俞萍萍，金曉昇

(1浙江中醫(yī)藥大學·浙江 杭州 310000；2中國科學院大學寧波華美醫(yī)院·浙江 寧波 315010；3中國科學院大學寧波生命與健康產(chǎn)業(yè)研究院·浙江 寧波 315010；4瑞安市人民醫(yī)院消化內(nèi)科·浙江 瑞安 325200)

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，其死亡率較高[1]。目前手術(shù)聯(lián)合放化療仍然是治療胃癌的重要手段，但其容易復(fù)發(fā)，同時會引起一系列并發(fā)癥。轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性胃癌細胞的主要特征，也是導(dǎo)致其高死亡率的重要原因[2]。腫瘤細胞的糖酵解代謝模式為腫瘤的主要特征之一，與腫瘤的多種惡性生物學表征密切相關(guān)[3]。胡桃醌(Juglone)是從胡桃科植物胡桃楸的未成熟外果皮、枝葉和樹皮中分離出來的一種天然化合物，屬于萘醌類化合物[4]。目前已有研究報道，胡桃醌具有抗菌、抗病毒以及抗腫瘤等藥理作用[5]，對人白血病細胞(HL-60)、人肝癌細胞(BEL-7402)和人肺癌細胞(A549)等均有顯著的抑制作用[6-8]。然而，關(guān)于胡桃醌對胃癌細胞的遷移、侵襲和糖酵解的作用及機制尚不清楚。因此，本文以SGC-7901細胞為研究對象，探討胡桃醌對胃癌細胞增殖、侵襲和糖酵解的作用，并進一步闡明其作用機制。

1 材料

1.1 細胞 人胃癌細胞SGC-7901購買于中國科學院上海細胞庫。

1.2 實驗藥物與試劑 胡桃醌(98%)：四川維克奇生物科技有限公司，批號：481-39-0。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Hyclone公司；四甲基亞唑藍(MTT)：美國Sigma公司；細胞周期檢測試劑盒：杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司；葡萄糖、乳酸、ATP檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；BCA蛋白濃度測定試劑盒：上海碧云天公司；抗體(PKM2、GLUT1、LDHA、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH)：美國CST公司。

1.3 儀器 BB150型細胞培養(yǎng)箱：美國Thermo公司；LRH-150型生化培養(yǎng)箱：上海齊欣科學儀器有限公司；guava easyCyte流式細胞儀：美國Minipore公司；ERD-4C熒光倒置顯微鏡：北京世紀科信科學儀器有限公司；CMaxPlus酶標儀：美國MD公司；PowerPac Basic電泳儀：美國BIO-RAD公司；3300 Mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)：中國CLinX公司。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)與分組 SGC-7901細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d換液1次，待80%～90%融合后，以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，取對數(shù)期細胞用于實驗。實驗分組：0 μmol·L-1、1 μmol·L-1、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1。

2.2 MTT實驗檢測細胞存活率 收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞密度為3 000個/孔，每孔100 μL加入到96孔板，置CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞貼壁后加入胡桃醌溶液，其藥液終濃度分別為0、1、5、10、20、40、80、100 μmol·L-1，用藥組和對照組均設(shè)4個復(fù)孔繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入20 μL MTT溶液，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h后每孔加入200 μL三聯(lián)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中作用18 h，用酶標儀在570 nm條件下測定吸光度OD值。重復(fù)實驗3次，以平均值統(tǒng)計結(jié)果，計算各濃度下細胞相對存活率。

2.3 細胞克隆實驗 取對數(shù)生長期的各組細胞，于6孔板培養(yǎng)板中各實驗組接種500～1 000個細胞/孔，按照“2.1”的給藥分組進行實驗，給予藥物處理。每個實驗組設(shè)3個復(fù)孔，置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。經(jīng)常觀察，當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)棄去上清液，加4%多聚甲醛固定細胞。棄固定液后加結(jié)晶紫染色液染2 min，然后用流水洗去染色液，干燥后拍照計數(shù)。最后計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期 將狀態(tài)良好的SGC-7901細胞以6×105/孔傳代于6孔板中，待細胞貼壁之后，按照“2.1”分組給藥，每組設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用PBS洗2遍，用胰酶消化后，用PBS重懸細胞，洗滌離心后立即加入70%的冰乙醇，保存在4 ℃過夜，細胞固定之后，將前一天的細胞懸液在離心機上離心，吸去用于固定的乙醇，再用冷的PBS洗滌細胞2 次，除去上清液，加入含有RNase的PI染液，避光室溫染色30 min，流式細胞儀檢測每組細胞中的熒光強度，獨立實驗重復(fù)3次。

2.5 細胞劃痕實驗 用marker筆在6孔板背面，均勻的劃橫線(利用直尺)，約每隔0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔至少穿過3條線。往6 孔板每孔加入約5×105個細胞，培養(yǎng)過夜，待細胞鋪滿整孔，第2天用槍頭比著直尺，盡量垂至于背后的橫線劃痕，用PBS洗細胞3次，棄去劃下的細胞，加入無血清培養(yǎng)基，根據(jù)分組情況調(diào)整藥物濃度。放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0 h、24 h取樣，拍照。

2.6 細胞侵襲實驗 將無血清培養(yǎng)基500 μL，水化基底膜10 min，上室加入200 μL濃度為2×104個/mL的細胞懸液，下室加入含藥物的無血清培養(yǎng)基，將細胞置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。從培養(yǎng)箱中取出小室，棄去上室液體，用甲醇固定5 min，PBS洗3次，用蘇木素和尹紅各染5 min，自來水沖洗，沖去殘余的染料。用棉簽擦去上室內(nèi)的細胞，Transwell小室反過來底朝上在正置顯微鏡下觀察，拍照，計數(shù)視野內(nèi)的細胞數(shù)，即細胞從小室上室穿越Matrigel膠和聚碳酯膜的細胞侵襲數(shù)。

2.7 ELISA法檢測糖酵解水平 將狀態(tài)良好的SGC-7901細胞以8×105/孔傳代于6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁之后，按照分組的情況加入含有不同濃度胡桃醌的完全培養(yǎng)基，作用24 h后收集細胞進行實驗，8 000 r/min離心10 min，收集上清，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾過液-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照葡萄糖檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒、ATP檢測試劑盒說明書要求檢測細胞中葡萄糖的攝取、乳酸的生成及ATP的水平。

2.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白 將狀態(tài)良好的SGC-7901細胞以8×105/孔傳代于6 cm培養(yǎng)皿中，待細胞貼壁之后，按照分組情況加入含有不同濃度胡桃醌的完全培養(yǎng)基，作用24 h后加入裂解液，冰上裂解30 min后，收集裂解后的細胞液，離心(12 000 r/min)取上清，采用BCA試劑盒測定蛋白濃度后，處理蛋白隨后上樣。用SDS-PAGE分離總蛋白，隨后用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入一抗(PKM2、GLUT1、LDHA、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH)4 ℃過夜，用PBST洗3次，每次在水平搖床上搖5 min，再加入相應(yīng)的二抗，二抗室溫孵育2 h后，用ECL顯色液顯影，在3300 Mini化學發(fā)光成像系統(tǒng)下拍照，記錄實驗結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 胡桃醌對SGC-7901細胞增殖的影響 MTT結(jié)果顯示胡桃醌能夠劑量依賴性地抑制SGC-7901細胞的增殖，IC50為26.33 μmol·L-1，見圖1。與空白對照組相比，各加藥組的細胞克隆能力顯著下降，表現(xiàn)出劑量依賴性，且差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或 0.01)。見表1。

圖1 胡桃醌作用下SGC-7901細胞成活率

表1 胡桃醌作用下SGC-7901細胞克隆數(shù)量

3.2 胡桃醌對SGC-7901細胞周期的影響 與空白對照組比較，不同胡桃醌給藥濃度組細胞S期細胞比例呈現(xiàn)濃度依賴性減少，其中5 μmol·L-1組和10 μmol·L-1組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。與空白對照組比較，不同胡桃醌給藥濃度組細胞G0/G1期細胞比例呈現(xiàn)一定程度增加，其中5 μmol·L-1組和10 μmol·L-1組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2。

注：與0 μmol·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖2 胡桃醌對SGC-7901細胞周期的影響

3.3 胡桃醌對SGC-7901細胞遷移和侵襲的影響 與對照組比較，不同胡桃醌給藥濃度組細胞遷移率和侵襲個數(shù)呈現(xiàn)劑量依賴性下降，其中5 μmol·L-1組和10 μmol·L-1組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或 0.01)。表明胡桃醌能夠有效抑制SGC-7901細胞遷移和侵襲。見圖3，圖4。

注：與0 μmol·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖3 胡桃醌對SGC-7901細胞遷移的影響(細胞劃痕實驗)

注：與0 μmol·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖4 胡桃醌對SGC-7901細胞侵襲的影響(Transwell侵襲實驗)

3.4 胡桃醌對SGC-7901細胞糖酵解的影響 與對照組比較，不同胡桃醌給藥濃度組細胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量、ATP量呈現(xiàn)濃度依賴性下降，其中5 μmol·L-1組和10 μmol·L-1組的乳酸生成量、ATP量差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)，各組葡萄糖攝取量均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)；見表2。與對照組相比，胡桃醌各加藥組能夠劑量依賴性地降低PKM2、GLUT1和LDHA的表達量，其中5 μmol·L-1組和10 μmol·L-1組表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05或0.01)。見圖5。

注：與0 μmol·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖5 胡桃醌對SGC-7901細胞糖酵解相關(guān)蛋白表達的影響

表2 胡桃醌對SGC-7901細胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量、ATP量的影響

3.5 胡桃醌對SGC-7901細胞Akt/mTOR信號通路的影響 與對照組相比，胡桃醌各加藥組的p-Akt和p-mTOR表達水平逐漸降低，Akt與mTOR蛋白表達水平無顯著性變化，統(tǒng)計結(jié)果顯示5 μmol·L-1組和10 μmol·L-1組p-Akt/Akt顯著降低(P<0.05)，10 μmol·L-1組p-mTOR/mTOR顯著降低(P<0.05)。見圖6。

注：與0 μmol·L-1組比較，*P<0.05，**P<0.01圖6 胡桃醌對SGC-7901細胞Akt/mTOR信號通路的影響

4 討論

胡桃楸是我國傳統(tǒng)的治療癌癥的中藥，胡桃醌是從胡桃楸中提取的羥基萘醌類化合物，又名5-羥基-1,4-萘醌，是酶Pin1(肽基脯氨酰異構(gòu)酶)的天然抑制劑和ROS的誘導(dǎo)劑[9-10]。有文獻報道，胡桃醌具有良好的抗腫瘤活性，對各種類型的腫瘤均有一定的抑制作用，為今后研發(fā)抗腫瘤新藥提供了重要線索[4]。已有學者指出胡桃醌能夠通過ROS-p38通路誘導(dǎo)膠質(zhì)母細胞瘤腫瘤干細胞樣細胞凋亡[11]，此外，胡桃醌還能夠通過抑制AKT、ERK、NF-κB信號通路表達和下調(diào)Vimentin、MMP-2、MMP-9表達從而抑制人卵巢癌SKOV3和IOSE80細胞的增殖和侵襲[12]。為了探究胡桃醌對胃癌細胞的發(fā)生發(fā)展的作用，本研究以胃癌SGC-7901細胞為研究對象，從增殖、侵襲和糖酵解的角度探究胡桃醌對胃癌細胞的影響，并進一步闡明其作用機制。本文中MTT實驗和細胞克隆實驗結(jié)果表明，胡桃醌能夠有效地抑制胃癌SGC-7901細胞增殖。另外，細胞周期實驗結(jié)果顯示，用胡桃醌干預(yù)后，SGC-7901細胞在G0/G1期的細胞比例顯著增加，表明胡桃醌能夠阻滯SGC-7901細胞于G0/G1期，進而導(dǎo)致SGC-7901細胞的增殖能力減弱，也預(yù)示著胡桃醌在治療胃癌疾病中存在一定的價值。

細胞劃痕實驗證明，胡桃醌能夠顯著降低SGC-7901細胞的相對遷移率。transwell實驗結(jié)果顯示，胡桃醌干預(yù)后，細胞侵襲的數(shù)量明顯減少；證實胡桃醌能夠顯著降低SGC-7901細胞的遷移、侵襲能力。

惡性胃癌細胞的擴散和侵襲很大程度上基于其對能量代謝的運用，主要為糖酵解反應(yīng)[13]。糖酵解反應(yīng)是維持惡性腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲的關(guān)鍵，腫瘤細胞利用糖酵解反應(yīng)，產(chǎn)生ATP維持線粒體呼吸，同時提供腫瘤細胞生物合成所需的蛋白質(zhì)等，癌細胞對葡萄糖的吸收能力是正常細胞的10～15倍[14]。糖酵解會伴隨乳酸的增加，造成腫瘤微環(huán)境呈酸性，從而導(dǎo)致細胞的不穩(wěn)定性，有利于腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移[15]，因此，腫瘤細胞的葡萄糖攝取量、乳酸生成量以及ATP水平是反應(yīng)糖酵解效應(yīng)的重要指標。本研究結(jié)果顯示，胡桃醌能夠顯著降低SGC-7901細胞的葡萄糖攝取量、乳酸生成量以及ATP水平。當糖酵解途徑被激活時，二型丙酮酸激酶(PKM2)、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)以及乳酸脫氫酶A(LDHA)等糖酵解途徑關(guān)鍵酶表達會顯著升高[16]。PKM2是細胞葡萄糖代謝的關(guān)鍵限速酶，其參與細胞丙酮酸的生成，同時也能催化二磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為三磷酸腺苷即產(chǎn)生ATP；GLUT1表達水平通常與細胞的糖代謝速率有關(guān)，并且與葡萄糖跨細胞膜轉(zhuǎn)運密切相關(guān)，上調(diào)GLUT1能促進細胞對葡萄糖攝取；LDHA是腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)者，在無氧糖酵解的最后一步發(fā)揮重要作用，腫瘤細胞中LDHA表達上調(diào)，增強糖酵解，促進ATP 和乳酸的產(chǎn)生。本研究結(jié)果顯示，胡桃醌干預(yù)顯著降低了SGC-7901細胞中PKM2、GLUT1和LDHA的表達，從蛋白層面驗證了胡桃醌對SGC-7901細胞糖酵解的抑制作用。

AKT/mTOR信號傳導(dǎo)通路具有抑制細胞凋亡、加快細胞周期運行、促進血管形成、促進腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移等功能，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[17]。有研究顯示AKT/mTOR信號通路與惡性腫瘤的糖酵解水平有關(guān)[18-19]。本研究結(jié)果顯示，胡桃醌能夠有效降低SGC-7901細胞中Akt和mTOR的磷酸化水平，表明胡桃醌能夠抑制胃癌細胞AKT/mTOR信號通路的活性。

綜上所述，本研究結(jié)果證明胡桃醌能夠通過調(diào)節(jié)AKT/mTOR信號通路，抑制胃癌細胞增殖、侵襲和糖酵解，而胡桃醌的抗胃癌作用所涉及的其他機制仍需要更深入的研究。