楊娟，羅瑋倩，何曼源

1(嶺南師范學院 食品科學與工程學院，廣東 湛江，524048)2(華南理工大學 食品科學與工程學院，廣東 廣州，510641)

大豆分離蛋白(soy protein isolate，SPI)聚集體結(jié)構(gòu)無序，二硫鍵含量低[1]，其制備的凝膠類產(chǎn)品難以產(chǎn)生富有彈性和韌性的口感質(zhì)構(gòu)。蛋清蛋白(egg albumin，EA)二硫鍵含量豐富，可作為SPI熱致凝膠形成過程中游離巰基的供體[2]。本團隊前期已經(jīng)通過機械性能、持水力、微觀形貌等指標對二者形成的復合凝膠進行了研究，分析了影響復合凝膠形成的幾個內(nèi)部因素。但不同外部條件的加入，可使復合體系二硫鍵的形成產(chǎn)生新變化[3]，目前該類研究報道有限?；诙喾N手段可以影響蛋白質(zhì)的物理化學特性和功能特性，因此探索不同的還原劑、離子強度、多糖、熱處理等方式對每種蛋白質(zhì)在最終網(wǎng)絡(luò)中的貢獻，進而揭示誘導凝膠二硫鍵形成的因素并闡明其對復合凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)特性的影響具有一定意義。

本文基于以上思路，通過添加還原劑NaHSO3和Na2SO3、鹽離子NaCl、多糖刺槐豆膠和結(jié)冷膠以及進行不同的熱處理程序來摸索能夠從外部影響大豆蛋白/蛋清蛋白(SPI+EA)復合凝膠性能的因素，分析不同條件下單一SPI體系和SPI+EA復合體系凝膠的狀態(tài)，并用巰基含量的變化研究熱處理對EA的影響，以進一步闡明蛋白質(zhì)在不同加工條件下的聚集機制[4-5]，從而為選擇性混合SPI與EA的進一步實驗提供思路和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

EA，Sigma公司；低溫脫脂大豆粕，山東御馨生物科技公司；NaCl、Na2SO3、NaHSO3、刺槐豆膠，上海源葉生物科技有限公司；結(jié)冷膠，鄲城財鑫糖業(yè)有限責任公司；其他試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CR22G高速冷凍離心機，日本Hitachi公司；Alpha-4冷凍干燥機，德國Christ公司；RW 20頂置式攪拌器，德國IKA公司；T25分散均質(zhì)機，德國IKA公司；Zeiss EVO18臺式掃描電子顯微鏡，德國Carl Zeiss；Genesys 10 s分光光度計，美國Therom Fisher公司；5943萬能材料試驗機，美國INSTRON公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 還原劑濃度及種類

配制質(zhì)量分數(shù)15%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1]10 mL于小燒杯，加入適量的去離子水和1 mol/L的NaHSO3、Na2SO3溶液使其最終濃度分別為1、5、10、50、100、200 mmol/L，SPI+EA復合溶液濃度為10%(質(zhì)量分數(shù))。測定成膠性、持水性(water-holding capacity，WHC)并觀察微觀結(jié)構(gòu)[2]。

1.3.2 離子強度

配制質(zhì)量分數(shù)15%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1] 10 mL于小燒杯，加入適量的去離子水和2 mol/L NaCl溶液使其最終濃度分別為10、20、50、100、200、500 mmol/L，SPI+EA復合溶液濃度為10%(質(zhì)量分數(shù))。測定成膠性、持水性并觀察微觀結(jié)構(gòu)[2]。

1.3.3 熱處理程序

配制質(zhì)量分數(shù)10%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1]，移取8 mL于10 mL小燒杯并調(diào)pH 5.5，置于95 ℃水浴5、10、15、30、45 min，冷卻至室溫觀察和測定成膠性、持水性并觀察微觀結(jié)構(gòu)[2]。

1.3.4 多糖種類

配制質(zhì)量分數(shù)15%質(zhì)量分數(shù)的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1] 10 mL于小燒杯，加入適量的去離子水和質(zhì)量分數(shù)0.9%的刺槐豆膠、結(jié)冷膠溶液，使刺槐豆膠、結(jié)冷膠溶液最終質(zhì)量分數(shù)分別為0.015%、0.03%、0.06%、0.15%、0.3%，SPI+EA復合溶液為10%(質(zhì)量分數(shù))。測定成膠性、持水性并觀察微觀結(jié)構(gòu)[2]。

1.3.5 還原劑、鹽離子及多糖復合體系

將1 mol/L NaHSO3溶液、2 mol/L NaCl溶液、質(zhì)量分數(shù)為0.9%的結(jié)冷膠溶液及適量去離子水加入了質(zhì)量分數(shù)15%的SPI+EA復合溶液[V(SPI)∶V(EA)=4∶1]中，使3種溶液體系中各自保持NaHSO3溶液1 mmol/L、NaCl溶液100 mmol/L和結(jié)冷膠溶液0.15%，考察復合影響。另設(shè)對照組質(zhì)量分數(shù)質(zhì)量分數(shù)10%純SPI溶液和質(zhì)量分數(shù)10% SPI+EA復合溶液。測定成膠性、持水性并觀察微觀結(jié)構(gòu)[2]。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原劑濃度及種類

加入不同濃度和種類還原劑加熱后所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖1。試驗條件下，加入NaHSO3溶液的凝膠硬度隨著其加入濃度的增加，呈短暫升高后下降趨勢，但加入了Na2SO3溶液的凝膠硬度隨著其加入濃度的增加而逐漸下降，趨勢明顯，在同種濃度下，加入NaHSO3溶液的凝膠硬度比加入了Na2SO3溶液的凝膠硬度更高。同濃度的Na2SO3比NaHSO3對凝膠結(jié)構(gòu)的破壞程度更大。該作用推斷為還原劑具有能夠減弱蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵的形成、降低蛋白質(zhì)凝膠性的作用, 進而降低蛋白質(zhì)分子形成穩(wěn)定的膠體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu), 使產(chǎn)品更易于分散有關(guān)[6]。加入NaHSO3或者Na2SO3的復合凝膠的持水性較高但無特定的趨勢。在濃度相同時，加入NaHSO3比加入Na2SO3對體系持水性影響更具優(yōu)勢。試驗條件范圍內(nèi)，凝膠的硬度與持水性無明顯關(guān)系。加入不同濃度和種類還原劑的SPI+EA凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖2所示。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-1 mmol/L NaHSO3；b-1 mmol/L Na2SO3；c-5 mmol/L NaHSO3；d-5 mmol/L Na2SO3；e-10 mmol/L NaHSO3；f-10 mmol/L Na2SO3；g-50 mmol/L NaHSO3；h-50 mmol/L Na2SO3；i-100 mmol/L NaHSO3；j-100 mmol/L Na2SO3

隨著還原劑濃度的增加，凝膠微觀結(jié)構(gòu)未聯(lián)結(jié)的粒子數(shù)增多，導致凝膠結(jié)構(gòu)松散，硬度低以及易變形(200 mmol/L還原劑形成的凝膠結(jié)構(gòu)太過松軟，無法切片固定)。加入Na2SO3后樣品網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更不清晰，因而其機械強度降低、硬度下降，微結(jié)構(gòu)呈疏松狀。低濃度的NaHSO3的加入會使得凝膠硬度增強，然后隨著其濃度的升高凝膠硬度逐漸下降，微結(jié)構(gòu)漸呈疏松狀。

2.2 離子強度

10%～15%的SPI+EA加入不同濃度鹽溶液后加熱后所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖3。鹽濃度10～100 mmol/L內(nèi)，復合凝膠的結(jié)構(gòu)和質(zhì)地表現(xiàn)為緊致，形態(tài)無差別，鹽離子濃度≥200 mmol/L后凝膠逐漸松軟、硬度明顯降低。500 mmol/L NaCl溶液的凝膠體系無法形成直立圓柱體。數(shù)據(jù)揭示，試驗條件下鹽濃度提高，對凝膠的質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生先正后負的影響[7-9]。鹽濃度10～100 mmol/L內(nèi)，凝膠硬度隨濃度增加，表明鹽溶液中和了蛋白質(zhì)表面的電荷，蛋白質(zhì)分子間相互吸引作用增強，分子迅速聚集形成硬的凝膠。鹽離子濃度500 mmol/L后，蛋白質(zhì)出現(xiàn)鹽溶現(xiàn)象，凝膠強度也出現(xiàn)下降[7-9]。數(shù)據(jù)表明，凝膠的持水性整體改變不明顯。加入不同濃度鹽溶液的SPI+EA凝膠微觀結(jié)構(gòu)見圖4。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-10 mmol/L；b-20 mmol/L；c- 50 mmol/L；d-100 mmol/L；e-200 mmol/L；f-500 mmol/L

凝膠微觀結(jié)構(gòu)隨鹽濃度增加從疏松過渡為致密，未聯(lián)結(jié)的粒子數(shù)減少，凝膠微觀結(jié)構(gòu)有很大改善。其他樣品顆粒聚集形成網(wǎng)絡(luò)，鹽濃度為500 mmol/L的凝膠結(jié)構(gòu)柱網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)消失，蛋白形成一片狀，導致其凝膠強度下降，持水性提高。因此，低濃度的鹽離子的加入可以增加凝膠的硬度，一定程度提高凝膠持水性，但濃度較高時將又降低凝膠硬度且提高持水性[7-9]。

2.3 熱處理程序

10%～15%的SPI+EA經(jīng)過不同熱處理程序后加熱所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖如圖5所示。試驗條件下，蛋白有更多機會及充足時間打開原有二硫鍵并生成更多的二硫鍵，隨加熱時間延長凝膠硬度和持水性逐漸升高，凝膠微觀結(jié)構(gòu)未聯(lián)結(jié)的顆粒趨于減少，緊致性稍有增加。持水性和微觀結(jié)構(gòu)都組間差別不明顯。加熱時間對凝膠持水性和微觀結(jié)構(gòu)的影響并非主要因素[10-12]。經(jīng)過不同熱處理程序后加熱所形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)見圖6。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-加熱5 min；b-加熱10 min；c-加熱15 min；d-加熱30 min；e-加熱45 min

2.4 不同的多糖

10%～15%的SPI+EA加入不同濃度和種類多糖后所形成的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖7。在多糖濃度0.015%～0.3%(質(zhì)量分數(shù))內(nèi)，隨著刺槐豆膠濃度升高，凝膠硬度增加且結(jié)構(gòu)趨于完善緊致；隨結(jié)冷膠的濃度的上升，凝膠形成的孔隙增加且影響凝膠的硬度，形態(tài)不再良好完整。這與文獻報道的濃度對結(jié)冷膠形成的凝膠的質(zhì)構(gòu)影響較大相一致[13]。加結(jié)冷膠溶液的體系相比于加入刺槐豆膠溶液的體系的持水性能更具優(yōu)勢，0.3%時結(jié)冷膠體系的持水性達到了74.8%。當刺槐豆膠和結(jié)冷膠量少的時候，蛋白部分空間被擠，但在整個體系占主導地位，使蛋白網(wǎng)絡(luò)的密度反而增加，導致了復合凝膠的強度和持水性增加[14-15]。但是當結(jié)冷膠濃度較高時，蛋白和多糖的關(guān)系相反，多糖占主導地位，使蛋白的網(wǎng)絡(luò)不連續(xù)，凝膠強度變?nèi)酰w系水分含量上升[14-15]。加入不同濃度和種類多糖后所形成的凝膠微觀結(jié)構(gòu)見圖8。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-0.015%刺槐豆膠；b-0.015%結(jié)冷膠；c-0.03%刺槐豆膠；d-0.03%結(jié)冷膠；e-0.06刺槐豆膠；f-0.06%刺槐豆膠；g-0.15%結(jié)冷膠；h-0.15%刺槐豆膠；i-0.3%結(jié)冷膠；j-0.3%刺槐豆膠

隨著多糖濃度的增加，微觀結(jié)構(gòu)從疏松過渡為致密，未聯(lián)結(jié)的粒子數(shù)減少，形成片狀[9]。相同濃度下，加入結(jié)冷膠比加入刺槐豆膠形成的凝膠結(jié)構(gòu)更致密、硬度相對較高，但高濃度結(jié)冷膠會導致形成的凝膠內(nèi)部孔隙較多并降低其硬度。

2.5 還原劑、鹽離子及多糖復合體系

10%～15%的SPI+EA單獨/復合加入了1 mmol/L NaHSO3、 100 mmol/L NaCl、 0.15%結(jié)冷膠的凝膠硬度、持水性和實物圖見圖9。純10%(質(zhì)量分數(shù))SPI 形成的凝膠結(jié)構(gòu)最疏松、硬度最低，SPI+EA復合凝膠結(jié)構(gòu)明顯變得完整緊致、硬度明顯提高，100 mmol/L NaCl提升復合體系的硬度優(yōu)于1 mmol/L NaHSO3，質(zhì)量分數(shù)0.15%結(jié)冷膠能夠顯著提升復合體系的硬度。在同時加入了1 mmol/L NaHSO3、100 mmol/L NaCl和0.15%結(jié)冷膠的混合組中，SPI+EA復合凝膠體系的硬度提高效果最好，其持水性相比于未添加的原體系改變良好[9]。單獨/復合加入了不同濃度的還原劑、鹽和多糖的凝膠微觀結(jié)構(gòu)見圖10。

a-凝膠硬度；b-持水性；c-實物圖

a-10% SPI；b-10% SPI+EA；c-1 mmol/L NaHSO3；d-100 mmol/L NaCl；e-0.15%結(jié)冷膠；f-NaHSO3+NaCl+結(jié)冷膠

單獨/混合加入NaHSO3、NaCl、結(jié)冷膠的復合體系的微觀結(jié)構(gòu)相比與純SPI或SPI+EA復合體系更加致密，未聯(lián)結(jié)的顆粒數(shù)減少，因素的作用疊加使多條件復合凝膠的硬度達到最高，顯著增加凝膠的持水性。

二硫鍵的形成對復合體系成膠性能的影響，如表1所示。

表1 游離巰基、總巰基及二硫鍵含量[14-16]

從二硫鍵含量可知，SPI溶液中的二硫鍵含量較少，EA的加入可以提高復合體系中二硫鍵的含量，在還原劑低濃度時復合凝膠內(nèi)二硫鍵的含量增加甚微。加入NaCl和結(jié)冷膠會顯著增加復合體系中二硫鍵的含量，從而導致隨著加入溶液濃度的增加，凝膠強度逐漸增強的現(xiàn)象。在同時添加了NaHSO3、NaCl和結(jié)冷膠的體系中，二硫鍵的含量顯著增加。

3 結(jié)論與討論

低還原劑濃度利于復合凝膠蛋白網(wǎng)絡(luò)增加，低濃度還原劑與游離巰基形成氧化還原對，或是打開了一些原有分子內(nèi)的二硫鍵，最終形成了更強的網(wǎng)絡(luò)。而還原劑濃度較高時，新形成的二硫鍵被打斷，網(wǎng)絡(luò)得不到增強，反而減弱了凝膠強度，但持水性得到了增加[5]。蛋白分子表面有親水、帶電基團，提供分子間的斥力，提高體系的離子強度將該作用屏蔽或削弱，聚集程度提高，最終凝膠強度增加。當鹽濃度增加到一定程度時，蛋白質(zhì)出現(xiàn)鹽溶現(xiàn)象，凝膠強度也出現(xiàn)下降，但鹽溶時持水性會顯著提高[7-9]。熱處理時間短時，諸多促使凝膠形成的相互作用都沒生成，隨時間延長，蛋白有更多機會及充足時間打開原有二硫鍵并生成更多的二硫鍵，凝膠強度和持水性也隨之提高。添加多糖目的為通過微觀相分離的辦法增加凝膠的強度[17]。加入鹽離子和結(jié)冷膠都會增加復合凝膠中二硫鍵的含量，還原劑的影響并不明顯，在多條件復合的條件下可以明顯獲得最佳硬度和持水性的凝膠[14-15]。