杜少波，喬 楓，張 勐，朱瑞清，劉美玲，董志強，陳曉文，謝惠春*

（1.青海師范大學生命科學學院，青海 西寧 810008；2.青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧 810008）

潰瘍性結腸炎（Ulcerative colitis，UC）是炎癥型腸病中最常見的類型之一，以結腸黏膜慢性炎癥為特征，主要累及直腸和結腸，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等，反復發(fā)作可導致體重下降，食欲不振等現(xiàn)象［1-4］。引起潰瘍性結腸炎發(fā)病的主要原因有環(huán)境、遺傳、感染等方面，但由于其發(fā)病機制尚不明確，尚未研究出完全適用于潰瘍性結腸炎的方法［5-6］。目前的治療手段主要包括5-氨基水楊酸制劑［7-8］、生物抑制劑［9］、免疫抑制劑［10］以及調(diào)節(jié)腸道菌群［11］等。但長期服用副作用大，可引起諸多不良反應。葡聚糖硫酸鈉（Dextran sulfate sodium，DSS）可抑制腸上皮細胞的增殖，引起腸道菌群代謝紊亂，從而引發(fā)炎癥［12］。通過DSS誘導的UC模型是最常用的化學性動物模型，也是使用最多的方法［13-14］，對于新藥開發(fā)和機制研究具有重要意義［15］。

獨一味［LamioPhlomis rotata（Benth.）Kudo］是我國傳統(tǒng)的中藥材［16］，具有鎮(zhèn)痛、止血、抗菌、提高免疫功能及抗腫瘤等作用［17-18］，且獨一味中環(huán)烯醚萜苷類抗炎鎮(zhèn)痛效果較好，是其主要藥效成分［19］。獨一味還具有很好的抗腸炎作用，可改善角叉菜膠［20］、內(nèi)毒素［21］或者二甲苯［22］等誘導的炎癥癥狀。其機制與抑制NF-κB因子的激活及炎癥細胞因子釋放、調(diào)節(jié)免疫反應以及調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)等密切相關［23-27］。但獨一味是否可以有效改善DSS誘導的UC癥狀，目前未見報道。

因此，本研究以DSS誘導建立UC小鼠模型，通過小鼠結腸炎癥狀的變化、血清中炎癥因子的含量和NF-κB因子的表達水平，探討獨一味對UC小鼠的保護作用及機制，為該藥用植物用于治療炎癥性腸道感染性疾病提供理論依據(jù)。

1 試驗材料

1.1 藥品及試劑

DSS（分子量36 000～50 000，美國MPBIO生物醫(yī)學公司）；獨一味提取物凍干粉（實驗室制備，用0.5% CMC-Na溶液配置成1 g/mL混懸液備用）；柳氮磺吡啶腸溶片（Sulfasalazine，SSZ）；0.5%Na-CMC溶液；4%多聚甲醛；磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffered saline，PBS）；超純水由Milli-Q超純水儀制備；小鼠ELISA試劑盒：白細胞介素-1β（Interleukin-1β，1L-1β）、白細胞介素-6（Interleukin-6，1L-6）、腫瘤壞死因子-α（Tumor nercrosis factor-α，TNFα），均購自上海江萊生物科技有限公司；NF-κB引物和Actin引物由公司合成；TRIZOL總RNA提取試劑；反轉錄試劑盒；Loading buffer 6×；氯仿、異丙醇和75%乙醇均為分析純。

1.2 試驗儀器

VORTEX-2-渦旋振蕩器、G05型PCR儀、DYCZ-24DH型雙板垂直電泳儀（甘肅金博研生物有限公司）；Secura513-1CN-精密天平（德國Sartorius公司）；H1650R-低溫離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；TSX50086V-超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；Nano Drop2000-超微量分光光度計（北京凱慕生物技術有限公司）。

1.3 試驗動物

采用SPF級C57雄性小鼠共36只，8周齡，體質量22 g左右，由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，飼養(yǎng)于福建醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號SCXK（蘇）2018-0008，動物飼養(yǎng)于干凈舒適的環(huán)境，溫度（22±2）℃；濕度（60±5）%。本論文中涉及到的所有試驗操作步驟全部符合實驗動物倫理委員會的相關規(guī)定。

2 方法

2.1 造模方法、試驗分組及給藥方案

將36只C57BL/6J雄性小鼠隨機分為空白對照組（CON）、模型組（DSS）、柳氮磺吡啶陽性對照組（DSS+SSZ 0.6 g/kg）、獨一味低（DSS+DYW 0.1 g/kg）、高劑量（DSS+DYW 0.2 g/kg）組、空白給藥組（DYW 0.2 g/kg）6組，每組動物6只，各組小鼠在動物屏障中培養(yǎng)1周后，空白對照組及對照給藥組給予正常飲用水。具體試驗分組及給藥方案如表1所示。

表1 試驗分組及給藥方案Tab.1 Trial grouping and administration scheme

模型組小鼠自由飲用2.5%DSS溶液10天。造模后，每天對小鼠進行稱重，觀察小鼠的行為狀態(tài)及便血程度，對DSS誘導的潰瘍性結腸炎小鼠進行初步給藥效果研究。

2.2 樣本采集及處理

造模及給藥期間每日對動物進行檢查并稱重。連續(xù)給藥至第11天將動物處死后，收集全結腸及脾臟器官，測量其長度和重量。全血樣本于4℃、3 000 r/min離心10 min取血清，-80℃保存。脾臟稱重，結腸腸斷鋪平測定其長度，縱向剪開，PBS洗凈，切除遠端結腸1 cm于4%多聚甲醛溶液中進行固定，剩余組織分為3份，置于EP管中，加入比例為1 mg：9 mL的PBS溶液進行冰上勻漿，4℃、3 000 r/min離心10 min，轉移上清液至新的EP管中-80℃保存，待測。

2.3 結腸組織HE染色病理形態(tài)學分析

對石蠟組織塊進行切片、脫蠟（二甲苯），脫水（不同梯度酒精）、染色（蘇木精-伊紅）等過程，具體試驗過程參照HE染色試劑盒進行操作，最后在切片上滴一滴中性樹膠然后封片、鏡檢。

2.4 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量測定

嚴格按照ELISA試劑盒中說明進行操作。

2.5 結腸組織中NF-κB的mRNA表達

2.5.1 結腸組織總RNA的提取

取出在-80℃中儲存的結腸組織，按照100 mg：1 mL比例加入Trizol，冰上勻漿，室溫裂解10 min，隨后加入氯仿，震蕩離心管10秒左右后靜置5 min，12 000 r離心5 min。轉移上清于新的離心管，按比例加入異丙醇，16 000 r離心10 min。棄上清，按比例加入75%乙醇，16 000 r離心5 min。棄上清，晾干后加入30μL DEPC水溶解。

RNA濃度檢測：取少量溶解的RNA用TE Buffer稀釋，再將該溶液在Nano Drop 2000超微量分光光度計中進行RNA純度檢測。

2.5.2 逆轉錄

總RNA為10μL的體系。逆轉錄反應體系如表2。

表2 逆轉錄反應體系Tab.2 Reverse transcription reaction system

2.5.3 qRT-PCR

對所提取的樣本進行實時熒光定量PCR檢測，引物序列及反應體系如表3及表4。

表3 NF-κB引物序列Tab.3 Primer sequence of NF-κB

表4 PCR反應體系Tab.4 PCR reaction system

循環(huán)模式：95℃，30 s；60℃，30 s；72℃，30 s，40個循環(huán)。利用溶解曲線判斷產(chǎn)物的特異性，采用2-ΔΔCt相對定量法計算各個基因水平，以Actin為參照，對各個基因水平進行標化；把慢性炎癥模型組的基因水平設為1，正常對照組和激動劑組的基因水平以相對于慢性炎癥模型組表示。

2.6 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，試驗結果采用平均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。使用Microsoft Excel 2022軟件生成圖形。

3 結果

3.1 不同處理組小鼠的臨床表現(xiàn)

本試驗定期觀察試驗動物臨床表現(xiàn)，試驗記錄發(fā)現(xiàn)，空白對照組及空白給藥組小鼠攝食飲水正常，毛發(fā)干凈且肛周無黏附血液，體重穩(wěn)定。利用DSS造模后第3天出現(xiàn)腹瀉，隨后出現(xiàn)便血情況、行動遲緩、精神萎靡不振、毛發(fā)無光澤癥狀，第5天后，DSS誘導的模型組小鼠總體出現(xiàn)毛發(fā)脫落直立、體表無光澤等現(xiàn)象，小鼠運動量明顯減少，常呈蜷縮狀態(tài)，體重下降。獨一味給藥組和陽性藥物對照組小鼠組出現(xiàn)便血情況，但癥狀均輕于模型組。

3.2 獨一味對DSS誘導的UC小鼠體重及脾臟重量的影響

見圖1，對照組及對照給藥組小鼠體重保持穩(wěn)定，沒有明顯升降變化，與對照組小鼠比較，模型組小鼠體重出現(xiàn)明顯下降，其余各組小鼠經(jīng)給藥后體重均有所回升。模型組小鼠脾臟重量呈顯著增加，由0.069 8±0.007 3 g顯著升高至0.113 3±0.019 7 g（P＜0.01），但各給藥組脾臟重量與DSS模型組和空白給藥組差異均不顯著。

圖1 不同組小鼠的體重和脾重Fig.1 Weight and spleen weight of mice in different groups

3.3 獨一味對DSS誘導的UC小鼠結腸長度的影響

通過圖2可看出，與空白對照組相比，DSS處理組小鼠結腸長度由7.767 0±0.496 7 cm明顯縮短至4.775 0±0.442 5 cm（P＜0.01）。與模型組比較，獨一味低劑量組結腸長度回升到6.200 0±0.395 0 cm（P＜0.01）；獨一味高劑量組結腸長度回升到6.291 7±0.080 1 cm（P＜0.01），高于低劑量組但差異不顯著；柳氮橫吡啶陽性對照組無顯著差異。

圖2 不同組小鼠結腸長度（上）及外觀（下）Fig.2 Colon length（upper）and appearance（lower）of mice in different groups

從結腸外觀情況看，空白組及空白給藥小鼠結腸組織狀況良好，未出現(xiàn)充血潰爛等情況。而模型組小鼠結腸可明顯看到出血情況，腸腔內(nèi)糞便淤積，結腸明顯縮短和扭曲，且模型組多數(shù)小鼠的結腸黏膜紋理破壞。各治療組小鼠出現(xiàn)不同程度的腸黏膜充血，嚴重程度較模型組減輕，其中獨一味高劑量組小鼠結腸恢復狀況最好。

3.4 獨一味對DSS誘導的UC小鼠結腸組織病理變化的影響

圖3為小鼠結腸組織HE染色結果，可以發(fā)現(xiàn)對照組小鼠的結腸組織無損傷現(xiàn)象，結腸結構保持完整，沒有出現(xiàn)炎癥細胞的浸潤；與對照組相比，模型組表現(xiàn)出典型的潰瘍性結腸炎病理變化，出現(xiàn)黏膜損傷，大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤腺上皮，獨一味低劑量組、獨一味高劑量組和柳氮磺吡啶陽性藥組小鼠結腸組織中潰瘍程度明顯改善，炎性細胞浸潤也顯著減少。并且獨一味高劑量組的炎性細胞浸潤程度較輕于獨一味低劑量組。

圖3 小鼠結腸組織HE染色病理學變化Fig.3 Pathological changes of colon tissue in mice by HE staining

3.5 獨一味對DSS誘導的UC小鼠中血清炎癥因子的影響

采用ELISA法測定小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子表達水平。結果如圖4所示，與對照組相比，DSS組小鼠各炎癥因子水平明顯高于對照組，TNF-α水平由114.40±35.27顯著升高至211.27±40.60，IL-1β水平由652.30±165.20顯著升高至1 101.22±136.77，IL-6水平由295.75±56.15顯著升高至471.12±42.37（差異均有統(tǒng)計學意義P＜0.05）。與DSS組比較，獨一味低、高給藥組血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低，獨一味低劑量組TNF-α水平顯著下降到94.19±18.35，IL-1β水平顯著下降至751.46±112.14，IL-6水平顯著下降至299.46±42.37，獨一味高劑量組TNF-α水平顯著降低到108.64±43.28，IL-1β水平顯著下降至573.61±131.88，IL-6水平顯著下降至288.28±40.40（差異均有統(tǒng)計學意義P＜0.05）。與DSS組比較，柳氮磺吡啶陽性藥組各炎癥因子表達水平均顯著下降（P＜0.05），和獨一味低、高給藥組差異不顯著（P＞0.05）。

圖4 不同組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6相對表達量Fig.4 Relative expression of TNF-α、IL-1β、IL-6 in serum of different groups of mice

3.6 獨一味對DSS誘導的UC小鼠結腸組織中NFκB mRNA表達的影響

利用qRT-PCR檢測分析小鼠結腸組織中的NF-κBmRNA表達水平，結果如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中NF-κBmRNA表達水平顯著升高，模型組NF-κBmRNA表達水平由1.00 0±0.413 4顯 著 升 高 至3.575 8±0.0.666 7（P＜0.05）；與模型組比較，獨一味低劑量組、獨一味高劑量組和陽性對照組NF-κB表達水平都顯著降低，分別顯著降低至1.754±0.498 6、1.664±0.491 3和2.026 4±0.269 0（P＜0.05）。

圖5 不同組小鼠結腸組織中NF-κB mRNA相對表達量Fig.5 Relative expression of NF-κB mRNA in colon tissue of different groups of mice

4 討論

4.1 柳氮磺吡啶陽性對照組的選擇

抗?jié)冃越Y腸炎試驗中，增加柳氮磺吡啶陽性對照組，可以更明確所研究新藥物的有效性。鄧代霞等［28］在研究魚腥草對潰瘍性結腸炎的保護作用和機制試驗中，以美沙拉嗪腸溶片作為陽性組，表現(xiàn)出較高的抗UC療效。陳玉杰［29］在探討蒲公英水提物對潰瘍性結腸炎的治療作用時，選擇柳氮磺吡啶作為陽性組，同樣表現(xiàn)出很高的抗UC療效。柳氮磺吡啶屬于5-氨基水楊酸制劑代表藥物，在腸道微生物的作用下，可以分解為5-氨基水楊酸和磺胺吡啶，從而保護腸道微生物環(huán)境，抑制炎癥因子的表達［30-31］。本試驗中選擇柳氮磺吡啶作為陽性藥物，有效緩解了UC小鼠的體重下降、結腸長度縮短、結腸潰瘍性程度加深及炎癥因子表達水平的上升，通過本研究再次證明了其抗UC療效。

4.2 潰瘍性結腸炎模型小鼠的建立

研究藥物對潰瘍性結腸炎小鼠是否具有改善和保護作用，關鍵在于UC模型的成功建立。李曦等［32］采用對2，4-二硝基苯磺酸（2，4-Dinitrobenzene sulfonic acid，DNBS）成功誘導構建UC大鼠模型，誘導后的UC大鼠出現(xiàn)結腸水腫潰爛、炎癥因子顯著上調(diào)等癥狀。楊顯娟等［33］通過2，4，6-三硝基苯磺酸（2，4，6-Trinitrobenzene sulfonilc acid，TNBS）也成功誘導了UC大鼠模型。本試驗選擇DSS誘導UC小鼠，其機制為首先破壞結腸組織上皮細胞，致使結腸組織上皮屏障破壞，導致結腸粘膜通透性增加，以允許抗原、腸腔內(nèi)細菌、促炎物質等進入黏膜或黏膜下層，從而引發(fā)炎癥［34］。試驗結果發(fā)現(xiàn)，DSS誘導的UC模型組小鼠出現(xiàn)便血、腹瀉、毛發(fā)脫落、體重下降等臨床表現(xiàn)，這些癥狀與人類UC特征基本相似［35］；結腸長度明顯縮短，結腸組織表現(xiàn)出明顯的黏膜損傷、大量中性粒細胞、淋巴細胞浸潤腺上皮，都明顯表現(xiàn)出UC癥狀。經(jīng)研究表明，促炎因子表達量的增加是引發(fā)潰瘍性結腸炎的主要因素［36-37］。而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子主要由NF-κB信號通路介導，細胞因子NF-κB被激活后可以誘導TNF-α、IL-1β、IL-6因子的大量表達，腸粘膜被破壞潰爛，引發(fā)炎癥［38-40］。本試驗中DSS模型小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β及NF-κBmRNA表達水平升高，再次表明本試驗中DSS成功誘導了小鼠潰瘍性結腸炎模型。利用DSS誘導的潰瘍性結腸炎癥狀具有操作簡便、成功率高及重復性強的優(yōu)點，并且與人類UC的癥狀極為相似，可對于深入闡明UC的發(fā)病機制及尋找有效治療藥物具有重要的作用。

4.3 獨一味對潰瘍性結腸炎癥狀的改善及其機制研究

本試驗中，UC小鼠在給予獨一味治療后，其小鼠體重的下降、結腸長度的縮短、結腸潰瘍性程度等UC癥狀均有不同程度的改善，并且獨一味高劑量組相較于低劑量組改善效果更好，可能獨一味對UC的治療作用具有一定的量效關系。但獨一味治療組小鼠脾重相較于模型組并未發(fā)生顯著變化，同時與空白給藥組和陽性對照組也無顯著差異，這種現(xiàn)象可能是由于小鼠體重不同造成脾臟肥大也不同所造成的。獨一味給藥組還能顯著降低DSS模型小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的含量及NF-κBmRNA的表達水平。證明獨一味可以很好的改善UC癥狀，并且是通過抑制NF-κBmRNA表達，進而抑制促炎性細胞因子的分泌，達到改善潰瘍性結腸炎癥狀，這與丁香［41］、苦豆子［42］等藥材抗UC機制相似。本研究為獨一味預防UC等相關藥品的開發(fā)提供了理論基礎，但獨一味對治療UC小鼠的適宜劑量還有待進一步研究。

5 結論

獨一味可以改善UC小鼠的體重變化、抑制結腸縮短，降低結腸病理評分和炎癥因子的分泌，其機制與抑制NF-κB信號通路有關。