蘇芳芳， 楊 光， 張 嬌， 鄭玉光， 錢 丹

(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心1，石家莊 050200) (中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心2，北京 100700) (中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心3，北京 100700) (河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院4，石家莊 050026)

火麻仁為?？浦参锎舐?CannabissativaL.)的干燥成熟果實(shí)，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，至今已有3 000多年的使用歷史。2002年原衛(wèi)生部公布的《關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》將火麻仁作為藥食同源物質(zhì)收錄其中?；鹇槿示哂袠O高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)潛力，其油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27.04%～37.67%[2]，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～25%[3]，含有P、K、Ca等常量元素和Fe、Zn、Mn、Cu等微量元素，還含有少量的黃酮和酚類物質(zhì)[4]?；鹇槿视椭胁伙柡椭舅嵴伎傊舅豳|(zhì)量的77.55%～81.21%，具有抗氧化、降脂[5]、調(diào)節(jié)腸道功能[6]等作用；火麻仁蛋白中有65%～75%的麻仁球蛋白和25%～37%的麻仁白蛋白，均屬于容易消化的全價(jià)蛋白質(zhì)[3]。

近年來，火麻仁油和火麻仁蛋白在工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的驅(qū)動(dòng)下受到關(guān)注。主要研究集中在火麻仁油提取方法的考察，如溶劑浸出法[7]、超臨界萃取法[8]、壓榨法[9]和水酶法[10]等。榨油后的火麻仁殘?jiān)礊榛鹇槿势?，多作為?dòng)物飼料添加，經(jīng)濟(jì)附加值較低，一定程度上造成火麻仁資源的浪費(fèi)。堿提酸沉法是通過堿水溶解、酸溶液析出的提取方法[11]，也是工業(yè)提取植物蛋白的常用方法。目前已有學(xué)者研究火麻仁蛋白的堿提酸沉法[12]、水酶法[13]工藝。已有研究多基于火麻仁單一產(chǎn)品，未能綜合考量火麻仁油和蛋白的品質(zhì)和產(chǎn)量。本研究從火麻仁油得率和脂肪酸組成、火麻仁蛋白得率和氨基酸組成作為綜合指標(biāo)進(jìn)行考察，用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了火麻仁蛋白提取工藝，建立火麻仁資源綜合利用的方法，為火麻仁資源綜合利用、火麻仁油和蛋白的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

火麻仁，經(jīng)鑒定為桑科植物大麻(CannabissativaL.)的果實(shí)；NaOH、HCl、Na2CO3、NaHCO3均為分析純；牛血清蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品，BCA蛋白定量試劑盒。

1.2 主要儀器與設(shè)備

260型液壓榨油機(jī)，F(xiàn)L-S2017型十八油坊榨油機(jī)，ALPHA 2-4LDplus型凍干機(jī)，Milli-Q Integral型超純水機(jī)，Q-250A3型高速多功能粉碎機(jī)，Universal 320R通用型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，Synergy 2型多功能酶標(biāo)儀，L8900型全自動(dòng)氨基酸分析儀，Agilent 7900型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，SHIMADZU GC-2010PlusAFAPC氣相色譜儀，Milestone型微波消解儀等。

1.3 方法1.3.1 火麻仁油和粗蛋白制備

火麻仁油制備：分別采用熱榨和冷榨方法榨油。熱榨采用的是螺旋式榨油法，榨油溫度為255 ℃；冷榨為液壓榨油法，榨油溫度為50 ℃。稱取3批不同產(chǎn)地(山西、陜西、黑龍江)火麻仁各1 kg，分別用冷榨和熱榨2種方式進(jìn)行榨取，所得油為火麻仁毛油，油渣為火麻仁粕。

(1)

火麻仁粗蛋白制備：稱取火麻仁粕粉5 g，按照1∶20料液比加入100 mL超純水，用NaOH調(diào)節(jié)pH 10.0，溫度為50 ℃，水浴1 h。4 000 r/min離心10 min，在pH 5.0條件下酸沉1 h。用純水洗滌凝乳至pH 7.0左右，4 000 r/min離心20 min，沉淀冷凍干燥，即為火麻仁粗蛋白。

(2)

1.3.2 火麻仁油、粕和蛋白質(zhì)基本組成測定

火麻仁油脂肪酸含量測定：用水解-提取法原理，參照GB 5009.168—2016 第三法。

火麻仁粕蛋白質(zhì)含量測定：用凱氏定氮原理測定，參照GB 5009.5—2016 第一法。

火麻仁蛋白氨基酸含量測定：稱適量樣品置于水解管，加2 mL 6 mol/L HCl，充氮，110 ℃水解22 h。冷卻后取200 μL蒸干，加0.02 mol/L HCl溶解，稀釋成與標(biāo)樣近似濃度，15 000 r/min離心15 min，取上清液上機(jī)測試。將氨基酸混合溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)取50 μL，以0.02 mol/L HCl稀釋成500 μL溶液，制備得氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量均為20 μL。離子交換樹脂柱溫57 ℃，流速為0.4 mL/min；茚三酮反應(yīng)柱反應(yīng)溫度為135 ℃，流速為0.35 mL/min；檢測波長570 nm和440 nm；樣品分析時(shí)間為50 min。用外標(biāo)法測定樣品氨基酸含量。

1.3.3 蛋白含量測定

蛋白含量采用BCA法測定：使用酶標(biāo)儀測定吸光度，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品，分別稀釋成0、0.025、0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5 mg/mL共8個(gè)梯度繪制蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程。

1.3.4 火麻仁蛋白提取工藝考察

火麻仁蛋白提取流程：火麻仁粕粉碎→堿溶液提取→過濾，離心→上清液酸沉→離心→純水洗滌沉淀→離心→沉淀冷凍干燥→火麻仁粗蛋白。

1.3.4.1 等電點(diǎn)測定

稱取火麻仁粕粉末50 g，按照1∶20的料液比加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖溶液，60 ℃水浴1 h，過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。取上清液各30 mL，用HCl調(diào)pH分別至4.0～6.0，設(shè)置梯度為0.2。在8 000 r/min，4 ℃，10 min離心，以上清液BCA法反應(yīng)的吸光度為指標(biāo)，得到火麻仁蛋白等電點(diǎn)。

1.3.4.2 提取pH對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，分別加入pH為9、10、11、12、13、14的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，按照1∶20料液比，40 ℃，40 min水浴。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計(jì)算蛋白提取率。

1.3.4.3 提取時(shí)間對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，按照1∶20料液比，40 ℃水浴，水浴時(shí)間分別為20、30、40、50、60 min。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計(jì)算蛋白提取率。

1.3.4.4 提取溫度對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，按照1∶20料液比，水浴50 min，水浴溫度分別為30、40、50、60、70 ℃。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計(jì)算蛋白提取率。

1.3.4.5 液料比對蛋白得率的影響

稱取火麻仁粕粉5 g，按照10、15、20、25液料比，加入pH 10的Na2CO3-NaHCO3緩沖液，40 ℃，水浴50 min。過濾，取濾液，8 000 r/min，10 min，4 ℃離心。上清液用100 mL容量瓶定容，BCA法測蛋白含量，計(jì)算蛋白提取率。

2 結(jié)果與分析

2.1 火麻仁油出油率和粗蛋白得率

采用BCA法測定BSA標(biāo)準(zhǔn)液濃度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.256 6x+0.075 1(R2=0.995 7)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算粗蛋白的蛋白純度。

(3)

表1結(jié)果顯示，熱榨法出油率略高于冷榨法，但未形成顯著差異(P>0.1)；通過堿提酸沉法提取的冷榨火麻仁粕粗蛋白提取率為11.38%，顯著高于熱榨火麻仁粕(P<0.001)，冷榨粕粗蛋白提取率為熱榨粕粗蛋白提取率的5.1倍；冷榨粕蛋白純度略高于熱榨粕蛋白(P<0.01)。

表1 不同榨油方式對火麻仁油及蛋白得率影響

2.2 脂肪酸和氨基酸組成

2.2.1 脂肪酸組成

由表2可知，冷榨火麻仁油含脂肪酸(85.19±3.99)%，熱榨火麻仁油脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(85.49±5.16)%，2種榨油方式所得火麻仁油中均含有3種不飽和脂肪酸和6種飽和脂肪酸，脂肪酸的種類及含量無明顯差異(P>0.1)。火麻仁油中含有大量亞油酸、亞麻酸類不飽和脂肪酸，占火麻仁油質(zhì)量的77.43%；亞油酸和亞麻酸含量比例接近3∶1。

表2 火麻仁油脂肪酸成分

2.2.2 氨基酸組成及營養(yǎng)評價(jià)

受到氨基酸含量測量方法的影響，采用酸水解法測定時(shí)，谷氨酰胺和天冬酰胺會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)化，可能變?yōu)楣劝彼岷吞於彼?，色氨酸?huì)完全破壞[14]。2種方式所得粕中提取所得蛋白的氨基酸種類相同，谷氨酸含量最高，精氨酸次之；冷榨粕必需氨基酸含量顯著高于熱榨粕(P<0.001)。谷氨酸占冷榨蛋白中氨基酸總量的17.64%，熱榨蛋白氨基酸總量的22.91%；熱榨粕中谷氨酸和精氨酸的比例提高，可能是高溫使蛋白中某些熱不穩(wěn)定氨基酸發(fā)生破壞，引起谷氨酸含量相對升高；冷榨蛋白中蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸和賴氨酸6種必需氨基酸的比例高于熱榨蛋白(見表3)。

表3 不同榨油方式對氨基酸組成影響

火麻仁蛋白的氨基酸營養(yǎng)評價(jià)方法，按照FAO/WHO提出的氨基酸營養(yǎng)模式進(jìn)行評價(jià)[15]，指標(biāo)按照式(4)～式(6)計(jì)算。

必需氨基酸比值(RAA)=

(4)

氨基酸比值系(RCAA)=

(5)

氨基酸比值系數(shù)分值(SRC)=100-CV×100

(6)

式中：CV為RCAA的變異系數(shù)，CV=標(biāo)準(zhǔn)差/均值。

RCAA值越接近1，越符合FAO /WHO氨基酸模型；SRC越接近100，說明該蛋白質(zhì)營養(yǎng)價(jià)值越高。由表4數(shù)據(jù)可得，除蛋氨酸和半胱氨酸外，冷榨蛋白和熱榨蛋白的必需氨基酸均接近FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)氨基酸模式；根據(jù)RAA和RCAA數(shù)值由式(6)計(jì)算可得：冷榨蛋白SRC為72.73，熱榨蛋白SRC為80.28，熱榨蛋白的營養(yǎng)價(jià)值略高于冷榨蛋白；冷榨蛋白中苯丙氨酸和酪氨酸的必需氨基酸比值顯著高于標(biāo)準(zhǔn)模式，為冷榨蛋白的優(yōu)勢氨基酸。

表4 不同榨油方式對必需氨基酸比值和比值系數(shù)的影響

2.3 火麻仁蛋白提取工藝考察

2.3.1 等電點(diǎn)測定

從圖1可以看出，在pH 4.0～6.0范圍內(nèi)，火麻仁蛋白濃度隨pH的增高，先降低后升高，在pH為4.4～4.8時(shí)濃度最低。

圖1 火麻仁蛋白等電點(diǎn)

2.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)考察

從圖2可以看出，在pH 9～14范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨pH的增高，先增加后降低，在pH 10時(shí)提取率達(dá)到最大；在提取時(shí)間20～60 min范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨提取時(shí)間增長先增加后趨于穩(wěn)定，提取時(shí)間達(dá)到50 min后，提取率趨于穩(wěn)定；在30～60 ℃范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨提取溫度的增加而增高，50 ℃的提取率達(dá)到最高，溫度高于50 ℃后提取率降低，并逐漸趨于穩(wěn)定；在10、15、20、25的液料比范圍內(nèi)，火麻仁蛋白提取率隨液料比增加而增高，20的液料比提取率達(dá)到最高；液料比高于20后提取率降低。故選擇pH 9.5、10.0、10.5，時(shí)間45、50、55 min，提取溫度45、50、55 ℃，液料比15、20、25作為正交實(shí)驗(yàn)的較優(yōu)水平。

圖2 不同pH、提取時(shí)間、溫度、液料比對蛋白提取率的影響

2.3.3 正交實(shí)驗(yàn)

由單因素實(shí)驗(yàn)可知，溫度(A)、提取pH(B)、時(shí)間(C)、料液比(D)對火麻仁蛋白提取率均有影響，故選擇4個(gè)因素進(jìn)行3水平考察，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)(見表5)。

表5 L9(34)正交表

對火麻仁蛋白提取影響較大的因素為pH>時(shí)間>料液比>溫度。最佳提取條件為溫度60 ℃，pH為10.5，提取時(shí)間50 min，料液比1∶15。在此條件下蛋白提取率為(20.87±3.16)%。

3 討論

3.1 液壓冷榨法更有利于火麻仁資源的利用

火麻仁油制備方法有溶劑浸出法、超臨界萃取法、水酶法和壓榨法。溶劑浸出法采用有機(jī)溶劑提取，出油率高但可能有溶劑殘留，存在食品安全隱患，且榨油剩余的火麻仁粕無法再次利用；超臨界萃取法得到的火麻仁油質(zhì)量好但設(shè)備成本高；水酶法出油率低且酶成本高，均不適于大規(guī)模工業(yè)化火麻仁油的制備[16]。壓榨法工藝和設(shè)備簡單，操作簡易，是目前工業(yè)常用的榨油方法；壓榨法又可根據(jù)榨油條件，分為熱榨法和冷榨法[17]。熱榨法需要將油料提前蒸或炒制，或高溫螺旋壓榨；冷榨法不經(jīng)過炒或蒸制，且整個(gè)榨油溫度不高于60 ℃[18]。

本研究同時(shí)考察了冷榨和熱榨兩種方式對火麻仁油和后繼蛋白得率和質(zhì)量的影響，結(jié)果表明冷榨和熱榨對火麻仁油得率和脂肪酸組成無顯著影響。冷榨粕粗蛋白提取率和純度顯著高于熱榨粕，必需氨基酸含量更高；盡管熱榨蛋白的氨基酸評分更接近標(biāo)準(zhǔn)模式，但冷榨蛋白的提取率和純度均顯著高于熱榨蛋白。其原因可能是熱榨中使用高溫使蛋白變性程度高，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，尤其是11S蛋白，導(dǎo)致堿提中可溶性氮含量減少，整體提取率降低[19]。液壓冷榨法能夠最大程度利用火麻仁，得到更多火麻仁副產(chǎn)品，兼顧火麻仁油和火麻仁蛋白的產(chǎn)品特性，是適合火麻仁的壓榨方法，能夠滿足火麻仁資源的多環(huán)節(jié)利用。

3.2 堿提酸沉法可用于火麻仁蛋白的提取

與常用的NaOH體系相比，緩沖液作為火麻仁蛋白提取溶劑能夠穩(wěn)定蛋白溶解時(shí)引起的pH變化，保證提取效率，具有重復(fù)性和穩(wěn)定性。本研究在前期對比考察了NaOH和NaH2PO4-Na2HPO4緩沖體系，前者提取率不穩(wěn)定，后者提取率較低。也有學(xué)者用超聲輔助堿法提取，雖可提高火麻仁蛋白得率，但也存在工業(yè)化推廣問題[20]。

3.3 火麻仁油和火麻仁蛋白可作為高附加值產(chǎn)品開發(fā)

《中國居民膳食脂肪適宜攝入量》建議亞油酸和亞麻酸攝入比例為(4～6)∶1，嬰兒和老年人建議4∶1。常見植物油大豆油的比例為8∶1，橄欖油為10∶1，火麻仁比例接近3∶1[21]?；鹇槿视湍軡M足人體脂肪酸攝入的健康需求，尤其有益于嬰兒和老年人食用，可作為一種新的食用油開發(fā)。此外，火麻仁榨油后的油粕可用于提取火麻仁蛋白，具有抗氧化、降壓[22]、乙酰膽堿酯酶抑制[23]等活性，在治療高血壓、阿爾茨海默癥方面具有極大的開發(fā)潛力，已有火麻仁蛋白類飲料投放于市場。深入對火麻仁蛋白的應(yīng)用研究，可作為植物蛋白的有力補(bǔ)充，同時(shí)可減少資源浪費(fèi)。本研究基于火麻仁資源多環(huán)節(jié)利用，立足于產(chǎn)品開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，從火麻仁油的制備到粕的再利用，建立火麻仁資源綜合利用方法，實(shí)現(xiàn)多鏈條產(chǎn)品共同開發(fā)的目的，對火麻仁資源產(chǎn)品多維度開發(fā)具有一定的借鑒意義。

4 結(jié)論

對火麻仁油得率和脂肪酸組成、火麻仁蛋白得率和氨基酸組成作為綜合指標(biāo)進(jìn)行考察，并采用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行火麻仁蛋白提取工藝優(yōu)化。結(jié)果表明，冷榨和熱榨對火麻仁油得率和脂肪酸組成無顯著影響，火麻仁油中含有大量不飽和脂肪酸，以亞油酸和α-亞麻酸為主，亞油酸和亞麻酸含量比例接近3∶1，占總脂肪酸質(zhì)量的87%左右，還含有少量γ-亞麻酸。堿提酸沉法提取冷榨粕粗蛋白提取率為11.38%，純度為79.67%；熱榨粕提取率為2.23%，蛋白純度為67.33%。冷榨粕中必需氨基酸占總氨基酸的29.87%，熱榨粕中必需氨基酸占總氨基酸的23.93%，冷榨粕粗蛋白提取率和純度顯著高于熱榨粕，必需氨基酸含量更高；盡管熱榨蛋白的氨基酸評分更接近標(biāo)準(zhǔn)模式，但冷榨蛋白的提取率和純度均顯著高于熱榨蛋白。對火麻仁蛋白提取影響較大的因素依次為pH、時(shí)間、料液比、溫度；優(yōu)化后提取條件為溫度60 ℃，pH為10.5，提取時(shí)間50 min，料液比1∶15，在此條件下蛋白提取率為(20.87±3.16)%。