許海燕，王 珊，彭修娟，陳衍斌，劉艷紅，侯敏娜，王 青，劉 峰，*

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710075）

地黃為玄參科植物地黃（Rehmannia glutinosaLibosch.）的新鮮或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品［1］，全國(guó)各地均有栽培，是我國(guó)常用的大宗中藥樹之一，應(yīng)用非常廣泛，具有清熱涼血，養(yǎng)陰生津等功效。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)［2］地黃的主要活性成分為多糖、環(huán)烯醚萜、苯乙醇苷、核苷等，其中多糖和環(huán)烯醚萜類化合物梓醇含量較高?，F(xiàn)代藥理研究表明［3-6］，地黃多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗衰老、調(diào)節(jié)血糖、血脂、抗疲勞焦慮等作用。梓醇具有治療心腦血管疾病、糖尿病及其并發(fā)癥、骨質(zhì)疏松癥以及神經(jīng)保護(hù)等作用［7］。目前，對(duì)于地黃的提取工藝研究多以地黃多糖或梓醇為測(cè)定指標(biāo)，很少以多指標(biāo)聯(lián)合來(lái)考察。故本研究以地黃中多糖和梓醇的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化提取工藝，確定最佳工藝參數(shù)，建立共提取方法，并對(duì)地黃的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為地黃的提取及進(jìn)一步發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

生地黃購(gòu)自河南省焦作市，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)楊新杰教授鑒定為玄參科地黃的干燥塊根［Rehmannia glutinosa（Gaertn.）Libosch］；梓醇對(duì)照品（110808-202011，純 度≥98%）及葡萄糖對(duì)照品（110833-202008，純度≥99.8%）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，其它均為分析純。

1.1.2 儀器

Waters-2695高效液相色譜儀（美國(guó)waters公司）；TU-1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FA1004分析天平（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；XY-200粉碎機(jī)（永康市松青五金工具廠）。

1.2 地黃多糖含量測(cè)定

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取葡萄糖對(duì)照品5 mg，置于50 mL的容量瓶，用蒸餾水溶解并定容，配制成濃度為0.10 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，吸取上述溶液2、4、6、8、10 mL置于10 mL容量瓶中，再分別加入蒸餾水定容至刻度，即得濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取1 mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入5%苯酚1 mL及5 mL濃硫酸振蕩均勻，80℃水浴加熱30 min后取出，放涼至室溫待測(cè)，蒸餾水為空白對(duì)照，在488.5 nm處測(cè)得吸光度值并記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)，濃度為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示，葡萄糖濃度在0.02～0.10 mg/mL時(shí)，線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y=6.356 1X-0.025 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.993 8。

1.2.2 供試品溶液的制備與測(cè)定

稱取適量地黃粉末，乙醇為提取溶劑，超聲提取后取濾液。濾液于4℃冰箱靜置過夜后離心，上清液減壓濃縮后的干燥物做多糖含量測(cè)定。加入適量蒸餾水將多糖溶解并定容，采用“1.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定多糖含量，計(jì)算多糖提取率。

1.3 梓醇含量測(cè)定

1.3.1 色譜條件

色譜條件［8］：色譜柱Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；流動(dòng)相：乙腈/0.1%磷酸（1：99）；進(jìn)樣體積10μL；流速1 mL/min，對(duì)照品和樣品色譜圖如下。

圖1 梓醇對(duì)照品、地黃樣品HPLC圖譜（a為梓醇色譜峰）Fig.1 HPLC chromatogram of catalpol standard solution and Rehmannia sample（a is catalpol chromatographic peak）

1.3.2 梓醇標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取梓醇對(duì)照品1 mg，用流動(dòng)相定容于100 mL的容量瓶中，配制成濃度為0.01 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取標(biāo)準(zhǔn)溶液2、3、4、5、6、7、8 mL置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，按照“1.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，梓醇在濃度為0.002～0.008 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=304 693X-71 265.7，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2。

1.3.3 供試品溶液的制備與測(cè)定

按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的提取方法，取上清液減壓濃縮后用流動(dòng)相溶解并定容，按“1.3.1”項(xiàng)下的色譜條件，測(cè)定梓醇含量，計(jì)算梓醇提取率。

1.4 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)使用控制變量法，在保證其他條件不變的情況下，分別考察乙醇濃度（10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%）、提取時(shí)間（10、15、20、25、30、35、40、45 min）、料液比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1、40∶1 mL/g）對(duì)同時(shí)提取地黃中多糖和梓醇提取率的影響。分別稱取8份相同質(zhì)量的地黃粉末，試驗(yàn)時(shí)固定兩個(gè)單因素，考察其中一個(gè)單因素的變化對(duì)地黃多糖和梓醇提取率的影響，最終得到最佳乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比。

1.5 響應(yīng)面-滿意度函數(shù)

1.5.1 滿意度函數(shù)

滿意度函數(shù)常常被用于多目標(biāo)優(yōu)化，操作方便，運(yùn)用比較廣泛，能智能反映出多因素影響下試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案的最佳結(jié)果，這種方法，是將不同響應(yīng)值轉(zhuǎn)化為0到1之間的無(wú)量綱數(shù)值，可以將多響應(yīng)值優(yōu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閱雾憫?yīng)值優(yōu)化，易于尋求整體最優(yōu)［9-10］。滿意度函數(shù)公式參考如下：

其中Di（Yi）為總體滿意度，Yi（x）表示對(duì)應(yīng)某個(gè)響應(yīng)值，Yi，min與Yi，max分別表示指標(biāo)中最低與最高響應(yīng)值，Wi表示權(quán)重，W1＋W2＋……Wn=1，設(shè)W1多糖權(quán)重，W2為梓醇權(quán)重，通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)［11-12］，地黃活性成分梓醇較多糖重要，故設(shè)定W1為0.4，W2為0.6。

1.5.2 響應(yīng)面分析法

以地黃多糖和梓醇的提取率為指標(biāo)，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，選取乙醇濃度、提取時(shí)間、液料比三因素進(jìn)行響應(yīng)面分析，每次試驗(yàn)平行三次，取平均值。每次試驗(yàn)得到的多糖及梓醇提取率根據(jù)滿意度函數(shù)轉(zhuǎn)化為總體滿意度值，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，確定地黃多糖和梓醇的最佳共提取條件并進(jìn)行驗(yàn)證，最終得到最佳提取工藝方案。

1.6 抗氧化活性研究

1.6.1 供試品溶液制備

將“1.2.2”項(xiàng)下得到的上清液濃縮干燥后用30%乙醇制成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.8、2.1 mg/mL的溶液，進(jìn)行抗氧化活性試驗(yàn)。

1.6.2 對(duì)照品溶液制備

分別稱取適量的維生素C（VC）與二丁基羥基甲苯（Butylated hydroxytoluene，BHT）對(duì)照品按供試品溶液同濃度配制，作為抗氧化的對(duì)照品溶液備用。

1.6.3 DPPH自由基清除率測(cè)定

精密稱取適量DPPH用無(wú)水乙醇配制成濃度為0.04 mg/mL的DPPH自由基溶液。取不同濃度的供試品溶液2.0 mL與2.0 mL的DPPH自由基溶液，在室溫下充分混合均勻，避光反應(yīng)30 min后在波長(zhǎng)為517 nm處測(cè)定混合溶液的吸光度記為Ai，樣品溶液和無(wú)水乙醇溶液的吸光度值A(chǔ)j，無(wú)水乙醇和DPPH溶液吸光度值A(chǔ)o，無(wú)水乙醇為空白對(duì)照，Vc及BHT溶液做陽(yáng)性對(duì)照，按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.6.4 ABTS自由基清除率測(cè)定

精密稱取適量的ABTS配制成10 mmol/L的溶液和濃度為4 mmol/L的過硫酸鉀溶液混合搖勻，避光放置10小時(shí)制得ABTS自由基陽(yáng)離子（ABTS+）原液。取不同濃度供試品溶液各0.1 mL，同ABTS工作液3.9 mL混合后在室溫下避光反應(yīng)6 min，在734 nm處測(cè)定吸光度值（A1），供試品與無(wú)水乙醇混合溶液吸光度（A2），無(wú)水乙醇做空白對(duì)照，以VC及BHT溶液做陽(yáng)性對(duì)照。按下列公式計(jì)算ABTS+清除率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，采用鄧肯氏法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05為顯著性差異。所有試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對(duì)地黃多糖及梓醇共提取的影響

圖2（a）為乙醇濃度對(duì)地黃多糖和梓醇提取率的影響。從圖中可直觀看出，隨著乙醇濃度的增加，地黃多糖的提取率逐漸下降，10%～40%之間下降的比較明顯，40%以后下降比較緩慢，說(shuō)明地黃多糖在40%后的乙醇中溶出較少。但地黃梓醇提取率隨著乙醇濃度的增加有所升高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，梓醇提取率最高，乙醇濃度40%以后梓醇提取率又緩慢下降，綜合考慮同時(shí)提取地黃中多糖和梓醇兩種有效成分，故選取30%乙醇濃度為最優(yōu)。

2.1.2提取時(shí)間對(duì)地黃多糖及梓醇共提取的影響

圖2（b）為提取時(shí)間對(duì)多糖和梓醇提取率的影響。從圖中可看出，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)地黃多糖和梓醇的提取率也隨之增加，多糖和梓醇均在20 min時(shí)提取率最高，說(shuō)明地黃多糖和梓醇在提取20 min時(shí)藥材內(nèi)外濃度達(dá)到平衡，故選擇提取時(shí)間20 min為最優(yōu)。

2.1.3 液料比對(duì)地黃多糖及梓醇共提取的影響

用相同的分析方法解析圖2（c）液料比對(duì)地黃多糖及梓醇共提取的影響，從圖中看出，地黃多糖和梓醇在液料比5∶1至10∶1時(shí)提取率逐漸上升，在10∶1后提取率不再有顯著提高，趨于平穩(wěn)，可能在液料比10：1時(shí)，地黃多糖和梓醇幾乎提取完全，故液料比確定10∶1為最佳。

圖2 不同條件對(duì)地黃多糖及梓醇共提取的影響Fig.2 Effects of different conditions on extraction of the co-extraction of polysaccharide and catalpol yield

2.2 響應(yīng)面-滿意度函數(shù)優(yōu)化結(jié)果

用響應(yīng)面軟件對(duì)地黃多糖、梓醇共提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。在多糖（Y1）、梓醇（Y2）得率的基礎(chǔ)上計(jì)算總體滿意度（D）值，以D為響應(yīng)值，優(yōu)化地黃多糖和梓醇的共提取條件。設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and level coding of test

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Tab.2 Experimental design of response surface methodology

依據(jù)Box-Behnken響應(yīng)曲面法對(duì)地黃中多糖及梓醇提取率共提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以滿意度為響應(yīng)值，結(jié)果設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)。應(yīng)用Design-Expert 10軟件分析數(shù)據(jù)，得到了多元二次回歸模型方程：D=0.42+0.026×A+2.838×10-3×B－0.28×C－6.625×10-3×AB－0.044×AC+0.046×BC－0.010×A2－0.011×B2+0.12×C2。方程式中D為滿意度，A為乙醇濃度，B為提取時(shí)間，C為液料比。

回歸方差分析見表3，從表中可以看出P模型＜0.000 1，說(shuō)明模型極顯著。F失擬項(xiàng)=2.03＞0.05，由此可見，失擬項(xiàng)不顯著，模型可信［13-14］。調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.991 9，說(shuō)明99.19%的響應(yīng)值變化能夠用該模型解釋。此外，從表3可以明顯看出，各因素的一次項(xiàng)中只有B對(duì)響應(yīng)值的影響無(wú)顯著性差異（P＞0.05），說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)多糖和梓醇提取率影響不顯著；交互項(xiàng)中AB對(duì)響應(yīng)值影響不顯著（P＞0.05），說(shuō)明乙醇濃度與提取時(shí)間之間無(wú)影響。以上分析可以看出各因素與響應(yīng)值間并非單純的線性關(guān)系。由一次項(xiàng)P值的大小可以得出各因素對(duì)響應(yīng)值滿意度的影響排序?yàn)椋阂毫媳龋–）＞乙醇濃度（A）＞提取時(shí)間（B）。

表3 方差分析表Tab.3 Regression equation analysis of variance table

使用Design-Expert 10軟件繪制而成的響應(yīng)曲面及等高線圖如圖3（a～c）所示，從這些圖中可以看到3因素的最佳參數(shù)和各因素之間的交互作用。從圖中可看出液料比最佳范圍為5∶1～15∶1，最佳乙醇濃度為25%～35%，最佳提取時(shí)間范圍為17～23 min。由圖3（b～c）可明顯看出，其曲面圖較陡峭，說(shuō)明提取時(shí)間與液料比及乙醇濃度與液料比之間的交互作用較顯著，與表3方差分析結(jié)果相吻合。

圖3 各因素響應(yīng)面與等高線分析圖Fig.3 Response surface and contour plot analysis diagram of each factor

根據(jù)Design-Expert 10軟件對(duì)模型方程計(jì)算整理，可以得出地黃多糖和梓醇的共提取最佳提取工藝為：乙醇濃度為30%，提取時(shí)間為15.57 min，液料比為10.05∶1，在此工藝條件下，多糖提取率為17.31%，梓醇提取率為0.94%，為考慮試驗(yàn)的可操作性，現(xiàn)將工藝調(diào)整為乙醇濃度30%，提取16 min，液料比10∶1，多糖提取率最高為16.15%，梓醇提取率為0.92%，分別比預(yù)測(cè)值下降1.16%與0.02%，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明本研究建立的回歸模型可較好反映地黃共提取條件，優(yōu)化的工藝結(jié)果準(zhǔn)確可行。

2.3 抗氧化活性結(jié)果分析

2.3.1 DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果

圖4（a）為不同濃度地黃對(duì)DPPH自由基清除率的關(guān)系圖，并與Vc及BHT對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比。從圖中可以看出，不同濃度供試品對(duì)DPPH自由基清除率具有顯著性差異，隨著供試品濃度的增加對(duì)DPPH清除率也逐漸增加（P＜0.05），當(dāng)?shù)攸S濃度為0.3 mg/mL時(shí)，地黃對(duì)DPPH的清除率為52.16%，清除作用大于標(biāo)準(zhǔn)品抗氧化劑BHT的45.38%（P＜0.05）。從圖中也可看出地黃清除DPPH自由基能力一直小于VC對(duì)照品，但從0.3 mg/mL后大于BHT清除率，說(shuō)明地黃對(duì)DPPH自由基有很好的清除能力。

圖4 地黃對(duì)不同自由基清除率的影響Fig.4 Effects of different free radical scavenging rates of R.glutinosa

2.3.2 ABTS自由基清除率測(cè)定結(jié)果

圖4（b）表示不同濃度地黃對(duì)ABTS自由基清除率的關(guān)系圖，并與Vc、BHT對(duì)照品進(jìn)行對(duì)比。從圖中可以明顯看到，不同濃度地黃對(duì)ABTS自由基清除率之間具有顯著性差異，且清除率隨著樣品濃度的增加而逐漸增大（P＜0.05），雖然從圖中也可直觀的看出Vc對(duì)ABTS自由基清除效果優(yōu)于地黃，但地黃對(duì)ABTS自由基的清除率一直高于BHT（P＜0.05）。故地黃對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基也具有一定的清除能力。

3 結(jié)論和討論

多糖和梓醇同為地黃中的功效物質(zhì)，實(shí)際操作中常對(duì)其中一種成分進(jìn)行提取，同時(shí)提取地黃多糖和梓醇的文獻(xiàn)報(bào)道較少，故將二者同時(shí)提取具有一定的實(shí)際意義。雖然地黃多糖可溶于熱水，梓醇在水中也有一定的溶解性，但由于水提液不易保存且雜質(zhì)多，故本試驗(yàn)采用含水乙醇為提取溶劑，并考察了不同濃度乙醇、提取時(shí)間、液料比三種影響因素下多糖和梓醇共提取的提取率，希望能為地黃中多糖和梓醇的共提取方法提供參考，也為地黃的進(jìn)一步研究提供理論價(jià)值。

藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，地黃對(duì)免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等有一定調(diào)節(jié)作用，此外，還可抗衰老、降三高、抑菌、抗腫瘤，保護(hù)胃黏膜及抗胃潰瘍等作用［15］。但對(duì)于其抗氧化活性鮮少報(bào)道，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，地黃具有顯著的抗氧化活性，且隨著濃度的增加抗氧化活性也隨之增加，這為地黃活性及藥理作用的進(jìn)一步研究提供一定的參考。

地黃多糖和梓醇的活性及藥理作用得到了越來(lái)越多的科學(xué)證實(shí)，使得地黃的市場(chǎng)需求不斷增大。目前，地黃多糖和梓醇已應(yīng)用于各種藥理、臨床及保健品領(lǐng)域。另一方面，由于地黃中多糖及梓醇含量均相對(duì)較低，直接食用地黃的保健和藥用效果仍相對(duì)較差。本研究的顯著特點(diǎn)為地黃多糖和梓醇同時(shí)提取，即可獲得提取物中較高含量的多糖和梓醇，因此，本研究所得提取物將為地黃保健品及藥品生產(chǎn)提供生產(chǎn)原料，可有效提高地黃藥效。將為地黃的發(fā)展提供更好的研究思路。