馬強(qiáng)+劉方燕+黨曉群+孫厚良+李國利+熊書+潘國慶+周澤揚(yáng)

摘要：為研究家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的保守性及轉(zhuǎn)錄活性，采用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶slp2基因共線性、多重序列及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行比對分析，并通過Western blot分析Nbslp2在家蠶微孢子蟲、柞蠶微孢子蟲及納卡變形微孢子蟲中的表達(dá)特征，以驗(yàn)證其保守性；進(jìn)一步以感染家蠶微孢子蟲不同天數(shù)的家蠶中腸組織為材料，利用RT-PCR檢測Nbslp2的轉(zhuǎn)錄活性。共線性、多重序列比對及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Nbslp2在微孢子蟲基因組中的位置較保守，Western blot結(jié)果顯示Nbslp2抗體在柞蠶微孢子蟲總蛋白中雜交出2條帶，而在納卡變形微孢子蟲沒有雜交條帶，說明Nbslp2相對保守，并且可將Nbslp2作為區(qū)分柞蠶微孢子蟲和納卡變形微孢子蟲的靶標(biāo)；RT-PCR結(jié)果顯示Nbslp2在感染家蠶微孢子蟲后72 h檢測到轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步推測Nbslp2可能在家蠶微孢子蟲感染家蠶早期發(fā)揮作用，為分子水平深入研究Nbslp2的功能奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：家蠶微孢子蟲；表達(dá)特征；定位；功能；保守性；轉(zhuǎn)錄活性；共線性；多重序列比對；系統(tǒng)進(jìn)化

中圖分類號：S884.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0150-04

收稿日期：2017-04-06

基金項(xiàng)目：重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校苗圃工程項(xiàng)目（編號：2014mpxz1）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃（編號：cstc2014jcyjA80019）。

作者簡介：馬 強(qiáng)（1986—），男，云南玉溪人，碩士，講師，主要從事微生物功能基因組學(xué)研究。Tel：（023）58556819；E-mail：cjmaqiang@163.com。

通信作者：周澤揚(yáng)，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物學(xué)及家蠶分子生物學(xué)研究。Tel：（023）68251088；E-mail：zyzhou@swu.edu.cn。 微孢子蟲（microsporidia）能夠感染宿主并且通過自由孢子形式進(jìn)行傳播，是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的單細(xì)胞真核生物，至今已發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的微孢子蟲種類已經(jīng)超過1 300種，分別被歸入160多個(gè)屬，能夠廣泛寄生于幾乎所有的無脊椎動物和脊椎動物，包括人類[1-2]。家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）是1857年Nageli首次從病蠶體內(nèi)鑒定出的人類歷史上第1種微孢子蟲，它能引起家蠶微粒子病，這種病害曾在19世紀(jì)給歐洲、美國以及亞洲的蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，直到現(xiàn)在這種病害也常有發(fā)生[3-4]。由于它的危害性巨大，一直以來都很受關(guān)注，在許多養(yǎng)蠶國家和地區(qū)，家蠶微孢子蟲被列為蠶業(yè)生產(chǎn)上唯一的法定檢疫對象。

微孢子蟲作為專性的細(xì)胞內(nèi)寄生生物，其生活史的完成必須嚴(yán)格依賴于宿主提供的營養(yǎng)和能量。家蠶微孢子蟲是家蠶微粒子病的病原，其侵染和致病機(jī)理目前仍不清楚。普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為，家蠶微孢子蟲通過釋放蛋白酶，水解寄主細(xì)胞內(nèi)容物，掠奪宿主營養(yǎng)物質(zhì)，完成其在宿主家蠶細(xì)胞內(nèi)的增殖[5-6]。因此，分泌性蛋白酶被認(rèn)為是致病性真菌重要的毒力因子。這些蛋白酶不僅參與孢子的入侵過程，還可以與宿主的免疫系統(tǒng)相互作用。類枯草桿菌蛋白酶（subtilisin-like protease，SLP）為絲氨酸蛋白酶家族成員，廣泛存在于細(xì)菌、真菌和寄生蟲等生物中。近年研究表明，類枯草桿菌蛋白酶與病原性細(xì)菌、真菌的致病性相關(guān)[7-8]，在真菌孢子形成、蛋白質(zhì)降解及細(xì)胞自噬等方面起著非常重要的作用[9-11]。隨著家蠶微孢子蟲基因組測序的完成，通過序列比對發(fā)現(xiàn)在家蠶微孢子蟲中也存在類枯草桿菌蛋白酶。因此，筆者推測家蠶微孢子蟲可能在入侵過程中會分泌類枯草桿菌蛋白酶，通過降解昆蟲體壁幫助其入侵宿主細(xì)胞。基于此，本研究在已鑒定報(bào)道的3個(gè)類枯草桿菌蛋白酶基因（Nbslp1、Nbslp2-1和Nbslp2-2）的基礎(chǔ)上[12]，分析了第2個(gè)類枯草桿菌蛋白酶基因Nbslp2的保守性及轉(zhuǎn)錄情況，為進(jìn)一步研究該基因在家蠶微孢子蟲中的定位和功能探索提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑和儀器

家蠶微孢子蟲CQ1分離株由西南大學(xué)蠶病研究室分離獲得，保存于中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心（CVCC，保藏號為CVCC102059）。

Trizol、瓊脂糖購于Invitrogen公司；乙二胺四乙酸鈉（EDTA）購于USB公司；DNase Ⅰ、RNase Inhibitor、dNTP、Oligo（dT）、Taq酶和DL2000 DNA Marker購于TaKaRa公司；羊抗鼠IgG-HRP、玻璃珠（150～212 μm）購自Sigma公司；PVDF膜購自Roche公司；EasySee Western Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC）和3-（N-嗎啉）丙磺酸購于生工生物工程上海（股份）有限公司；三氯甲烷購于重慶化學(xué)試劑有限公司；甲醛購于重慶北碚化學(xué)試劑廠。所需要的特異性引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 家蠶微孢子蟲Nbslp2的多重序列比對及共線性分析

根據(jù)筆者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶微孢子蟲全基因組數(shù)據(jù)庫，結(jié)合NCBI公共數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中兔腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon cuniculi）、蜜蜂微孢子蟲（Nosema ceranae）、腸腦炎微孢子蟲（Encephalitozoon intestinalis）以及腸道微孢子蟲（Enterocytozoon bieneusi）的基因組數(shù)據(jù)，利用ClustalX軟件對slp2的同源基因序列進(jìn)行多重序列比對，用Boxshade對比對后的結(jié)果進(jìn)行修正。同時(shí)分析slp2在幾種微孢子蟲數(shù)據(jù)庫中的基因座位信息、基因長度、垂直同源基因的對應(yīng)關(guān)系，利用在線軟件http：//microbe.swu.edu.cn/cgi-bin/synteny進(jìn)行共線性圖譜的繪制。此外，分別選擇真菌、細(xì)菌、頂復(fù)亞門、微孢子蟲門幾個(gè)代表物種，對各物種中的slp2的同源序列進(jìn)行多序列比對，將多序列比對結(jié)果使用MEGA 5.0程序構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，設(shè)置信度為1 000。endprint

1.3 家蠶微孢子蟲Nbslp2的保守性分析

利用Western blot分析家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2在家蠶微孢子蟲（N. bombycis）、柞蠶微孢子蟲（N. antheraeae）以及納卡變形微孢子蟲（Vairimorpha necatrix）中的表達(dá)特征，以驗(yàn)證其保守性，分別取1×109純化的上述3種微孢子蟲孢子沉淀，加400 μL PBS（pH值7.3）重新懸浮，同時(shí)分別稱取0.4 g玻璃珠加到3管孢子懸液中，加入PMSF，4 ℃渦旋振蕩6 h，然后4 ℃、12 000 r/min離心 10 min，收集上清液，得到3種微孢子蟲的孢子總蛋白，之后將提取獲得的3種孢子總蛋白定量后進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）4 ℃封閉過夜，之后用TBST溶液洗滌封閉液，重復(fù)3次，然后加入制備的抗血清anti-NbSLP2（1 ∶6 000）作為一抗，室溫孵育 1 h。辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠lgG（1 ∶8 000）為二抗，37 ℃孵育1 h，ECL發(fā)光系統(tǒng)檢測，暗室內(nèi)X膠片顯影Western blot檢測結(jié)果。

1.4 家蠶微孢子蟲Nbslp2的轉(zhuǎn)錄活性分析

利用RT-PCR分析家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的轉(zhuǎn)錄特征。取感染家蠶微孢子蟲1～10 d的家蠶中腸組織，加入1.0 mL Trizol，液氮研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，混勻，靜置5 min后加入200 μL三氯甲烷，4 ℃、12 000 r/min離心10 min。取上層水相移入EP管，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min，低溫離心，加入1 mL預(yù)冷的0.1% DEPC水配制的75%乙醇洗滌沉淀，空氣中干燥RNA沉淀15 min，加入20 μL RNase-Free ddH2O將沉淀溶解。瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察，判斷RNA的完整性。將提取的家蠶微孢子蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以此cDNA為模版，設(shè)計(jì)家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2的引物，slp2-F：5′-GGATCCATGCTGTTTGTTCTTCTTAT-3′和slp2-R：5′-GTCGACTCAATTTACATGTATTGTAG-3′；以家蠶微孢子蟲β-tubulin基因作為內(nèi)參，Tub-F：5′-TGGACGCCATTAG ACAAG-3′和Tub-R：3′-TCTAAAGACAGCAGCCAC-3′進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃ 退火1 min、72 ℃延伸1 min，共25個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶微孢子蟲Nbslp2的共線性分析

Nbslp2在家蠶微孢子蟲基因組中有2個(gè)拷貝，該基因家族在微孢子蟲染色體/scaffold上的位置相對保守（圖1），且Nbslp2在Nosema屬的微孢子蟲基因組中的排布比在Encephalitozoon屬的位置更具線性關(guān)系。

2.2 家蠶微孢子蟲Nbslp2的多重序列比對分析

采用ClustalX軟件對Nbslp2與其他微孢子蟲，細(xì)菌、真菌、寄生蟲等其他物種的同源基因進(jìn)行多重序列比對，結(jié)果顯示，Nbslp2序列中都具備行使類枯草桿菌蛋白酶催化功能的保守氨基酸位點(diǎn)（圖2），分別是Asp282、His304、Ser460。不同微孢子蟲種間slp2的氨基酸序列相似度較高。

2.3 家蠶微孢子蟲Nbslp2的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了進(jìn)一步分析家蠶微孢子蟲slp2基因與其他物種中同源基因的進(jìn)化關(guān)系，以它們的蛋白質(zhì)序列構(gòu)建了鄰接法進(jìn)化樹。系統(tǒng)進(jìn)化樹的結(jié)果（圖3）表明，家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2與蜜蜂微孢子蟲（N. ceranae）、兔腦炎微孢子蟲微孢子蟲（E. cuniculi）、腸腦炎微孢子蟲（E. intestinalis）聚為一支，且親緣關(guān)系較近，暗示slp2在微孢子蟲基因組中的進(jìn)化較為保守。

2.4 家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2基因的保守性分析

通過Western blotting從蛋白水平分析Nbslp2在家蠶微孢子蟲（N. bombycis）、柞蠶微孢子蟲（N. antheraeae）以及納卡變形微孢子蟲（Vairimorpha necatrix）中的表達(dá)特征，結(jié)果如圖4所示。Nbslp2在家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲中有表達(dá)，且在柞蠶微孢子蟲中檢測到2條大小位置不一的條帶，而在納卡變形微孢子蟲中未檢測到雜交信號，因此，可將Nbslp2作為區(qū)分上述3種微孢子蟲的靶標(biāo)。

2.5 家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2基因的轉(zhuǎn)錄活性分析

利用RT-PCR研究家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2基因在感染家蠶后的轉(zhuǎn)錄情況。結(jié)果如圖5所示，Nbslp2在感染家蠶微孢子蟲后72 h檢測到轉(zhuǎn)錄活性，并且該轉(zhuǎn)錄活性會隨著感染時(shí)間的延長有逐漸減弱的趨勢，說明Nbslp2可能在家蠶微孢子蟲感染家蠶早期發(fā)揮作用。

3 結(jié)論與討論

自1954年第1個(gè)枯草桿菌分泌的蛋白酶被鑒定以來[13]，國內(nèi)外學(xué)者對subtilisin進(jìn)行了深入而廣泛的研究，截止到目前為止NCBI中已收錄了17 868條蛋白質(zhì)序列，11 135 條基因序列，其中389個(gè)subtilisin的三維結(jié)構(gòu)已被解析。本研究主要是在已鑒定的3個(gè)家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶基因Nbslp1、Nbslp2-1和Nbslp2-2基礎(chǔ)上，結(jié)合家蠶微孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫和生物信息學(xué)方法對其中的Nbslp2-1（Nbslp2）基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過共線性、多重序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，Nbslp2在Nosema屬微孢子蟲基因組中的位置較為保守。通過Western blotting對Nbslp2的保守性進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在家蠶微孢子蟲（N. bombycis）和柞蠶微孢子蟲（N. antheraeae）有該蛋白的存在，而在納卡變形微孢子蟲（V. necatrix）中沒有，因此，可以利用Nbslp2作為區(qū)分家蠶微孢子蟲和納卡變形微孢子蟲的分子靶標(biāo)。同時(shí)，免疫印跡的結(jié)果還顯示，Nbslp2抗體在柞蠶微孢子蟲中出現(xiàn)2個(gè)雜交信號，且大小位置不一，以此可以作為區(qū)分家蠶微孢子蟲和柞蠶微孢子蟲的靶標(biāo)。因此，可將Nbslp2作為蠶業(yè)生產(chǎn)上潛在的檢測靶標(biāo)。endprint

研究人員對兔腦炎微孢子蟲中2個(gè)類枯草桿菌蛋白酶（slp1和slp2）轉(zhuǎn)錄活性分析后發(fā)現(xiàn)，由芽體分化為母孢子的過程中它們的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)3倍[14]；同樣對家蠶微孢子蟲在感染家蠶不同時(shí)期Nbslp1的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Nbslp1在家蠶微孢子蟲感染家蠶1 d后就有轉(zhuǎn)錄，暗示其可能在侵染初期發(fā)揮作用[12]；據(jù)此推測家蠶微孢子蟲類枯草桿菌蛋白酶Nbslp2在微孢子蟲的增殖發(fā)育過程中可能也發(fā)揮重要作用。隨后的轉(zhuǎn)錄活性檢測發(fā)現(xiàn)，Nbslp2在感染家蠶微孢子蟲后72 h檢測到轉(zhuǎn)錄，并且該轉(zhuǎn)錄活性會隨著感染時(shí)間的延長有逐漸減弱的趨勢，這一結(jié)果暗示著Nbslp2可能在家蠶微孢子蟲感染家蠶早期發(fā)揮重要作用。鑒于上述的預(yù)測和分析結(jié)果，后續(xù)將開展對Nbslp2基因的研究。

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