姚正穎，侯北偉，錢 月，金敬紅，林群英，胡衛(wèi)成，范晶玉，孫力軍*

（1.中華全國供銷合作總社南京野生植物綜合利用研究所，江蘇 南京 211000；2.淮陰師范學(xué)院，江蘇 淮安 223300；3.南京普康和瑞生物科技有限公司，江蘇 南京 211106）

桑（Morus albaL.）為?？粕僦参铮?］。桑葉是我國藥食同源目錄原料，具有很高的藥用及食用價值。研究表明，桑葉含多糖、1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）、黃 酮、γ-氨 基 丁 酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）等多種次生代謝組分，具有抗癌、降血脂、降血糖以及降血壓等生理活性［3-5］。我國桑葉資源十分豐富，桑園面積達(dá)9.5×105hm2，種桑養(yǎng)蠶農(nóng)戶約2×107戶，桑葉年產(chǎn)超1.5×107t［6］。不同季節(jié)采收的桑葉有著不同用途，春、夏、秋季采收用以飼蠶和食品加工，霜降之后采收桑葉用以入藥。桑葉雖然高產(chǎn)，但存在產(chǎn)量過剩、利用率較低的問題，造成了一定的資源浪費(fèi)。現(xiàn)有研究主要以桑葉的完整葉片為研究對象，對其活性成分進(jìn)行檢測分析，而對桑葉葉肉部分和葉脈部分中活性物質(zhì)分布情況的研究報道較少。此外，蠶養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的桑葉剩余物主要為葉脈部分，這部分廢棄物資源的利用價值值得深入探討。

因此，本研究對春桑葉和霜桑葉葉片和葉脈部位的主要次生代謝成分含量進(jìn)行檢測和比較研究，以期為桑葉資源的高效利用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮桑葉于2019年春季4月30日、秋季霜降后11月19日采摘自江蘇省海安市桑園。DNJ對照品（HPLC＞98%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；GABA，BBI Life Scicences；芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）、β-谷甾醇，上海源葉生物科技有限公司；甲醇、乙腈（色譜純），Sigma-Aldrich；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；高速臺式離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Agilent 1200高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 桑葉水提取物制備

桑葉于65℃干燥至恒重，模彷蠶食效果，將桑葉分為蠶食部分和以葉脈為主的剩余部分，粉碎后過60目篩。取粉末0.8 g，加入24 mL蒸餾水，在90℃下浸提2 h，抽濾，濾渣再用熱水浸提一次，合并二次濾液，定容至50 mL，用于DNJ、多糖、黃酮的檢測。

1.2.2 桑葉總糖的測定

采用硫酸-苯酚法測定桑葉總糖［7］。桑葉總糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密吸取0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖儲備液0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL于試管中，分別用蒸餾水補(bǔ)充至1 mL，得到葡萄糖的梯度稀釋液。先在試管中加入8%苯酚溶液0.5 mL，再向各管加入濃硫酸2.5 mL，震蕩混勻后沸水浴20 min，取出，冷水浴5 min，在490 nm波長下測吸光度，記錄并處理相關(guān)數(shù)據(jù)。

桑葉總糖的測定：精密吸取桑葉水提物1 mL，加入8%苯酚溶液0.5 mL，再向各管加入濃硫酸2.5 mL，震蕩混勻后，沸水加熱20 min，取出，冷水浴5 min，在490 nm波長下測吸光度，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.2.3 桑葉DNJ含量的測定

采用芴甲氧酰氯（FMOC-Cl）柱前衍生-高效液相色譜法測定桑葉中DNJ的含量［8］。

DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：用甲醇作為溶劑，先配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成1、2.5、5、7.5、10μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

DNJ的衍生化：分別吸取500μL DNJ標(biāo)準(zhǔn)液和桑葉水提液于離心管中，加入50μL硼酸鉀緩沖液（0.4 mol/L，pH 8.5），再 加 入100μL FMOC-Cl（5 mmol/L，溶于乙腈），混勻后，在20℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)20 min，再加入50μL甘氨酸溶液（0.1 mol/L），讓剩余的衍生化試劑發(fā)生反應(yīng)，最后加入4.3 mL乙酸溶液（10%），混勻后，用0.45μm濾膜過濾，待測。

液相色譜測定條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18；流動相為乙腈和0.1%乙酸水溶液（1∶1，v/v），流速1 mL/min，柱溫25℃，紫外檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20μL。

1.2.4 桑葉GABA含量的測定

采用FMOC-Cl柱前衍生-高效液相色譜法測定桑葉中GABA的含量［8］。

GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：先配制成1 mg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成1、5、10、20、40μg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液。

GABA的衍生化：分別吸取400μL GABA標(biāo)準(zhǔn)液和桑葉水提液于離心管中，加入100μL硼酸鉀緩沖液（0.5 mol/L，pH 8.5），再加入500μL FMOC-Cl（3 mmol/L，溶于乙腈），混勻后，在室溫放置10 min，再加入50μL甘氨酸溶液（0.1 mol/L），讓剩余的衍生化試劑發(fā)生反應(yīng)，最后加入100μL乙酸溶液（10%），混勻后，用0.45μm濾膜過濾，待測。

液相色譜測定條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18；以乙酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH 5.8，含0.05%三乙胺）為流動相A，80%的乙腈溶液為流動相B，按表1程序梯度洗脫；柱溫40℃，流速為0.5 mL/min；紫外檢測波長254 nm；進(jìn)樣量20μL。

表1 HPLC檢測GABA梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program of HPLC for GABA detection

1.2.5 桑葉總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法測定桑葉黃酮，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求出桑葉總黃酮含量（以蘆丁計）［7］。

1.2.6 桑葉甾醇含量的測定

取桑葉粉末5 g，用濾紙包好放入索氏提取器，加入20 mL的氯仿，于80℃加熱回流至浸提液顏色為無色，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收氯仿至干燥。加入甲醇溶解提取物，定容至50 mL［9］。

采用HPLC-ELSD法測定桑葉甾醇的含量［9］。

β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：以甲醇為溶劑，配制0.25 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，再稀釋成0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.45μm濾膜過濾后，待測。

液相色譜測定條件：色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18；進(jìn)樣量20μL；流動相為甲醇；流速為0.8 mL/min；柱溫25℃；ELSD漂移管溫度為60℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，采用Excel 2010軟件作圖。

3 結(jié)果與分析

3.1 桑葉總糖含量的測定結(jié)果

根據(jù)葡萄糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=12.292X+0.014 4，R2=0.999 4），檢測出春桑葉和霜桑葉及其葉脈的總糖含量。如圖1所示，桑葉總糖含量均高于桑葉脈，霜桑葉中葉片總糖含量是葉脈的1.98倍，春桑葉中葉片總糖是葉脈的1.96倍，可見桑葉葉片部分是總糖富集部位。霜桑葉、霜桑葉脈總糖含量均高于春桑葉、春桑葉脈，霜桑葉中葉片總糖的含量最高，為362.7 mg/g，其次為霜桑葉脈，含量為183.6 mg/g。生長季節(jié)對于桑葉活性成分的影響關(guān)系密切，中國藥典以霜桑葉入藥，表明桑葉經(jīng)霜后產(chǎn)生的活性物質(zhì)具有最佳藥效。本研究數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)霜桑葉中的總糖成分含量顯著升高，可見總糖尤其是多糖是霜桑葉發(fā)揮藥效的重要活性成分［7］。

圖1 桑葉樣品的總糖含量Fig.1 The contents of total sugars from mulberry leaves

3.2 桑葉中DNJ含量的測定結(jié)果

采用柱前衍生化-HPLC測定桑葉DNJ含量，根據(jù)DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=3.283 2X-0.519 5，R2=0.9984）測得春桑葉和霜桑葉的不同部位的DNJ含量。由圖2可知，桑葉葉脈部位的DNJ含量高于葉片中DNJ含量，春桑葉脈的DNJ含量是春桑葉的1.3倍，霜桑葉脈的DNJ含量是霜桑葉的1.26倍。春桑葉的DNJ含量高于霜桑葉，其中葉脈部分的DNJ含量最高，為230.7μg/g，是霜桑葉葉脈的2.1倍。由此可見，經(jīng)霜后，桑葉中DNJ的含量顯著降低。說明較高溫度，有利于DNJ的合成與積累［10-11］。春桑葉飼蠶后的剩余物中保留較高的DNJ成分，這部分的廢棄物資源可進(jìn)一步利用開發(fā)。

圖2 桑葉樣品的DNJ含量圖Fig.2 The contents of DNJ from mulberry leaves

3.3 桑葉中GABA的含量的測定結(jié)果

采用柱前衍生化-HPLC測定桑葉GABA含量，根 據(jù)GABA標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線（Y=130.88X+24.217，R2=0.999 4）測得春桑葉和霜桑葉不同部位的GABA含量。由圖3可知，春桑葉葉片中的GABA含量值最高，達(dá)415.7μg/g，是春桑葉脈的1.86倍，霜桑葉片的3.58倍。桑葉GABA含量與生長季節(jié)有關(guān)，經(jīng)霜后，桑葉GABA含量下降顯著［9］。春桑葉葉脈部分保留較高的GABA，含量為223.8μg/g，在蠶飼剩余物中具有很大的開發(fā)價值。

圖3 桑葉樣品GABA含量Fig.3 The contents of GABA from mulberry leaves

3.4 桑葉中黃酮含量的測定結(jié)果

根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=12.162+0.013 5，R2=0.999 7）測得春桑葉和霜桑葉及其葉脈的黃酮含量。由圖4可知桑葉中葉片部位的黃酮含量高于葉脈，春桑葉中葉片的黃酮含量是春桑葉葉脈的含量2.3倍左右；霜桑葉中葉片的黃酮含量是霜桑葉葉脈的含量的2.5倍左右。經(jīng)霜后，黃酮含量在葉片中進(jìn)一步富集，霜桑葉葉片部位的黃酮含量最高，為2.33 mg/g?？梢姡瑴囟冉档陀欣谏Ｈ~中黃酮物質(zhì)的合成與積累，是桑葉經(jīng)霜后發(fā)揮藥效的重要原因［10，12-13］。

圖4 桑葉樣品黃酮的含量圖Fig.4 The contents of flavonoids from mulberry leaves

3.5 桑葉甾醇含量的測定結(jié)果

根據(jù)β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線（Y=10 383X-213.21，R2=0.999 5）檢測出桑葉β-谷甾醇的含量。由圖5可知，春桑葉葉片中甾醇的含量與春桑葉脈的含量相當(dāng)。經(jīng)霜后，桑葉甾醇含量有顯著提升，霜桑葉中葉片的甾醇含量最高，達(dá)1.62 mg/g，是霜桑葉葉脈的1.2倍，是春桑葉葉片的1.4倍。研究表明，β-谷甾醇具有降糖降脂、增強(qiáng)免疫力等功效［14］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析指出β-谷甾醇是桑葉降糖作用的關(guān)鍵藥效成分［15］。本研究結(jié)果可知，經(jīng)霜后的桑葉中β-谷甾醇不斷積累，有助于霜桑葉發(fā)揮藥效。

圖5 桑葉β-谷甾醇含量圖Fig.5 The contents ofβ-sitosterols from mulberry leaves

4 討論與結(jié)論

本研究分別針對春桑葉和霜桑葉葉片和葉脈部位的主要次生代謝成分含量進(jìn)行檢測和比較研究，尤其關(guān)注了春桑葉葉脈中的成分變化。結(jié)果表明，不同季節(jié)采摘的桑葉次生代謝成分含量受環(huán)境溫度影響明顯。從表2可見，霜桑葉中總糖、黃酮和β-谷甾醇的含量均顯著高于春桑葉，且葉片部分高于葉脈部分。說明經(jīng)霜過程有助于活性藥效成分的產(chǎn)生和積累，亦佐證了總糖、黃酮或β-谷甾醇可能在霜桑葉發(fā)揮疏散風(fēng)熱、清肺潤燥、清肝明目等藥效中起其重要作用［10］。

表2 春桑葉和霜桑葉次生代謝成分含量Tab.2 The contents of secondary metabolites from spring mulberry leaves and frost mulberry leaves

DNJ是一種α-葡萄糖苷酶抑制劑，具有降血糖等生物活性［16］。桑葉是天然DNJ的主要來源，其含量受到桑樹品種、產(chǎn)地、采摘時期、部位等因素的影響［17］。李名杰等研究發(fā)現(xiàn)，隨著氣溫降低，桑葉DNJ含量急劇下降，在11月份左右，不同地域的桑葉DNJ含量都下降至0.1%以下［18］。夏文銀等測得霜桑綠茶的DNJ含量明顯低于春桑茶［19］。本研究與上述研究結(jié)論一致，霜桑葉DNJ含量顯著低于春桑葉。GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性傳遞物質(zhì)，具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)、抗焦慮及降血壓等多種藥理作用［20］。不同生長季節(jié)桑葉中GABA的含量有所不同，仝義超研究指出，7月后GABA的含量逐漸降低［9］。本研究中霜桑葉的GABA含量亦明顯低于春桑葉。

春桑葉是家蠶的主要飼料，蠶養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生大量的桑葉剩余物，主要是桑葉的葉脈部分。本研究對春桑葉葉脈的活性成分檢測分析結(jié)果表明，該部分保留了較高的DNJ、GABA和β-谷甾醇，尤其是DNJ含量顯著高于葉片部分。因此，飼蠶后的桑葉剩余物在降糖降壓保健食品開發(fā)方面具有較好的開發(fā)潛力，可以及時收集、消殺和干燥，變廢為寶，提高桑葉資源利用率。