劉芮芮，史晶亮，黃渝嵐，羅義,2,*

1.南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,環(huán)境污染過程與基準(zhǔn)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300350

2.南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院,污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210093

幾十年來，抗菌藥物已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。但是由于人們對這類藥物的長期使用，加速了其對耐藥細(xì)菌的選擇和傳播，致使抗菌藥物療效降低，甚至無效，對全球公共衛(wèi)生構(gòu)成了極大的威脅。耐藥細(xì)菌的廣泛傳播不僅導(dǎo)致疾病治療周期延長，死亡率增加，也會對國民經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生負(fù)面影響[1]。細(xì)菌對抗生素的適應(yīng)性進(jìn)化，導(dǎo)致抗生素的研發(fā)已經(jīng)到了瓶頸期，新型抗生素的研發(fā)速度甚至趕不上細(xì)菌產(chǎn)生耐藥的速度。因此，尋找一些新的抗菌藥物來取代無效的抗菌藥物成為迫切之舉。蜂蜜作為一種天然抗菌物質(zhì)，在抗生素出現(xiàn)之前就已經(jīng)被用來治療傷口和局部感染。如漢代時(shí)期在《神農(nóng)本草經(jīng)》中將蜂蜜列為藥中上品，常用來治療燒傷、慢性傷口和皮膚潰瘍等[2]。

蜂蜜作為一種天然保健食品，是蜜蜂采集植物的花蜜等分泌物后，由工蜂在自身分泌物下充分混合釀造至成熟，進(jìn)而儲存在巢脾里的甜物質(zhì)[3]。蜜蜂可以從一種或多種植物中采集花蜜來釀造蜂蜜，因此蜂蜜可以分為單花和雜花蜂蜜[4]。蜂蜜是一種成分復(fù)雜的物質(zhì)，包含200多種不同的成分，如糖、水、有機(jī)酸、礦物質(zhì)、酶、蛋白質(zhì)、維生素、灰分、多酚化合物和植物衍生物等[4-5]。近年來蜂蜜抑菌和抗氧化特性被廣泛認(rèn)可，蜂蜜中的多酚類化合物、過氧化氫、丙酮醛、類黃酮和蜜蜂抗菌肽被認(rèn)為是其抑菌活性的關(guān)鍵成分[6-7]。而蜂蜜的成分、顏色和風(fēng)味因植物來源、氣候和地理位置的不同而不同，其中植物來源對蜂蜜的抗氧化活性影響最大[6]。多項(xiàng)研究表明蜂蜜可以對抗多種耐藥細(xì)菌或者可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)菌對抗生素的抗性[8-23]。因此，蜂蜜在用于臨床治療緩解多重耐藥菌問題上表現(xiàn)出了巨大的潛力。

1 蜂蜜作為抗感染藥物的早期應(yīng)用(Early application of honey as an anti-infective drug)

野生蜂蜜的收集可以追溯到1萬年前，在公元前7 000年左右的壁畫中就描繪了當(dāng)時(shí)人們采集蜂蜜的情景[4]。由于蜂蜜具有香甜的味道，古埃及、古中國、古希臘、古羅馬和古印度的人們以蜂蜜為食[4]。而且早在公元前2 400年，埃及就已形成了養(yǎng)蜂技術(shù)，并且已經(jīng)把蜂蜜作為天然的食物來源和食品添加劑[24]。蜂蜜作為藥物使用也有數(shù)千年的歷史記載[25]。古時(shí)候，埃及人、中國人、羅馬尼亞人和亞述人將蜂蜜作為治療腸道感染和促進(jìn)傷口愈合的藥物[7]。蜂蜜在不同時(shí)期，不同文化中有著不同的用途。在阿拉伯和印度醫(yī)學(xué)家的古代醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中記錄了蜂蜜對一些疾病的療效[4]，古埃及人用蜂蜜作為局部藥膏、傷口敷料和防腐物質(zhì)，古希臘人用其治療痛風(fēng)、疼痛、發(fā)燒并用于促進(jìn)傷口愈合[26]，并且在第二次世界大戰(zhàn)期間，戰(zhàn)地護(hù)士使用蜂蜜治療傷員的傷口[27]。

蜂蜜在治療表面?zhèn)?、燒傷和炎癥方面應(yīng)用頗多，后來一些蜂蜜逐漸發(fā)展成為醫(yī)用級蜂蜜。1982年首次經(jīng)研究證實(shí)蜂蜜具有抑菌活性[7]。隨之經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)蜂蜜抑菌具有廣譜性，它可以同時(shí)抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，如大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃葡萄球菌和枯草芽孢桿菌等[28-34]。1999年，蜂蜜首次在澳大利亞注冊為外用藥物制劑，從那以后，一系列基于蜂蜜的產(chǎn)品開始上市，包括無菌麥盧卡蜂蜜軟膏和含有蜂蜜的敷料，但是在很大程度上，蜂蜜仍然沒有得到廣泛的應(yīng)用，僅僅是在其他治療方法失敗后而采用的替代方法[27]。

2 抗生素的發(fā)明(Antibiotic invention)

抗生素主要是由細(xì)菌、霉菌或其他微生物產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物或人工合成的化合物。亞歷山大·弗萊明(Alexander Fleming)、霍華德·弗洛里(Howard Florey)和恩斯特·錢恩(Ernst Chain)3人發(fā)現(xiàn)了人類歷史上第一種廣譜抗生素——青霉素，并于1945年獲得了諾貝爾獎[35]。1943年10月19日艾伯特·沙茨成功從灰鏈霉菌中提取出了可以治愈肺結(jié)核病的“鏈霉素”，并于1944年成功用于臨床[36]。以此為起點(diǎn)科學(xué)家們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了四環(huán)類抗生素、氨基糖苷類抗生素、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和安莎類抗生素等多種抗生素。由此，抗生素的發(fā)展進(jìn)入了黃金時(shí)代。青霉素和鏈霉素成為人類進(jìn)入抗生素時(shí)代的先鋒，它們在肺炎、腦膜炎和結(jié)核等常見細(xì)菌性疾病的治療中，發(fā)揮了重要的作用。抗生素的發(fā)明是人類醫(yī)學(xué)史上最偉大的成就之一。但隨著抗生素的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用，使人們對天然抗菌療法的興趣急劇下降，蜂蜜也失去了其在治療創(chuàng)傷感染中的先鋒地位。

3 抗生素耐藥性問題(Antibiotic resistance issues)

抗生素的問世在控制人類感染性疾病中發(fā)揮了重要的作用。但隨著抗生素應(yīng)用時(shí)間的延長，有研究發(fā)現(xiàn)相應(yīng)劑量的抗生素卻達(dá)不到應(yīng)有的療效[37-38]。據(jù)報(bào)道稱起初青霉素對肺炎球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)值為0.001～0.005 mg·L-1[37]，但于1965年檢測出青霉素對該菌的MIC值達(dá)到0.1 mg·L-1[38]。這說明隨著青霉素應(yīng)用時(shí)間的延長，肺炎球菌對青霉素逐漸產(chǎn)生了抗性。而出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因之一在于人們對抗生素的濫用。美國疾病控制與防范中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)發(fā)現(xiàn)了20種具有耐藥性的細(xì)菌菌株，并證明了它們與抗生素的過度使用有直接的關(guān)系[37]。這一情況在我國更為嚴(yán)重。中國原衛(wèi)生部在2011年的報(bào)告中指出，中國醫(yī)院對患者使用抗生素的頻率高達(dá)70%～80%，比歐美等國家高46%～55%，但是其中用于預(yù)防感染的占比卻高達(dá)40%，而在這40%中有1/3以上無需使用抗生素，因此造成抗生素的濫用[39]。除了上述情況，在養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中也存在抗生素濫用的現(xiàn)象。據(jù)報(bào)道稱美國在2000年共消耗16 200 t抗生素，其中有70%用于獸藥，抗生素長期過度使用，已經(jīng)在養(yǎng)殖動物腸道內(nèi)誘導(dǎo)出攜帶抗性基因(antibiotics resistance genes,ARGs)的菌株，這也是環(huán)境中抗生素抗性基因的重要來源之一[40]。耐藥菌的出現(xiàn)使患者的治療變得困難、昂貴甚至無法治愈，導(dǎo)致感染者死亡率上升。美國一篇報(bào)道稱感染大腸桿菌耐藥株患者的治療費(fèi)用要比感染敏感株的多38 121美元[41]，因此不少患者由于無法承擔(dān)高效抗生素的費(fèi)用而去世。世界衛(wèi)生組織報(bào)告稱，2012年全球估計(jì)有17萬人死于多重耐藥菌引起的肺結(jié)核[1]，在2016年的報(bào)道中更是提出如果不采取相應(yīng)的措施，到2050年，抗生素耐藥每年將導(dǎo)致1 000萬人死亡[42]。除此之外，抗生素耐藥問題也嚴(yán)重影響了全球經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定，世界銀行指出，到2050年每年因抗生素耐藥問題產(chǎn)生的全球經(jīng)濟(jì)損失接近于2008年的全球金融危機(jī)，可能導(dǎo)致全球年度GDP下降5%，使多達(dá)2 800萬人陷入貧困[43]。面對這一嚴(yán)峻情況，世界衛(wèi)生組織于2014年發(fā)布首份全球抗生素耐藥報(bào)告，提出將抗菌素耐藥(antimicrobial resistance,AMR)作為全球抗藥性研究的重點(diǎn)之一[1]。

自然界中存在的細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性是一種自然現(xiàn)象，而抗生素的過度或不當(dāng)使用加速了細(xì)菌耐藥的發(fā)生，通過藥物壓力的選擇，那些獲得抗生素耐藥特征的細(xì)菌相比于易感細(xì)菌將更容易在環(huán)境中被保留下來[44]。不僅如此，耐藥菌可以通過水平轉(zhuǎn)移基因來傳播抗性基因，從而增加了致病菌獲得耐藥性的機(jī)會[45]。致病菌獲得性耐藥為臨床抗生素的治療帶來了巨大挑戰(zhàn)。隨著耐藥菌的流行和暴發(fā)，特別是多重耐藥菌(multi-drug resistant bacteria,MDR)的傳播，抗擊細(xì)菌耐藥成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。

4 蜂蜜的抑菌作用(Antibacterial effect of honey)

抗生素的成功問世使人們忽視了蜂蜜在抗細(xì)菌感染方面的應(yīng)用。但近幾年隨著抗生素耐藥性問題的不斷涌現(xiàn)，研究人員開始回顧抗生素發(fā)明前的時(shí)代，從而重新激起了對蜂蜜等天然抗菌劑的研究興趣。目前的研究已經(jīng)為蜂蜜的藥用價(jià)值提供了證據(jù)[46-47]，這也促進(jìn)了許多醫(yī)用級蜂蜜產(chǎn)品在臨床上的應(yīng)用。臨床上，采用局部氧療聯(lián)合蜂蜜加諾氟沙星濕敷對糖尿病足有顯著的治愈效果[46]。此外還可以運(yùn)用蜂蜜治療呼吸系統(tǒng)疾病。有研究將蜂蜜與臨床常用鎮(zhèn)咳藥苯海拉明作對比，發(fā)現(xiàn)蜂蜜的治療效果優(yōu)于苯海拉明，能夠治愈兒童的嚴(yán)重感冒[47]。研究顯示，蜂蜜可以對大約60種可引起人體感染的病原菌產(chǎn)生廣譜抑菌活性[4]。多項(xiàng)研究表明麥盧卡蜂蜜可以在體外抑制耐甲氧西林的金黃葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)[48-52]，此外，麥盧卡蜂蜜還對具有高水平固有耐藥和獲得性耐藥的細(xì)小支原體和解脲支原體顯示出抑菌活性[53]。除了對麥盧卡這種醫(yī)用級蜂蜜外，一些研究證實(shí)了普通蜂蜜也具有抑菌活性[18-23,31-34,54-56]。除此之外，蜂蜜被證明能有效緩解與傷口感染相關(guān)的炎癥并促進(jìn)其愈合[57]，特別在外傷抗感染中發(fā)揮了重要的作用，可有效降低一級和二級燒傷的發(fā)病率，并有助于減少康復(fù)所需的時(shí)間[58-59]。如有研究比較了麥盧卡蜂蜜涂層繃帶與銀涂層繃帶在治療惡性傷口方面的效果，發(fā)現(xiàn)蜂蜜涂層繃帶在縮小惡性傷口方面與銀涂層繃帶效果類似[60]。也由此顯示了蜂蜜用作藥物在臨床抗感染治療中發(fā)揮的作用。表1列舉了抗生素發(fā)明前后期不同地區(qū)及不同類型蜂蜜的抗感染應(yīng)用。

表1 抗生素發(fā)明前期和后期蜂蜜的抗感染應(yīng)用Table 1 Anti-infective application of honey before and after the invention of antibiotics

續(xù)表1抗生素發(fā)明后期Post-antibiotic invention非醫(yī)用級Non-medical grade阿根廷Argentina柑橘、雜花蜂蜜Citrus, multifloral honey尼日利亞Nigeria野花、苦葉蜂蜜Wildflower, bitter leaf honey阿爾及利亞Algeria紫云英、桉樹、桃花和雜花蜂蜜Astragalus sinicus, eucalyptus, peach, and multifloral honey加拿大Canada加拿大蜂蜜Canadian honey智利Chile蕪茉蜂蜜Ulmo honey丹麥Denmark石楠、樹莓、油菜、山楂和白三葉草蜂蜜Heather, rasberry, rapeseed, hawthorn, and white clover honey斯洛伐克Slovak蜜露蜂蜜Honeydew honey古巴Cuba牽?；?、紅豆、黑紅樹和圣誕藤蜂蜜Morning glory, singing bean, black mangrove, and Christmas vine honey沙特阿拉伯Saudi ArabiaSider蜂蜜Sider honey中國China蕎麥蜂蜜Buckwheat honey抑制非耐藥菌Inhibition of non-antibiotic resistant bacteria金黃葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌、摩根菌Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Morganella morganii[18]鼠傷寒沙門氏菌、痢疾桿菌、蠟狀芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌Salmonella typhimurium, Shigella dysenteriae, Bacillus cereus, Escherichia coli, Staphylococcus aureus[19]產(chǎn)氣莢膜梭菌、金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis[29]大腸桿菌、枯草芽孢桿菌Escherichia coli, Bacillus subtilis[31]大腸桿菌、銅綠假單胞菌Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa[32]金黃葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa[33]金黃葡萄球菌、銅綠假單胞菌Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa[34]金黃葡萄菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Bacillus subtilis [54]金黃葡萄球菌、化膿鏈球菌、肺炎克雷伯菌、大腸桿菌Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsiella pneumonia, Escherichia coli[55]金黃葡萄菌、銅綠假單胞菌Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa[61]時(shí)期Period蜂蜜級別Honey grade地區(qū)District蜂蜜類型Honey type抗感染應(yīng)用Anti-infection application微生物名稱Microorganism name參考文獻(xiàn)References

續(xù)表1抗生素發(fā)明后期Post-antibiotic invention非醫(yī)用級Non-medical grade西班牙Spain桉樹、鱷梨和栗子蜂蜜Eucalyptus, avocado, and chestnut honey克羅地亞Croatia栗子、槐花、酸橙、油菜和薄荷蜂蜜Chestnut, locust tree, lime tree, rapeseed, and mint honey荷蘭NetherlandsRevamil蜂蜜Revamil honey摩洛哥Morocco芳香和藥用植物蜂蜜Aromatic- and medicinal-plants honey加拿大Canada草木樨藍(lán)莓、蕎麥蜂蜜Sweet clover blueberry, buckwheat honey巴基斯坦Pakistan黑籽、Beri Shain蜂蜜Black seed, Beri Shain honey智利Chile蕪茉蜂蜜Ulmo honey英國蘇格蘭Scotland, UK石楠、高地蜂蜜Heather, highland honey抑制耐藥菌Inhibit antibiotic resistant bacteriaMRSA、MDR-S. pyogenes、MDR-E. coli、MDR-P. aeruginosa[13]MRSA、MDR-P. aeruginosa、MDR-A. baumannii、ESBL-E. coli[14]MRSA、MRSE、ESBL-E. coli、ESBL-P. aeruginosa、ESBL-E. cloacae、ESBL-K. oxytoca、VRE[20]MDR-E. coli、MDR-S. aureus、MDR-Bacillus spp.、MDR-P. aeruginosa[21]MRSA、VRE[22]MRSA[23]MRSA[32]PR-A. calcoaceticus、PR-S. aureus、PR-P. aeruginosa、PR-E. coli[56]

4.1 蜂蜜抑菌的主要成分和影響因素

長期以來，人們認(rèn)為蜂蜜的抑菌作用歸因于其較高的滲透壓(水活度:0.562～0.62)和較低的pH值(3.2～4.5)，高滲環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞脫水致使細(xì)菌無法生長和增殖并且蜂蜜的酸度也低于細(xì)菌的生長適宜值(pH:6.5～7.5)[65]。有研究通過配制與蜂蜜相同濃度的糖水，發(fā)現(xiàn)也具有抑菌和殺菌活性[66]，這說明滲透壓在蜂蜜的抑菌活性中發(fā)揮重要的作用。但有報(bào)道配制了一種與麥盧卡蜂蜜相同pH值和糖含量的人造蜂蜜，發(fā)現(xiàn)與麥盧卡蜂蜜相反的是這種人造蜂蜜并沒有對任何微生物產(chǎn)生抑菌活性[67]。這說明蜂蜜抑菌機(jī)制除了與滲透壓、pH有關(guān)外，其抑菌作用可能還與蜂蜜中的其他成分有關(guān)。蜂蜜中含有多種與抑菌活性相關(guān)的化合物，如過氧化氫、丙酮醛、酚酸、類黃酮和蜜蜂抗菌肽[68]。其中過氧化氫是在蜂蜜成熟期間，蜂蜜中的葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶氧化生成[27]。并且大多數(shù)蜂蜜的抑菌活性與過氧化氫的含量呈劑量效應(yīng)關(guān)系。Brudzynski[31]發(fā)現(xiàn)蜂蜜經(jīng)稀釋后其抑菌活性增強(qiáng)，原因可能是經(jīng)過稀釋后葡萄糖氧化酶更容易與葡萄糖結(jié)合，從而可以連續(xù)產(chǎn)生過氧化氫。此后多項(xiàng)研究也表明，對于大多數(shù)蜂蜜來說，在稀釋倍數(shù)為30%～50%(V∶V)時(shí)可以產(chǎn)生較多的過氧化氫，并且過氧化氫的積累濃度范圍為0.04～4 mmol·L-1[69-73]。目前，有研究評估了過氧化氫對蜂蜜抑菌活性的貢獻(xiàn)，將蜂蜜用過氧化氫酶處理后發(fā)現(xiàn)其抑菌活性顯著降低[74-76]。這表明過氧化氫參與了蜂蜜的抑菌過程。過氧化氫不僅參與蜂蜜的抑菌過程，還有研究發(fā)現(xiàn)其含量與蜂蜜的顏色有關(guān)，通常深色蜂蜜比淺色蜂蜜含有更多的過氧化氫[77]，但還未有研究證實(shí)深色蜂蜜的抑菌效果是否高于淺色蜂蜜。研究發(fā)現(xiàn)過氧化氫的抑菌機(jī)制主要是通過產(chǎn)生羥基自由基來抑制微生物活性，并且天然存在于蜂蜜中的Cu+或Fe2+等離子也可以經(jīng)Fenton反應(yīng)催化過氧化氫降解產(chǎn)生羥基自由基[75]。盡管過氧化氫被認(rèn)為是蜂蜜的主要抑菌成分，但是一些蜂蜜的抑菌活性并不僅僅依賴于過氧化氫，蜂蜜中還包含其他抑菌活性物質(zhì)，這種在含有較少過氧化氫或者在去除過氧化氫后的蜂蜜中觀察到的抑菌活性被定義為非過氧化物活性[68]。非過氧化物活性與多種物質(zhì)有關(guān)，其中就包括丙酮醛[68]。有研究稱丙酮醛的最小抑菌濃度在10～1 000 mg·L-1的范圍內(nèi)[78]，是蜂蜜的另一主要抑菌成分。蜂蜜中的丙酮醛是由二羥基丙酮自發(fā)脫水生成的，而二羥基丙酮在懸鉤子屬(Leptospermumsp.)的花蜜中含量較高[79]。丙酮醛是麥盧卡(Manuka)蜂蜜的主要抑菌活性成分，后來將其稱為獨(dú)特的麥盧卡因子(unique Manuka factor,UMF)[80]，并且麥盧卡蜂蜜中的丙酮醛含量主要取決于二羥基丙酮的含量。起初人們認(rèn)為只有麥盧卡蜂蜜含有丙酮醛，但是經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)一些北歐野花蜂蜜[81]，來自意大利不同植物的單花蜂蜜如桉樹蜜、向日葵蜜和百里香蜜等[82]，芬蘭野花蜂蜜[83]及葡萄牙蜜露蜂蜜[84]中也含有丙酮醛。但是這些蜂蜜中丙酮醛的含量(0.2～166 mg·kg-1)遠(yuǎn)低于麥盧卡蜂蜜(38～1 541 mg·kg-1)[73]。此外，蜂蜜中含有多種酚類化合物，這類生物活性物質(zhì)是植物的次生代謝產(chǎn)物，主要是通過花蜜轉(zhuǎn)移到蜂蜜中[85]。蜂蜜中的酚類化合物主要是酚酸和類黃酮，其在蜂蜜中的含量與其顏色相關(guān)，一般蜂蜜的顏色越黑，多酚和類黃酮的含量越高[27]。這類物質(zhì)的濃度也影響蜂蜜的抑菌能力。Schneider等[86]發(fā)現(xiàn)薰衣草蜂蜜的抑菌活性低于麥盧卡蜂蜜，因?yàn)榕c麥盧卡蜂蜜相比，其多酚和類黃酮的含量較低。在對古巴蜂蜜的研究中發(fā)現(xiàn)，不同蜂蜜中多酚和類黃酮的含量有很大差異，但是這2種物質(zhì)濃度較高的蜂蜜具有更好的抑菌性能[87]。雖然目前已經(jīng)證明了蜂蜜中的酚類物質(zhì)具有抑菌作用，但還需進(jìn)一步研究多酚化合物影響蜂蜜的直接抑菌機(jī)制。除了植物源，蜜蜂分泌物也影響著蜂蜜的抑菌活性。蜜蜂defensin-1是在蜜蜂的血淋巴和咽下腺中發(fā)現(xiàn)的一種抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)[88]，蜜蜂在對蜂蜜進(jìn)行初級加工時(shí)經(jīng)唾液腺將其摻入到蜂蜜中[79]。由于這個(gè)原因，其在不同蜂種釀造的蜂蜜中差異很大[89]。蜜蜂defensin-1對真菌、革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有抑制活性。其中主要對革蘭氏陽性菌起抑制作用，如枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌，但其對多重耐藥菌的抑制作用的研究仍十分有限[90]。

4.2 蜂蜜的抑菌機(jī)理

目前已經(jīng)對蜂蜜的抑菌活性進(jìn)行了大量的研究[14,31,49,66]，但是對蜂蜜抑菌機(jī)理的研究還不完善。由于麥盧卡蜂蜜是最常見的一種醫(yī)用級蜂蜜，因此對其進(jìn)行了多項(xiàng)針對微生物病原體抑制機(jī)理的研究，不僅麥盧卡蜂蜜，其他蜂蜜抑菌機(jī)理的研究近幾年也不斷在開展[51,91-94]。由于蜂蜜成分復(fù)雜，由數(shù)百種化合物組成。因此有人提出蜂蜜有多個(gè)細(xì)胞靶標(biāo)來對抗細(xì)菌[27,51]。也正是由于蜂蜜的這種特性，目前只揭示出了幾種蜂蜜的抑菌機(jī)制，這也在一定程度上限制了蜂蜜作為抑菌劑的大范圍應(yīng)用。迄今報(bào)道的蜂蜜主要抑菌機(jī)理如圖1所示。

4.2.1 改變細(xì)菌的結(jié)構(gòu)和形態(tài)

Henriques等[91]用掃描和透射電子顯微技術(shù)來揭示蜂蜜的抑菌機(jī)理，如在對MRSA研究中發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜不會造成細(xì)胞的裂解。但是之后有研究運(yùn)用原子力顯微鏡和熒光顯微鏡卻得到了與之相反的結(jié)果，經(jīng)麥盧卡蜂蜜處理過的銅綠假單胞菌出現(xiàn)了大面積的結(jié)構(gòu)性損傷，細(xì)胞中出現(xiàn)膜泡，這表明麥盧卡蜂蜜損傷了細(xì)菌細(xì)胞包膜，甚至還會導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡[51]。后來有研究運(yùn)用基因組分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了麥盧卡蜂蜜通過降低細(xì)菌細(xì)胞膜膜蛋白OprF基因的表達(dá)從而引起細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)性損傷[95]。除了麥盧卡蜂蜜，研究還發(fā)現(xiàn)一些普通蜂蜜也會引起細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)與形態(tài)等不同程度的損傷。蕎麥蜂蜜和野花蜂蜜可引起大腸桿菌細(xì)胞壁的破壞，這與蜂蜜的濃度和作用時(shí)間有關(guān)[96]。鱷梨、栗子和野花蜂蜜可以破壞金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的細(xì)胞膜，而且在相似的處理?xiàng)l件下，這3種蜂蜜樣品比麥盧卡蜂蜜更能破壞細(xì)胞膜的完整性[79]。此外，Roberts等[97]的研究表明麥盧卡蜂蜜可以通過抑制銅綠假單胞菌鞭毛基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致了鞭毛細(xì)胞的減少，由于鞭毛對于病原體的建立和產(chǎn)生侵襲性感染至關(guān)重要，因此這一發(fā)現(xiàn)對細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)變化具有重要的影響，說明蜂蜜還可以降低感染細(xì)菌的致病潛力。蜂蜜作用于細(xì)菌時(shí)可以改變其細(xì)胞的生長與形態(tài)，但是當(dāng)不同種類的蜂蜜作用于不同細(xì)菌時(shí)，結(jié)果卻有明顯的差異。Lu等[98]發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜、卡努卡蜂蜜和三葉草蜂蜜對枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的生長和細(xì)胞形態(tài)具有明顯不同的改變。當(dāng)上述細(xì)菌暴露于這些蜂蜜的抑制濃度時(shí)，枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表現(xiàn)出延長的遲滯期，在延長的滯后階段，細(xì)菌細(xì)胞的長度變短，而銅綠假單胞菌細(xì)胞長度卻變長。最近的研究運(yùn)用流式細(xì)胞儀證實(shí)了之前的結(jié)果，確定了處理時(shí)間和蜂蜜濃度是誘導(dǎo)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌細(xì)胞膜損傷的關(guān)鍵因素[99]。

4.2.2 抑制細(xì)菌生物膜的形成

研究表明不同種類的蜂蜜具有抗黏附和抗生物膜特性，而自然界中的許多細(xì)菌都是以生物膜形態(tài)存在的[27]。細(xì)菌生物膜即將細(xì)胞包埋在由胞外多糖、DNA、蛋白質(zhì)和膜囊泡組成的基質(zhì)中，并因此形成了一種特殊抵抗外來壓力的抗性機(jī)制，從而對抗生素產(chǎn)生耐藥性[100]。有研究表明，在生物膜中細(xì)菌對抗生素的抵抗力比游離形態(tài)細(xì)菌細(xì)胞高，這使得它們極難被抑制[79]。因此生物膜也是細(xì)菌抵抗外界脅迫的一種保護(hù)性機(jī)制，最新研究表明4種新西蘭蜂蜜可以抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，并且可顯著消除已經(jīng)建立的生物膜[101]。這很可能是通過非特異性機(jī)制，例如抑制細(xì)菌生長和減少生物膜生物量而形成的[79]。另外，蜂蜜也會顯著降低已生成的生物膜的代謝活性，這可能是因?yàn)榉涿燮茐牧藛蝹€(gè)細(xì)菌細(xì)胞的代謝活性，而且在這個(gè)過程中，蜂蜜也會減少活細(xì)胞的數(shù)量[101-102]。蜂蜜對與生物膜形成和發(fā)育有關(guān)的不同基因表達(dá)也有影響[92]，而且蜂蜜可能通過下調(diào)編碼結(jié)合蛋白的基因及抑制編碼氨基葡萄糖聚合物的表達(dá)來阻止宿主組織的定殖[17,103-104]。

4.2.3 改變細(xì)菌的群體感應(yīng)

群體感應(yīng)是用于協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)細(xì)胞群體行為的細(xì)胞間通信系統(tǒng)。許多細(xì)菌的生理功能，如發(fā)光、毒性、運(yùn)動性、孢子形成和生物膜形成，都受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[105]。由于這個(gè)原因，有人認(rèn)為中斷細(xì)菌群體感應(yīng)可以減輕病原菌的毒力，是治療病原菌所引起感染的一項(xiàng)新選擇[106]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明[92,103,107-108]，與菌群互作機(jī)制相關(guān)的一些基因以及其他毒力基因在暴露于蜂蜜后顯著下調(diào)。另有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)蜂蜜和其他物質(zhì)聯(lián)用時(shí)(如姜黃素)則顯著增強(qiáng)抗群體感應(yīng)活性[93]。鐵載體是在許多病原微生物中通過群體感應(yīng)來調(diào)節(jié)的一組毒力因子，病原菌依靠鐵載體與宿主競爭有效鐵，使其能夠在宿主環(huán)境中增殖[27]。銅綠假單胞菌利用鐵載體綠膿素螯合人體宿主中的鐵，經(jīng)亞致死濃度蜂蜜處理后，該菌顯著減少了鐵載體產(chǎn)生，而綠膿素的產(chǎn)生與群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子PvdQ、LasR有關(guān)[109]。類似地，亞致死濃度的蜂蜜通過降低las和rhl調(diào)節(jié)子及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子MvfR的表達(dá)來削弱銅綠假單胞菌的群體感應(yīng)[107]。除此之外，蜂蜜還可以通過抑制群體感應(yīng)基因(csgBAC)來干擾大腸桿菌O157:H7形成生物膜[110]。這些也證明了蜂蜜可在基因水平上對病原菌毒力因子的表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。

4.2.4 干擾細(xì)菌的代謝

蜂蜜可以干擾許多細(xì)菌的代謝活動。有研究運(yùn)用流式細(xì)胞儀證實(shí)了麥盧卡蜂蜜、鱷梨、栗子和野花蜂蜜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌代謝的影響[99,111]。這可能是因?yàn)辂湵R卡蜂蜜減少了一些與細(xì)菌能量代謝有關(guān)的基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)[103]。但是，有研究表明麥盧卡蜂蜜對細(xì)菌代謝的影響是不可逆的，而其他蜂蜜對部分細(xì)菌的代謝活性會隨著時(shí)間逐漸恢復(fù)，這可能與不同蜂蜜中的化學(xué)成分和蜂蜜的濃度有關(guān)[111]。蜂蜜中可能還存在其他潛在機(jī)制來影響細(xì)菌代謝。在對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌研究中證實(shí)了麥盧卡蜂蜜作為鐵螯合劑的作用，這對于細(xì)菌的代謝和生存起著至關(guān)重要的作用[94,109]。另外，膜電位也是細(xì)菌產(chǎn)生能量的基本過程。蜂蜜會引起膜去極化來阻礙細(xì)菌產(chǎn)生生命活動所需要的能量，進(jìn)而影響細(xì)菌的代謝活動[95,108,111]。

4.2.5 抑制細(xì)菌外排泵活性

多藥外排泵是存在于細(xì)菌細(xì)胞膜上的一類蛋白質(zhì)，通過外排泵系統(tǒng)細(xì)菌可以將進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的抗菌藥物移出細(xì)胞，從而使藥物濃度低于其活性濃度，使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥[112]。這是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要機(jī)制之一。有研究采用流式細(xì)胞儀發(fā)現(xiàn)麥盧卡蜂蜜可以降低大腸桿菌AG100后代菌株的外排泵活性，該菌株暴露于高濃度四環(huán)素時(shí)會表達(dá)多個(gè)外排泵，但麥盧卡蜂蜜可以遵循劑量效應(yīng)來阻止其外排泵的活性[99]。由于抗生素外排依賴于能量，因此他們認(rèn)為蜂蜜抑制細(xì)菌外排泵的活性可能與其破壞細(xì)菌代謝有關(guān)。對此Bouzo等[108]假設(shè)麥盧卡蜂蜜可能是通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性和降低細(xì)菌膜電位來增加細(xì)菌對抗生素的吸收，從而增強(qiáng)了抗生素的抑菌活性。這也證明了麥盧卡蜂蜜可以恢復(fù)一些耐藥菌對抗生素的敏感性。

4.3 蜂蜜作為抗生素替代品的可行性

4.3.1 蜂蜜與抗生素抑菌效果的比較

蜂蜜具有不同程度的抑菌作用，但是蜂蜜的抑菌效果與抗生素相比是怎樣的呢？因此許多研究試圖將蜂蜜與常規(guī)抗生素的活性進(jìn)行比較。Adeleke等[113]利用瓊脂擴(kuò)散法比較了銅綠假單胞菌和大腸桿菌暴露于蜂蜜和慶大霉素中的活性。該實(shí)驗(yàn)將這2種細(xì)菌暴露于未經(jīng)稀釋和用1∶2、1∶4和1∶6比例稀釋的蜂蜜，結(jié)果表明未經(jīng)稀釋的蜂蜜及其1∶2至1∶6的水稀釋液對銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抑制率分別為100%和96.4%；但是慶大霉素以8.0 mg·L-1和4.0 mg·L-1的濃度使用時(shí)通常顯示出較低的抑菌活性。還有研究發(fā)現(xiàn)，與25 000 mg·L-1的四環(huán)素相比，純濃度的蜂蜜可以抑制除大腸桿菌之外的所有被測菌株[114]。

蜂蜜對耐藥菌表現(xiàn)出廣泛的活性。因此有人提出將抗生素與蜂蜜聯(lián)用，并對此進(jìn)行了多項(xiàng)研究[111,115-116]。目前已經(jīng)開發(fā)出了各種抗生素和蜂蜜聯(lián)用組合，并取得了良好的效果。一項(xiàng)研究比較了阿曼不同地區(qū)的30份蜂蜜樣品對金黃色葡萄球菌的抗菌能力，發(fā)現(xiàn)50%的蜂蜜樣品在1 h后對金黃葡萄球菌的抑制率為45%，濃度為4 mg·L-1的慶大霉素對該菌的抑制率為88%，但當(dāng)蜂蜜與慶大霉素聯(lián)用時(shí)對該菌的抑制率大大提高[117]。除了慶大霉素，蜂蜜與其他抗生素的組合也取得了較好的效果。當(dāng)麥盧卡蜂蜜與利福平、四環(huán)素和粘菌素配合使用時(shí)可以增強(qiáng)對銅綠假單胞菌的抑制效果，與四環(huán)素、亞胺培南和莫匹羅星在抑制MRSA時(shí)具有協(xié)同作用[52]。

此外，蜂蜜與抗生素聯(lián)用還可以逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)菌對抗生素的抗性。研究表明麥盧卡蜂蜜和甲氧西林的協(xié)同作用使MRSA重新對甲氧西林敏感，分子分析表明這可能是由于蜂蜜影響了mecR1基因的表達(dá)[115]。這些發(fā)現(xiàn)為蜂蜜在臨床中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，特別是對于慢性感染疾病的治療。但是目前還沒有闡明發(fā)生這種協(xié)同作用的機(jī)制。針對這一問題有人提出至少部分原因是由于蜂蜜的存在增加了羥基自由基的產(chǎn)生，不過還必須考慮其他因素，因?yàn)辂湵R卡蜂蜜中的過氧化物活性對于完全抑制細(xì)菌生長不是必不可少的[118]。然而我們應(yīng)了解并不是所有蜂蜜的抑菌效果都優(yōu)于抗生素。2 000 mg·L-1的環(huán)丙沙星對金黃葡萄球菌、白色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌的抑制效果優(yōu)于濃度為50%(V∶V)的蜂蜜溶液和純蜂蜜[114]。因此，蜂蜜還不能完全替代抗生素，并且我們還需要進(jìn)一步的研究來篩選合適的蜂蜜類型去抑制特定的病原菌?？偟膩碚f，蜂蜜的抑菌活性已經(jīng)得到了證實(shí)，然而，研究人員還未得出蜂蜜抑菌的確切濃度范圍。由此可見，雖然蜂蜜的抑菌效果優(yōu)于部分抗生素，但是蜂蜜單獨(dú)作用以及與其他抗生素聯(lián)用對細(xì)菌特別是對病原菌的抑菌作用機(jī)理還存在許多未知，亟待開展相關(guān)的研究，這對于遏制抗生素耐藥性的發(fā)生和發(fā)展具有重要的意義。

4.3.2 細(xì)菌對蜂蜜的抗性

蜂蜜是具有復(fù)雜成分的天然物質(zhì)，研究表明這是它作為抑菌劑的主要優(yōu)點(diǎn)之一，蜂蜜中的數(shù)百種化合物可能存在多個(gè)細(xì)菌靶標(biāo)，使細(xì)菌難以適應(yīng)它們，因此難以產(chǎn)生抗蜜性[27]。從開始將麥盧卡蜂蜜運(yùn)用到醫(yī)療中截止到目前，還未發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌對麥盧卡蜂蜜產(chǎn)生抗性[119]。這可能是因?yàn)辂湵R卡蜂蜜的組成成分復(fù)雜且相互之間存在協(xié)同作用，給細(xì)菌不同的作用壓力而使其無法產(chǎn)生抗性。

Blair等[63]的研究首次證明了具有耐藥表型的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌持續(xù)暴露于亞致死濃度的麥盧卡蜂蜜時(shí)沒有產(chǎn)生抗蜜性。之后，有研究將不同細(xì)菌的臨床分離株在亞致死濃度的蜂蜜中連續(xù)暴露10 d，結(jié)果表明細(xì)菌不可能在短期的暴露實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生抗蜜性，接著又在28 d中逐步增加蜂蜜濃度培養(yǎng)細(xì)菌菌株來完成體外測定，依然不能篩選出抗蜜的細(xì)菌突變體，這些結(jié)果說明了與抗生素不同的是細(xì)菌很難對亞致死濃度的蜂蜜產(chǎn)生抗性[119]。此外，細(xì)菌對2種不同的抗生素會產(chǎn)生交叉抗性。當(dāng)金黃葡萄球菌持續(xù)暴露于亞致死濃度四環(huán)素時(shí)，該菌對四環(huán)素的抗性較親代高64倍，并且對苯唑西林的抗性提高了32倍，但是當(dāng)該菌暴露于亞致死濃度蜂蜜時(shí)，并沒有顯示出對蜂蜜的交叉抗性[63]。這說明細(xì)菌對蜂蜜產(chǎn)生抗性的可能性極低，并且蜂蜜的使用也不會影響其他抗菌藥物的療效。

4.3.3 研發(fā)的經(jīng)濟(jì)成本

隨著抗生素耐藥性問題日趨嚴(yán)重，新抑菌藥物的研發(fā)迫在眉睫。新合成的抗生素藥物越來越少，截至目前，最后一種全新的抗生素是在20世紀(jì)80年代末研發(fā)的[120]。造成這一現(xiàn)象的原因是開發(fā)新型抗生素并將其推向市場對于制藥公司來說往往無利可圖。于2017年公布的一項(xiàng)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，開發(fā)一種新的靶向抗生素的成本為1.581億美元[121]，然而與高昂的成本相比，制藥公司每年的收入?yún)s為4 600萬美元[121]。因此許多大型制藥公司退出了該市場。抗生素高昂的研發(fā)成本使得開發(fā)新型抗生素這一舉措不再是長久之計(jì)，因此當(dāng)前可以著眼于抗生素發(fā)明前期一些成本低廉且有效的抑菌化合物。蜂蜜作為一種古老的抑菌物質(zhì)，在抑菌藥物的開發(fā)中具有巨大的研發(fā)潛力。有研究強(qiáng)調(diào)蜂蜜敷料不僅可具有比普通敷料高2倍的治愈率及較好的治療效果，更重要的是所用蜂蜜成本低廉[122]。除此之外，目前藥用蜂蜜的開發(fā)已經(jīng)帶來了一些經(jīng)濟(jì)效益，2010年美國《金融評論》估計(jì)蜂蜜應(yīng)用于傷口治療的市場價(jià)值為14萬億美元[123]。因此在這個(gè)預(yù)算限制和醫(yī)療資源優(yōu)化的時(shí)代，研究和開發(fā)有效且低廉的治療方法是大勢所趨。因此在理論上，將成本低廉的蜂蜜納入到對抗多重耐藥菌的新型抗生素研發(fā)中是可行的。

5 展望(Prospect)

抗生素耐藥菌的出現(xiàn)及其傳播已對全球公共衛(wèi)生安全構(gòu)成了極大的威脅，是全球急需解決的健康問題之一。蜂蜜不僅具有高營養(yǎng)的特點(diǎn)，更具備抑菌活性，與開發(fā)新型抗生素相比，開發(fā)蜂蜜用作抑菌藥物的潛力巨大，對于遏制日益嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥甚至超級細(xì)菌的感染將發(fā)揮更大作用。未來，還需圍繞以下幾方面重點(diǎn)開展研究。

(1)蜂蜜體內(nèi)抑菌活性的研究。目前，蜂蜜的體外抑菌性能已經(jīng)得到了大量的實(shí)驗(yàn)室研究證實(shí)，還需開展大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證蜂蜜在體內(nèi)與體外的抑菌活性是否相一致。

(2)蜂蜜抑菌機(jī)制的研究。蜂蜜的成分復(fù)雜，各成分的抑菌效果及其相互的作用機(jī)制還不清楚，還需進(jìn)一步的研究闡明其抑菌作用機(jī)制。

(3)作為藥用蜂蜜的健康風(fēng)險(xiǎn)評估研究。蜂蜜中可能存在一些致病菌的孢子并且可能受到如除草劑、殺蟲劑、重金屬和抗生素等化學(xué)品和農(nóng)藥的污染。因此需要加強(qiáng)蜂蜜作為藥用的健康風(fēng)險(xiǎn)評估研究，制定相應(yīng)的蜂蜜藥用標(biāo)準(zhǔn)。

(4)中國商品蜂蜜抑菌作用的研究。中國作為蜂蜜生產(chǎn)和出口大國，目前有關(guān)中國蜂蜜抑菌性能的數(shù)據(jù)還相當(dāng)有限，還需進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)研究，開發(fā)出我國具有獨(dú)立自主知識產(chǎn)權(quán)的蜂蜜抑菌劑。