譚舒心 張淑江 章時蕃 張 慧 李國亮 劉希童 劉雨佳 孫日飛 李 菲

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

隨著植物游離小孢子培養(yǎng)技術的發(fā)展，利用小孢子培養(yǎng)誘導單倍體/雙單倍體（DH）植株用于育種等科研領域的研究日益受到關注。十字花科蕓薹屬蔬菜在我國栽培歷史悠久，種質資源豐富，在蔬菜生產(chǎn)中占據(jù)重要地位。多年來蕓薹屬植物游離小孢子培養(yǎng)技術的研究始終是科研人員關注的熱點之一，近幾年針對白菜培養(yǎng)體系的優(yōu)化已取得有效進展（李菲 等，2014；伍健繽 等，2021），并有力推動了白菜小孢子培養(yǎng)技術在育種等科研領域的廣泛應用。目前，小孢子培養(yǎng)技術在加速十字花科蕓薹屬作物種質純化、DH 群體的圖譜構建以及重要基因定位研究中發(fā)揮了顯著優(yōu)勢（李智軍 等，2021）。但在細胞培養(yǎng)范疇，小孢子的收集受供體植株生長周期和栽培條件的極大影響，不能持續(xù)獲取優(yōu)質、高生活力的小孢子，是阻礙小孢子培養(yǎng)技術更廣泛應用的主要障礙。例如二年生的大白菜，在缺少人工氣候室的情況下，利用溫室、大棚等設施栽培亦可在每年3—5 月大白菜盛花期收集到適宜誘導胚狀體的小孢子，但是一旦進入高溫季節(jié)，植株病害嚴重，則難以繼續(xù)收集小孢子，使相關科研工作無法按計劃推進。因此，如何持續(xù)獲取高生活力的小孢子對推動白菜細胞工程研究的順利開展具有重要意義。

超低溫凍存技術為妥善保存白菜小孢子提供了可能。超低溫凍存是指以液氮為冷源，貯存溫度保持在-196 ℃的長期貯存生物材料的方法（Wang et al.，2011）。在超低溫條件下，生物材料活體細胞的物質代謝幾乎完全停止，處于“活力停滯”（stagnant vitality）狀態(tài)（David，2010）。因細胞、組織及器官在低溫保存過程中遺傳特性不會發(fā)生改變，在“活力停滯”狀態(tài)下可減緩甚至停止生物材料的新陳代謝和老化過程（宋友遠 等，2016），且不發(fā)生遺傳變異并維持生物材料的高活力，達到安全、有效地長期保存珍稀種質資源的效果（Pedro et al.，2008）。

關于植物組織超低溫凍存的方法已有研究報道（何慶虎，2019），凍存對象主要涉及原生質體、愈傷組織、體細胞胚、花粉、種子等（殷曉輝 等，1996；王子成和鄧秀新，2002；謝玉明，2003；張守梅 等，2005；余露 等，2007；Bai et al.，2011；Pio et al.，2012；Souza et al.，2018）。前人研究發(fā)現(xiàn)，細胞在-15～-5 ℃下通常會出現(xiàn)低溫冷害現(xiàn)象，細胞內的脂質膜、微管在進行有絲分裂或細胞減數(shù)分裂時紡錘體發(fā)生不可逆變化，導致細胞無法正常分裂而死亡（Moussa et al.，2014）。在超低溫凍存中植物細胞液內也同樣存在冷害現(xiàn)象（Harding，2004），因此在超低溫凍存中需添加必要的冷凍保護劑（孫嘉瑩 等，2019），目前廣泛應用的冷凍保護劑主要為二甲基亞砜（DMSO）、甘油等（文彬，2011），但此類滲透性冷凍保護劑本身具有毒性，會使蛋白質發(fā)生變性，從而造成細胞的損傷，對凍存對象具有一定毒害作用（張美娜 等，2019）。

植物小孢子為單倍體的單細胞，新鮮提取的小孢子在進行細胞懸浮培養(yǎng)時極易受培養(yǎng)環(huán)節(jié)的溫度、光照、振蕩、培養(yǎng)基成分等諸多因素干擾而使細胞停止發(fā)育，這可能是科研人員至今還未將超低溫凍存技術應用于植物小孢子的原因。本試驗利用超低溫凍存技術對10 份白菜材料小孢子開展凍存復蘇研究，建立白菜小孢子超低溫凍存復蘇的胚狀體誘導體系，以期獲得維持高生活力小孢子長期保存的有效方法，為白菜單倍體誘導相關試驗的順利開展提供技術支持，推動蕓薹屬植物細胞工程研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試10 份白菜材料均由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所白菜課題組提供，包括8 份結球白菜和2 份青梗菜（表1）。

表1 供試10 份白菜材料編號及基本特性

改良B5 液體培養(yǎng)基：常規(guī)B5 培養(yǎng)基中添加120 g·L蔗糖、50 g·L甘露醇，pH 值5.8，高溫滅菌后4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫欢谆鶃嗧抠徲赟igma-Aldrich（貨號：D2650-100ML），參照傳統(tǒng)方法，利用無菌蒸餾水配制成濃度為2%的溶液（馬鋒旺和李嘉瑞，1989），4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 供體植株栽培管理 10 份白菜材料均于2020 年12 月20 日催芽，播種于直徑為10 cm 的營養(yǎng)缽中，溫室育苗常規(guī)管理。2021 年3 月3 日，幼苗4～5 片葉時定植于本所南圃場大棚內，每份材料定植10 株。經(jīng)過冬季短期的營養(yǎng)生長和低溫春化，植株開始花芽分化并抽薹開花，3 月底至6月初在盛花期收集提取小孢子。

1.2.2 白菜小孢子的收集 采集供體植株2～3 mm長的花蕾（此時小孢子主要處于單核靠邊期），先用75%酒精浸泡消毒30 s，再用7%次氯酸鈉溶液浸泡消毒15 min，然后無菌蒸餾水沖洗3 遍；加入改良B5 液體培養(yǎng)基，采用細胞破碎儀（TOMY MS-100R）收集提取小孢子。將40 個花蕾收集于5 mL 離心管中，細胞破碎儀3 000 r·min條件下破碎10 s，進行小孢子的機械化提?。ɡ罘?等，2009，2014）。

1.2.3 白菜小孢子的生活力檢測 利用醋酸洋紅染色法分別檢測10 份白菜材料新鮮小孢子的生活力，作為后期的試驗對照。取1～2 μL 小孢子懸浮液置于載玻片上，滴1 滴醋酸洋紅染液，室溫下放置10 min，在蔡司體式顯微鏡（Axioskop 40）10×目鏡下觀察，具有生活力的小孢子呈深紅色，無生活力的小孢子呈淺紅色或無色（李慶飛 等，2020）。隨機選擇3～4 個視野進行觀察，取平均值。

小孢子生活力=視野內有生活力的小孢子數(shù)/視野內全部小孢子數(shù)× 100%

1.2.4 冷凍保護劑比較試驗 分別采用改良B5 液體培養(yǎng)基與傳統(tǒng)冷凍保護劑二甲基亞砜作為冷凍保護劑，比較并篩選適宜白菜小孢子低溫保存的冷凍保護劑。保存溫度設置6 個處理：4、-20、-40、-80℃（冰箱）和-196 ℃（液氮），以室溫為對照；每個溫度處理下再設置3 個保存時間處理：30、60、90 d。每處理3 次重復，利用醋酸洋紅染色法檢測小孢子生活力。為確保試驗的一致性，4 ℃和室溫處理也同樣添加冷凍保護劑；試驗采用的0.5 mL凍存管密封性好，可長期無菌保存小孢子，冷凍保護劑不會揮發(fā)。

1.2.5 白菜小孢子低溫保存試驗 分別收集10 份白菜材料的新鮮小孢子分裝于0.5 mL 滅菌凍存管中，小孢子體積不超過凍存管的2/3。設置6 個溫度處理：4、-20、-40、-80 ℃（冰箱）和-196 ℃（液氮），以室溫為對照；每個溫度處理下再設置6 個保存時間處理：30、60、90、120、150、180 d。每處理3 次重復，利用醋酸洋紅染色法檢測小孢子生活力。

1.2.6 白菜小孢子復蘇試驗 根據(jù)前期試驗結果，選擇-80 ℃（冰箱）保存90 d 的小孢子為試材，篩選白菜小孢子復蘇適宜溫度及時間。小孢子為單細胞，細胞復蘇并保持高生活力的關鍵是“慢凍快融”原則。Harding（2004）研究表明，植物細胞超低溫保存后化凍溫度超過50 ℃會對細胞結構和細胞器造成不可逆的損傷，從而導致細胞死亡。因此，本試驗設置的3 個復蘇溫度處理分別為：37、40、50 ℃；每個溫度處理下再設置3 個復蘇時間處理：40、50、60 s。利用恒溫水浴鍋（上海博訊醫(yī)療設備廠）進行加熱融化；每處理3 次重復，利用醋酸洋紅染色法檢測小孢子生活力。

1.2.7 懸浮培養(yǎng)誘導小孢子胚狀體 分別將10 份白菜材料的新鮮小孢子和在-80 ℃（冰箱）保存30、60、90、150、180 d 后進行復蘇的小孢子懸浮于NLN-13 液體培養(yǎng)基（pH 值6.0，用0.22 μm 針式過濾器過濾滅菌制得，4 ℃冰箱保存）中。利用血球計數(shù)板調整小孢子懸浮液濃度為1 × 10個·mL，然后分裝于直徑為60 mm 的無菌培養(yǎng)皿中，每皿10～12 mL，采用Parafilm 封口膜封口；33 ℃培養(yǎng)箱熱激誘導24 h 后，轉入25 ℃暗培養(yǎng)孵育，直至獲得肉眼可見的胚狀體。采用蔡司體式顯微鏡觀察胚狀體發(fā)生情況，統(tǒng)計每皿出胚數(shù)；每處理3次重復，取平均值。

1.2.8 誘導小孢子胚狀體的植株再生 將超低溫保存、復蘇小孢子誘導獲得的胚狀體轉入B5 固體培養(yǎng)基〔6-芐氨基嘌呤（6-BA）1.5 mg·L、α-萘乙酸（NAA）0.05 mg·L、蔗糖30 g·L，pH 值5.8～6.0〕進行組培繼代，培養(yǎng)室溫度保持24～26℃，光照強度1 000～1 500 lx，16 h 光照/8 h 黑暗培養(yǎng)，直至獲得具有根、莖、葉的再生植株。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 和SPSS 19.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA 方差分析，選擇95%置信度作為統(tǒng)計學顯著檢驗的標準。

2 結果與分析

2.1 不同冷凍保護劑對白菜小孢子生活力的影響

如表2 所示，參試10 份白菜材料的新鮮小孢子生活力均較高，且差異不大，其中白菜4 的小孢子生活力最高，達到99.2%；白菜7 的小孢子生活力最低，為94.3%；10 份白菜材料的小孢子平均生活力為97.6%。說明小孢子生活力與白菜材料背景無相關性，且目前白菜小孢子提取技術已成熟穩(wěn)定，可確保收集的新鮮小孢子具有高生活力。

表2 10 份白菜材料新鮮小孢子的生活力檢測結果

從表3 可以看出，相同保存條件下采用改良B5 液體培養(yǎng)基為冷凍保護劑的白菜小孢子生活力明顯高于采用傳統(tǒng)冷凍保護劑二甲基亞砜為冷凍保護劑的白菜小孢子；以改良B5 液體培養(yǎng)基為冷凍保護劑，保存溫度為-196 ℃和-80 ℃，保存時間30 d 的白菜小孢子生活力分別為96.6%和95.2%，與新鮮小孢子的平均生活力97.6%相差不大；隨著保存時間的延長，白菜小孢子生活力呈下降趨勢，保存時間為90 d 時以二甲基亞砜為冷凍保護劑的白菜小孢子生活力均低于56%，已無法滿足后續(xù)試驗要求。由此，后續(xù)試驗均以改良B5 液體培養(yǎng)基作為冷凍保護劑。

表3 不同冷凍保護劑對低溫保存白菜小孢子生活力的影響

2.2 不同保存溫度對白菜小孢子生活力的影響

不同溫度保存30 d 的白菜小孢子生活力差異明顯，利用醋酸洋紅染色法可直觀分辨（圖1）。其中-80 ℃和-196 ℃保存的小孢子生活力較高，與新鮮小孢子無明顯差異，且遠高于其他低溫保存的小孢子生活力；室溫對照和4 ℃保存的小孢子數(shù)量明顯減少，大量細胞破裂，細胞液外流，失去生活力。

圖1 白菜1 小孢子不同溫度保存30 d 的顯微觀察結果（10×目鏡）

由表4、圖2 可以看出，相同保存條件下10份白菜材料間的小孢子生活力差異不大。-196 ℃和-80 ℃保存的小孢子平均生活力隨保存時間的延長下降趨勢平緩，保存30 d 的小孢子平均生活力分別為96.6%和95.2%，與新鮮小孢子平均生活力差異不明顯，保存至180 d 時小孢子平均生活力仍可保持在85%以上；其他處理條件下，白菜小孢子生活力隨著保存溫度的升高呈明顯下降趨勢，且隨保存時間的延長小孢子平均生活力也明顯下降。10 份白菜材料的小孢子在-40、-20 ℃保存90 d 的平均生活力為70%左右；4 ℃保存60 d 的小孢子平均生活力已降至57.4%；室溫對照保存30 d 的小孢子平均生活力僅維持在50%左右，保存至60 d的小孢子平均生活力僅為1.8%，已基本喪失生活力。綜上，白菜小孢子無法在4 ℃和室溫條件下長期保存；對于短期（30～90 d）且對生活力要求不高（80%以下）的試驗而言，低溫保存小孢子可選擇的溫度范圍較廣，-196～-20 ℃均可；對于長期保存，且對小孢子生活力要求高（85%以上）的試驗，則需要在-196～-80 ℃溫度下保存。鑒于-80℃（冰箱）和-196 ℃（液氮）保存下白菜小孢子的生活力差異不顯著，實際應用中可選擇-80 ℃冰箱保存，既可避免液氮保存時需要人員定期監(jiān)控和定時填充液氮等問題，且操作也更簡便。

圖2 不同保存溫度和時間對白菜小孢子生活力的影響

表4 不同保存溫度對白菜小孢子生活力的影響

2.3 不同復蘇條件對白菜小孢子生活力的影響

-80 ℃保存90 d 的白菜小孢子經(jīng)不同條件復蘇處理后的生活力檢測結果表明（表5），白菜小孢子生活力隨復蘇溫度的升高和復蘇時間的延長呈逐漸下降趨勢，其中37 ℃恒溫水浴40 s，10 份白菜材料的小孢子生活力均在85%以上，平均生活力為87.9%，可以滿足后續(xù)小孢子誘導培養(yǎng)胚狀體的試驗要求，即0.5 mL 凍存管分裝保存的白菜小孢子復蘇的最佳條件為37 ℃恒溫水浴40 s。

表5 -80℃保存90 d 的白菜小孢子不同復蘇處理后生活力檢測結果

2.4 凍存復蘇后小孢子的胚狀體培養(yǎng)

經(jīng)超低溫保存、復蘇后的白菜小孢子是否能誘導胚狀體發(fā)生是建立小孢子凍存復蘇體系的關鍵。本試驗觀察發(fā)現(xiàn)，隨著超低溫保存時間的延長，懸浮培養(yǎng)的復蘇小孢子在觀察視野中可捕捉到的熱激膨大的小孢子數(shù)量和分裂的細胞團數(shù)量呈逐漸減少的趨勢。

從表6 可以看出，白菜2 和白菜3 為易出胚材料，其提取的新鮮小孢子及-80 ℃保存30、60、90 d 復蘇后的小孢子均可誘導獲得胚狀體；白菜1和白菜4 的新鮮小孢子和凍存復蘇后的小孢子均不具備胚胎發(fā)生能力，可能是因為這2 份材料為難誘導胚胎發(fā)生的材料；其余6 份材料的小孢子不同處理后進行熱激誘導均有小孢子體積膨大現(xiàn)象，后續(xù)培養(yǎng)觀察也發(fā)現(xiàn)有分裂的細胞團（圖3）。由此認為，超低溫保存的白菜小孢子復蘇后可以承受高溫熱激脅迫，并可以繼續(xù)進行游離小孢子培養(yǎng)；小孢子是否可誘導獲得胚狀體主要取決于材料本身基因型。

圖3 白菜5 小孢子-80℃保存180 d 復蘇后的熱激膨大小孢子及分裂細胞團

表6 超低溫保存、復蘇后白菜小孢子誘導成胚情況

統(tǒng)計白菜2 和白菜3 的出胚數(shù)量。結果表明（表7，圖4、5），小孢子隨著超低溫保存時間的延長，誘導產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量不斷減少，與新鮮小孢子出胚量有顯著差異。分析原因，可能是經(jīng)過長時間超低溫保存的小孢子雖然仍保持較高生活力，但比新鮮小孢子的生活力仍有所降低（表4），且小孢子歷經(jīng)超低溫保存、復蘇處理及高溫熱激誘導等多次溫度的逆境脅迫后，雖仍具有啟動胚胎發(fā)生的能力，但能進一步進行細胞分裂的小孢子數(shù)量也隨之降低。

表7 白菜2、白菜3 超低溫保存、復蘇后小孢子的出胚數(shù)量

圖4 白菜2 超低溫保存、復蘇后小孢子的出胚情況

圖5 白菜3 超低溫保存、復蘇后小孢子的出胚情況

2.5 超低溫保存小孢子誘導胚狀體的繼代培養(yǎng)

將超低溫保存、復蘇后的白菜小孢子誘導獲得的胚狀體接種于B5 固體培養(yǎng)基組培繼代，與新鮮小孢子誘導獲得的胚狀體相比，經(jīng)歷30、60、90 d超低溫保存后的小孢子誘導獲得的胚狀體在普通組培繼代培養(yǎng)中沒有表現(xiàn)生長發(fā)育的差異，3 個月后均成功獲得了具根、莖、葉的組培再生植株（圖6）。由此認為，白菜小孢子經(jīng)超低溫保存、復蘇后誘導獲得的胚狀體同樣可實現(xiàn)正常組培苗的獲得。

圖6 超低溫保存、復蘇后白菜小孢子誘導胚狀體繼代培養(yǎng)獲得組培苗

3 討論與結論

隨著游離小孢子培養(yǎng)技術的不斷發(fā)展和應用，超低溫凍存技術可能是解決目前白菜小孢子供體植株受生長季節(jié)、生長期影響，無法長期持續(xù)獲取高生活力小孢子的有效途徑之一。

本試驗采用改良B5 液體培養(yǎng)基作為白菜小孢子超低溫保存的冷凍保護劑，能有效克服二甲基亞砜等傳統(tǒng)冷凍保護劑對細胞凍存的潛在毒害（陳曉藝 等，2021），并且小孢子經(jīng)超低溫凍存復蘇后仍可維持較高生活力和胚胎發(fā)生能力。選擇改良B5液體培養(yǎng)基是因為在白菜小孢子培養(yǎng)體系中B5 培養(yǎng)基必不可少，除了可以維持游離態(tài)細胞的養(yǎng)分環(huán)境，還具較高的糖濃度。有報道認為，在冷凍保護劑中添加蔗糖能夠改變凍存組織的外液滲透壓，有助于細胞在冷凍時脫水，在解凍時可防止水分的快速進入，降低冰晶對細胞的損傷（潘紅梅 等，2015）；另外，冷凍保護劑中添加幾種糖類混合物對細胞保護效果更好（Gómez-Fernández et al.，2012）。這可能是本試驗利用改良B5 液體培養(yǎng)基作為冷凍保護劑使白菜小孢子生活力更高、達到良好保存效果的原因。

本試驗結果表明，白菜小孢子經(jīng)長時間低溫保存后，雖然仍可維持較高的生活力，但與新鮮小孢子相比其生活力隨低溫保存時間的延長是逐漸下降的，這與后期觀察復蘇小孢子熱激后誘導膨大的小孢子數(shù)量、分裂的細胞團數(shù)量以及獲得的胚狀體數(shù)量隨低溫保存時間的延長而減少是一致的。白菜游離小孢子培養(yǎng)屬于大群體基數(shù)的細胞培養(yǎng)，在后續(xù)進行小孢子超低溫凍存體系優(yōu)化中可通過提高復蘇后白菜游離小孢子懸浮液濃度，從而有效提高超低溫凍存復蘇小孢子誘導培養(yǎng)的胚狀體數(shù)量。

考慮到凍存體積影響化凍時長，小孢子凍存體積越大化凍時間則越長，進而影響小孢子生活力。本試驗選擇0.5 mL 凍存管分裝保存白菜小孢子，每管凍存小孢子稀釋后可分裝3～4 個培養(yǎng)皿，可滿足后續(xù)小孢子胚狀體誘導試驗所需。在實際應用中，小孢子凍存體積可根據(jù)不同試驗目的進行合理調整。使用體積更小的凍存管，白菜小孢子凍存復蘇的時間縮短，在一定程度上可減少高溫化凍對小孢子的傷害，小孢子復蘇后可維持更高生活力。

小孢子是花粉的前體，前人在花粉凍存研究中發(fā)現(xiàn)，超低溫并不都有利于植物花粉的保存。如海棠花粉的最適保存溫度為4 ℃，溫度過低會導致細胞脫水，不利于海棠花粉貯藏（朱金儒 等，2016）。本試驗結果表明，隨著保存溫度的升高，白菜小孢子生活力逐漸下降，但在-80 ℃和-196℃保存條件下小孢子生活力下降趨勢減緩。這與劉學良等（2018）分析低溫導致細胞呼吸作用減弱，可溶性糖、有機酸等物質消耗減少的觀點一致。由此認為，白菜小孢子的保存不能參照花粉保存的溫度，4、?20、?40 ℃低溫保存均無法使白菜小孢子長期保存后仍具有高生活力。

本試驗所用的10 份材料中8 份為結球白菜，2 份為青梗菜，提取的新鮮小孢子生活力均在95%左右；在相同試驗條件下不同白菜材料小孢子之間的生活力差異并不顯著，本凍存技術可以廣泛應用于白菜類作物。

本試驗首次對白菜小孢子超低溫凍存復蘇開展研究，篩選獲得了適宜白菜小孢子的超低溫凍存條件，建立了白菜小孢子超低溫凍存及復蘇后胚狀體誘導體系，試驗結果可為十字花科蕓薹屬作物小孢子的長期有效保存以及相關細胞培養(yǎng)研究提供技術參考。