌胃給藥，連續(xù)定時(shí)灌服21 d，正常飼養(yǎng)。灌胃第12天進(jìn)行陰道涂片觀察大鼠動(dòng)情周期變化判定造模是否成功，大鼠陰道細(xì)胞涂片失去周期性變化為造模成功。正常對照組給予同濃度(0.1 mg/mL)同灌胃體積(10 mL/kg)的CMC溶劑灌胃，連續(xù)21 d，然后每日用大鼠固定器固定，連續(xù)14 d，不做針刺處理。模型組于造模成功次日開始，每日大鼠固定器固定，連續(xù)14 d，不做針刺處理。各電針組于造模成功次日開始，分別選擇相應(yīng)穴位進(jìn)行干預(yù)。取穴方法及大鼠穴位定位方法參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]。各組大鼠固定器固定，分別取穴“關(guān)元”及旁開5 mm非穴位點(diǎn)，足三里組取雙側(cè)“足三里”，三陰交組取雙側(cè)“三陰交”，綜合組3穴同時(shí)針刺，0.25 mm×25 mm 毫針針刺后接電針，兩組電極分別連接刺入雙側(cè)“足三里”和雙側(cè)“三陰交”的毫針，另一組電極連接刺入“關(guān)元”及穴旁非穴位點(diǎn)的毫針；采用連續(xù)波，頻率2 Hz，輸出強(qiáng)度1～3 mA，大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度, 20 min/次,每日1次,連續(xù)14 d。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 標(biāo)本采集 選擇處于動(dòng)情間期的大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射(0.1 mL/100 g)麻醉，剪開腹腔，迅速摘除雙側(cè)子宮于4%多聚甲醛溶液固定24 h，以備組織學(xué)觀察。

1.4.2 子宮指數(shù) 取大鼠雙側(cè)子宮，剝離周圍脂肪組織并稱重，計(jì)算子宮指數(shù)。

1.4.3 卵巢、子宮病理學(xué)觀察 取大鼠左側(cè)卵巢、子宮，4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟、水化后，蘇木素染色，1%鹽酸酒精分化，1%伊紅溶液染色，脫水、透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.4.4 免疫組化法測定AR、ER表達(dá) 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，將組織切片置于檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后PBS(pH 7.4)洗滌3次，然后將切片放入3%過氧化氫溶液(雙氧水/純水=1/9)，室溫避光孵育25 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：PBS洗滌3次，切片稍甩干后滴加3% BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加BSA按一定比例(AR抗體1∶500,ER抗體為1∶100)配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。第2 天PBS洗滌3次，滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育50 min。PBS洗滌3次，滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復(fù)染3 min，藍(lán)化，脫水透明，中性樹膠封片，并用PBS作陰性對照。

結(jié)果判定與分析方法：細(xì)胞質(zhì)中見棕黃色或棕褐色顆粒細(xì)胞為陽性表達(dá)，每張切片隨機(jī)選擇觀察視野5 個(gè)，采用Motic Images Plus 6.0 分析累計(jì)光密度 (IOD) 及染色區(qū)域的面積(Area)。平均光密度(AOD)=IOD/Area。

2 結(jié)果

2.1 造模及處理情況 瑞氏染色顯示造模結(jié)束后造模各組大鼠每天陰道涂片鏡下僅見大量白細(xì)胞，持續(xù)處于動(dòng)情間期，全部失去規(guī)律動(dòng)情周期，提示造模成功。正常對照組大鼠均有規(guī)律動(dòng)情周期。結(jié)束治療后第2 天動(dòng)情周期處于間期大鼠，即刻處理；其余大鼠恢復(fù)喂食，至晚8點(diǎn)繼續(xù)禁食過夜，治療后第3 天涂片顯示大鼠均處于動(dòng)情間期，按前述標(biāo)本采集方法處理。

2.2 各組大鼠子宮指數(shù)比較 見表1。

表1 各組大鼠子宮指數(shù)比較

2.3 各組大鼠卵巢與子宮病理學(xué)觀察結(jié)果 正常對照組大鼠卵巢色澤紅潤，顆粒均勻，無囊狀突起；光鏡下檢查可見多個(gè)黃體及不同發(fā)育階段的卵泡，顆粒細(xì)胞呈多層排列，形態(tài)完整。模型組大鼠卵巢肉眼觀察顏色較為蒼白、包膜增厚，可見囊狀卵泡突起；光鏡下可見囊狀擴(kuò)張卵泡，囊狀卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞或放射冠消失，間質(zhì)細(xì)胞增生，卵巢顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，排列松散，可見較多發(fā)育早期的小卵泡，黃體少見。模型組卵巢形態(tài)學(xué)變化符合PCOS病理變化特征。各針刺組與模型組比較卵巢體積減小，囊狀卵泡數(shù)量減少，黃體增加，卵泡的顆粒細(xì)胞層增加，并觀察到帶有卵丘的亞成熟卵泡。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織病理學(xué)變化(HE，×40)

正常對照組大鼠子宮鏡下可見內(nèi)膜腺體數(shù)目較多，腺體多呈簇狀排列，紆曲較多。PCOS 組大鼠肉眼觀察子宮較正常組明顯變細(xì)，光鏡下觀察子宮內(nèi)膜變薄，內(nèi)膜腺體數(shù)目與正常組相比明顯減少，腺體多為單個(gè)分散排列，少有紆曲。而各電針組與模型組相比肉眼觀察子宮直徑增大，光鏡下檢查可見子宮內(nèi)膜增厚，子宮內(nèi)膜腺體增多，腺腔管壁增厚。三陰交組與關(guān)元組腺體較多，與正常組形態(tài)較為接近。見圖2。

圖2 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化(HE，×100)

2.4 各組大鼠子宮AR、ER表達(dá)的免疫組化測定結(jié)果 AR在大鼠子宮的表達(dá)主要定位在子宮上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，陽性細(xì)胞大部分表現(xiàn)為棕褐色。 與正常對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜AR表達(dá)明顯增加(P<0.05)；足三里組較模型組AR表達(dá)明顯減少(P<0.05)，其余各電針組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖3。ER主要表達(dá)在大鼠子宮腺上皮和腔上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)。模型組與正常組比較ER表達(dá)明顯增加(P<0.05)，與模型組比較，足三里與三陰交組ER表達(dá)明顯降低(P<0.01)，關(guān)元組和綜合組有下降趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖4。

表2 各組大鼠子宮內(nèi)膜 AR、ER 蛋白表達(dá)比較

圖3 各組大鼠子宮內(nèi)膜AR表達(dá)(免疫組化，×100，標(biāo)尺示100 μm，箭頭示陽性細(xì)胞)

圖4 各組大鼠子宮內(nèi)膜ER表達(dá)(免疫組化，×100，標(biāo)尺示100 μm，箭頭示陽性細(xì)胞)

3 討論

針灸治療女性不孕癥歷史悠久，目前針刺治療PCOS已開展了較多的臨床研究，發(fā)現(xiàn)針刺可調(diào)節(jié)患者月經(jīng)周期和激素水平，控制體重，改善反映胰島素敏感性的指標(biāo)如空腹血糖、空腹胰島素等[8]；而且針刺能夠改善PCOS患者卵子質(zhì)量，提高體外受精-胚胎移植的臨床妊娠率[9]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在影響子宮內(nèi)膜容受性方面，針灸可通過提高胞飲突表達(dá)、增加薄型子宮內(nèi)膜厚度等指標(biāo)改善子宮內(nèi)膜形態(tài)，并可影響子宮內(nèi)膜微循環(huán)指標(biāo)和整合素、同源框基因10等分子生物學(xué)調(diào)控因子的表達(dá)，從而影響子宮內(nèi)膜容受性為胚胎著床提供良好條件，提高妊娠率，尤其是在輔助生殖領(lǐng)域應(yīng)用具有顯著優(yōu)勢[10]。

高雄激素是PCOS基本的最主要的病理特征，在PCOS發(fā)病中占重要地位，是本病主要的內(nèi)分泌改變和導(dǎo)致PCOS臨床癥狀的主要原因。雄激素通過與AR結(jié)合而發(fā)揮作用，雄激素作用的發(fā)揮與AR的分布和數(shù)量等密切相關(guān)。雄激素不僅作為底物生成雌激素，而且還在圍種植期與雌激素相互作用調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜生長。雄激素受體在子宮內(nèi)膜的間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞均有表達(dá)，呈周期性變化。在增殖期表達(dá)逐漸上升，于增殖晚期達(dá)到高峰；至分泌期雄激素受體在兩種細(xì)胞上的表達(dá)均下降。ER是雌孕激素作用于子宮內(nèi)膜容受性的中介。ER有α、β兩種亞型，其中ERα表達(dá)于子宮內(nèi)膜腺上皮和腔上皮細(xì)胞，間質(zhì)細(xì)胞也有少量表達(dá)，是雌激素作用于子宮內(nèi)膜的主要亞型。其含量與雄激素受體一樣也呈周期性變化，增生期含量最高，于分泌期開始下降，并隨著分泌期的進(jìn)展逐漸減少，在分泌晚期的含量最少，此時(shí)最適宜胚胎著床。低雌激素水平可使子宮窗口期時(shí)相延長,高水平則使其很快關(guān)閉, ERα的降低被認(rèn)為是內(nèi)膜種植窗的標(biāo)志。雄、雌激素及其受體在時(shí)間和空間上的正確表達(dá)是形成良好內(nèi)膜容受性的重要因素，其中任一因素表達(dá)失常都可導(dǎo)致著床失敗。研究發(fā)現(xiàn)，在PCOS患者子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中，雄激素受體在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均明顯上升，在種植期上升尤為顯著[11]。無排卵的PCOS患者體內(nèi)長期處于無孕激素拮抗?fàn)顟B(tài)，表達(dá)增加的雄激素受體與升高的雄激素協(xié)同作用，放大雄激素對子宮內(nèi)膜的影響，進(jìn)一步降低子宮內(nèi)膜容受性[12]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)未治療的PCOS 患者分泌中期子宮內(nèi)膜 ERα表達(dá)明顯高于正常對照組，ER 這種異常的表達(dá)可能與PCOS體內(nèi)高雌激素刺激子宮內(nèi)膜 ERα表達(dá)增多有關(guān)[13]。

本研究中發(fā)現(xiàn)PCOS大鼠子宮明顯變細(xì)，子宮指數(shù)降低，子宮內(nèi)膜變薄，腺體減少。子宮內(nèi)膜AR、ER各組間比較，模型組顯著高于正常組(P<0.01)，說明PCOS大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)及性激素受體表達(dá)存在異常，可能與高雄激素內(nèi)環(huán)境的刺激有關(guān)。 各針刺組子宮內(nèi)膜增厚，形態(tài)改善。關(guān)元組子宮指數(shù)明顯增加，其余3 組與模型組比較子宮指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同穴位干預(yù)效果存在差異。針刺足三里組大鼠AR和ER表達(dá)均顯著低于模型組，針刺三陰交組ER表達(dá)顯著低于模型組，但AR表達(dá)水平較模型組無顯著差異，其余兩針刺組與模型組比較AR、ER表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明針刺對PCOS大鼠異常的性激素受體表達(dá)有一定改善作用。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺對雄激素水平和卵泡發(fā)育的調(diào)節(jié)作用以關(guān)元組效果較好[4-5]，本研究中關(guān)元組大鼠子宮指數(shù)較模型組增加明顯，形態(tài)改善最佳，但對性激素受體的調(diào)節(jié)作用并不明顯，針刺關(guān)元可能通過影響子宮內(nèi)膜容受性其他調(diào)控因子或途徑起效。電針不同穴位對子宮內(nèi)膜容受性的干預(yù)機(jī)制存在差異，多穴位聯(lián)合應(yīng)用對PCOS大鼠子宮內(nèi)膜的改善效應(yīng)并未呈現(xiàn)作用疊加結(jié)果。提示臨床治療PCOS選穴應(yīng)根據(jù)個(gè)體癥狀精簡精準(zhǔn)，盲目累加并不可取。