王 潔 孟秋峰 周潔萍 任錫亮 高天一 安學君

（1 寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院，浙江寧波 315040；2 浙江省余姚市小曹娥鎮(zhèn)人民政府，浙江余姚 315475）

莖瘤芥（var.Tsen et Lee）是起源于我國的十字花科蕓薹屬芥菜種作物，俗名榨菜，富含人體所需的多種營養(yǎng)物質(zhì)，加工后可作為下飯菜及休閑小菜食用，深受廣大消費者歡迎。莖瘤芥在我國長江中下游地區(qū)和四川等地廣泛種植，地方特色優(yōu)勢明顯，推動其產(chǎn)業(yè)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，對提高冬閑田和冬季勞動力利用率，推行低碳農(nóng)業(yè)，促進農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收和農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展具有重大意義。

目前，我國莖瘤芥育種以雜交育種為主，采用傳統(tǒng)多代自交純化的方法獲得純合自交系一般需要6～8 代，甚至更長的時間，費時、費工、費力。游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)是近年來發(fā)展較為成熟的單倍體育種技術(shù)，可以簡化自交系的純合過程，縮短育種年限，提高育種效率（石江鵬 等，2017）。大量研究表明，選材是游離小孢子培養(yǎng)能否成功的決定性因素（申娟 等，2008）。沈進娟等（2012）研究表明，處在單核靠邊期和雙核初期的莖瘤芥小孢子成胚率較高。通過細胞學及顯微鏡觀察等方式確定小孢子的發(fā)育時期較為精確，但是操作繁瑣、耗時耗力。前人在葉用芥菜、菜薹（菜心）、普通白菜（小白菜）等十字花科作物上的研究表明，小孢子的不同發(fā)育時期與花器官外部形態(tài)存在顯著相關(guān)性（吳康云 等，2012；龐強強 等，2019；楊延紅 等，2020）。但關(guān)于莖瘤芥小孢子發(fā)育時期與花器官外部形態(tài)的相關(guān)性研究未見報道。本試驗選擇長江中下游地區(qū)廣泛種植的甬榨2 號為試材，通過對其小孢子不同發(fā)育時期的花器官外部形態(tài)及相關(guān)指標進行觀察、測定，研究莖瘤芥小孢子不同發(fā)育時期與花器官外部形態(tài)的相關(guān)性，以期簡化田間取材方法，快速精準取材，為莖瘤芥游離小孢子培養(yǎng)在育種上的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試莖瘤芥品種為寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院選育的甬榨2 號，2020 年10 月上旬播種育苗，11 月上旬定植在寧波市農(nóng)業(yè)科學研究院高新農(nóng)業(yè)試驗園區(qū)，小區(qū)面積5 m，3 次重復，株距20 cm，行距25 cm，每小區(qū)種植150 株，常規(guī)田間管理。2021 年5 月，于植株盛花期選擇晴天的上午進行取材。

1.2 花蕾形態(tài)觀察及相關(guān)指標測定

參照楊延紅等（2020）的方法，每小區(qū)隨機選取新鮮花序3 個，觀察不同發(fā)育時期花蕾的大小、飽滿程度、顏色等。在解剖鏡下用鑷子和解剖針去除花萼，小心剝開花瓣，取出花藥，觀察記錄花瓣和花藥顏色；使用游標卡尺測量花蕾、花瓣、花藥的縱徑和橫徑。

1.3 小孢子細胞核觀察

利用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）熒光染料對小孢子細胞核進行染色，在正置熒光顯微鏡（DMLB，Leica，Germany）下觀察拍照。

1.4 花藥半薄切片觀察

參照王潔（2015）的方法進行包埋處理及切片，使用1%亞甲基蘭染色后在正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.5 小孢子超微結(jié)構(gòu)觀察

參照王潔（2015）的方法進行超薄切片處理，使用醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液和檸檬酸鉛溶液各染色15 min，干燥后于Hitachi ModelH-7650型透射電鏡下觀察拍照。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、分析，利用SPSS 軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的細胞學及超微結(jié)構(gòu)特征

通過對不同發(fā)育時期莖瘤芥甬榨2 號小孢子的形態(tài)進行觀察，并結(jié)合半薄切片以及超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)（圖1～3、表1），小孢子母細胞時期，細胞表面被一層厚厚的胼胝質(zhì)包裹，有1 個細胞核，細胞形狀不規(guī)則，細胞質(zhì)內(nèi)有豐富的細胞器和小液泡，內(nèi)部分化程度較低；四分體時期，小孢子的外部為四裂狀，由4 個細胞組成聯(lián)合體，外面被一層胼胝質(zhì)包裹，經(jīng)染色后可以看到4 個細胞核同時出現(xiàn)在同一個聯(lián)合體里，小孢子內(nèi)有較多的片層膜結(jié)構(gòu)，如多聚核糖體，線粒體體積較?。浑S后，四分體外面的胼胝質(zhì)壁水解，體積較小的單個小孢子被釋放出來，逐漸發(fā)育成圓形或近圓形，細胞質(zhì)內(nèi)含有許多小液泡和質(zhì)體，質(zhì)體體積較小，花粉外壁開始發(fā)育并逐漸變厚，此時細胞內(nèi)只有1 個細胞核，細胞核較大且位于細胞中央，即單核早中期；隨著發(fā)育進程的推進，細胞體積不斷增大，形狀呈圓形，細胞內(nèi)的小液泡逐漸融合，形成大液泡，萌發(fā)溝逐漸形成，細胞質(zhì)濃厚，有豐富的細胞器，線粒體體積較大，細胞核靠近細胞的邊緣，因此稱為單核靠邊期，也稱單核后期；之后，單核小孢子進行第1次有絲分裂，由于是不均等分裂，因此形成1 個體積較大、靠近液泡的營養(yǎng)核和1 個體積較小、貼近細胞壁的生殖核，花粉內(nèi)壁形成，質(zhì)體較多，即雙核時期；最后，生殖核分裂為2 個精子，此時小孢子細胞內(nèi)可看到3 個核，即1 個營養(yǎng)核和2 個精核，細胞質(zhì)內(nèi)有淀粉粒和脂滴分布，電子密度較高，花粉外壁形成電子密度較高的3 層結(jié)構(gòu)，最外層為覆蓋層，中間為基粒棒層，底部為基足層，為三核時期。

圖1 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期細胞核染色觀察結(jié)果

圖2 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期花藥半薄切片觀察結(jié)果

圖3 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

表1 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的細胞學形態(tài)特征

2.2 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期與花器官形態(tài)特征的相關(guān)性

對莖瘤芥甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的花器官外部形態(tài)進行觀察發(fā)現(xiàn)（圖4、表2），小孢子母細胞時期，花蕾很小，花萼完全包裹著花藥，花萼和花瓣顏色均為淺綠色，花藥綠色；四分體時期，花蕾較小，花萼仍然完全包裹著花藥，花萼和花瓣顏色均為綠色，花藥淡黃綠色；單核早中期，花蕾稍大，完全閉合，花萼包被著花藥，花萼綠色，花瓣和花藥均呈現(xiàn)黃綠色；單核后期，花蕾逐漸膨大，仍完全閉合，花萼包被著花藥，花萼綠色，花瓣淡黃色，花藥黃綠色；雙核時期，花蕾明顯膨大，花萼未張開，顏色為綠色，花藥比花瓣短，顏色為黃綠色，花瓣淡黃色；三核時期，花蕾表現(xiàn)為細長、蓬松的形態(tài)，花萼未張開，顏色為黃綠色，花瓣明顯長于花藥，未露出萼片或部分露出，花瓣和花藥顏色均為黃色，花萼黃綠色。由此可以通過觀察花蕾的外觀形態(tài)，花藥和花瓣的顏色，以及花瓣、花藥長度等，快速將處于單核后期和雙核時期的花蕾區(qū)分開來。

圖4 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的花蕾形態(tài)變化

表2 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的花器官外部形態(tài)特征

甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的花器官形態(tài)指標測定結(jié)果見表3。進一步計算8 個指標的平均值，進行差異顯著性分析。結(jié)果表明（表4），甬榨2號的花蕾縱徑、花蕾橫徑、花藥縱徑、花藥橫徑、花瓣縱徑均隨著小孢子發(fā)育進程的推進呈現(xiàn)逐漸增長的趨勢，其中花蕾縱徑和花蕾橫徑在各個發(fā)育時期均表現(xiàn)出顯著性差異，可以根據(jù)這2 個指標實現(xiàn)小孢子發(fā)育時期的快速甄別。例如，小孢子單核后期的花蕾縱徑范圍在3.50～3.79 mm 之間，橫徑在1.92～2.21 mm 之間。此外，單核后期的花藥縱徑與其他發(fā)育時期也存在顯著性差異，亦可以依據(jù)該指標將單核后期的小孢子與其他時期進行區(qū)分。

表3 甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的花器官外部形態(tài)指標

表4 差異顯著性分析結(jié)果

3 討論與結(jié)論

植物小孢子的發(fā)生經(jīng)歷了小孢子母細胞時期、四分體時期、單個釋放的小孢子時期，單個釋放的小孢子時期又經(jīng)歷了單核早期、單核中期、單核后期（也稱單核靠邊期）、雙核時期及成熟時期（McCormick，1993）。大部分植物成熟時期的花粉為二核花粉，即成熟的花粉粒中含有1 個較小的生殖核和1 個較大的營養(yǎng)核。少數(shù)植物，如十字花科作物，隨著雙核花粉的不斷發(fā)育，生殖細胞還要再進行一次有絲分裂，隨即形成含有2 個生殖核和1 個營養(yǎng)核的三核細胞。本試驗中，通過DAPI 染色發(fā)現(xiàn)莖瘤芥甬榨2 號的成熟花粉粒中含有3 個細胞核，屬于三核花粉，這與蘿卜、普通白菜（小白菜）等十字花科作物上的研究結(jié)果一致（李丹 等，2008；楊延紅 等，2020）。

游離小孢子培養(yǎng)受多種因素的影響，選擇合適生長時期的材料是小孢子能否誘導成功的決定性因素。研究表明，大多數(shù)作物處在單核時期的小孢子在適宜培養(yǎng)條件下容易被誘導發(fā)育成胚（龐強強 等，2019）。沈進娟等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，莖瘤芥單核后期和雙核初期的小孢子成胚率較高。通過細胞學觀察可以確定小孢子的發(fā)育時期，但在實際操作中因工作量巨大，一般不會對每個小孢子的發(fā)育時期進行檢測。前人研究表明，小孢子發(fā)育時期與花器官的外部形態(tài)之間存在一定的相關(guān)性（李丹等，2008；龐強強 等，2019；楊延紅 等，2020）。本試驗通過觀察甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期花蕾、花藥等花器官形態(tài)特征發(fā)現(xiàn)，處在單核后期和雙核時期的花蕾飽滿，花瓣淡黃色，花藥黃綠色，與其他幾個時期相比特征明顯，能夠很容易將二者與其他時期區(qū)分開來；而雙核時期的花瓣長于花藥，又可快速將這二者區(qū)分開。由于單核后期和雙核時期的花蕾還處于閉合狀態(tài)，實際操作中可用鑷子小心將花萼和花瓣撥開，以便觀察。進一步對甬榨2 號小孢子不同發(fā)育時期的花蕾縱徑、橫徑、縱橫比，花藥縱徑、橫徑、縱橫比，花瓣縱徑及瓣藥比等8 項指標進行統(tǒng)計學分析，花蕾縱徑和花蕾橫徑在各個發(fā)育時期均存在顯著性差異，可以作為該品種區(qū)分小孢子不同發(fā)育時期的花器官形態(tài)指標。除此之外，單核后期的花藥縱徑與其他發(fā)育時期也存在顯著性差異，亦可以依據(jù)該指標將單核后期的小孢子與其他時期進行區(qū)分。但是就實際操作的可行性而言，進行小孢子培養(yǎng)時建議采用直接測量花蕾縱徑實現(xiàn)田間的精準取材既經(jīng)濟快捷又方便準確，可以大幅提高小孢子培養(yǎng)的效率。這與甘藍類、白菜類等十字花科作物開展小孢子培養(yǎng)時一般以花蕾長度作為參照確定小孢子培養(yǎng)時期的結(jié)論一致。然而，本試驗中處在單核后期的花蕾縱徑范圍為3.50～3.79 mm，與沈進娟等（2012）、楊明貴等（2015）在其他莖瘤芥品種上得到的數(shù)值均存在一定差異，這可能是由于芥菜類蔬菜類型豐富，不同品種之間花蕾長度差異較大。今后應對不同生態(tài)類型、不同地區(qū)的大量多樣化莖瘤芥品種進行測定分析，最終確定田間快速、精準取材的標準。