張宏興，王 原，王 強，朱萬斌，張 磊，宋宇軒

(1.陜西省畜牧技術(shù)推廣總站，陜西 西安 710000；2.寶雞市畜牧獸醫(yī)中心，陜西 寶雞 721000；3.安塞區(qū)畜牧獸醫(yī)服務中心，陜西 延安 717400；4.金昌市畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣服務中心，甘肅 金昌 737100；5.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

布魯氏菌病(Brucellosis)，簡稱布病，病原為革蘭氏陰性、兼性細胞內(nèi)寄生的布魯氏菌()，人畜共患，是中國法定的二類動物疫病。母畜感染布魯氏菌的主要臨床癥狀是流產(chǎn)，其次是早產(chǎn)、死胎或弱胎；有些母畜會發(fā)生子宮炎或膿腫導致生育能力下降、產(chǎn)乳量下降，有的還會發(fā)生關(guān)節(jié)炎和滑囊炎而導致跛行。公畜患病后主要表現(xiàn)為睪丸炎和副睪炎，后肢麻痹導致運動障礙。對人具有感染性和侵襲力的是羊、豬、牛和犬源布魯氏菌，其中羊源布魯氏菌()感染占90%以上，人感染布魯氏菌病呈全身性發(fā)熱性疾病，可導致骨關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎和神經(jīng)紊亂。

針對布魯氏菌的診斷主要有病原學、血清學和核酸檢測方法，其中病原學檢測是布魯氏菌病診斷的“金標準”，但布魯氏菌的分離培養(yǎng)對實驗人員和實驗環(huán)境有一定的要求，需要經(jīng)過生物安全培訓和有資質(zhì)的專業(yè)技術(shù)人員在BSL-2(Biosafety Level 2 Laboratory)級以上的實驗室操作，因此該法不適于普遍應用。與病原學方法相比，血清學檢測是中國當前最普遍的診斷方法，包括虎紅平板凝集實驗(rose-bengal plate agglutination test，RBT)、試管凝集實驗(standard tube agglutination test，SAT)、全乳環(huán)狀實驗(protocol of milk ring test，MRT)、補體結(jié)合實驗(complement fixation test，CFT)、酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immuonsorbant assay，ELISA)和膠體金免疫層析技術(shù)(colloidal gold immunochromatography，GICA)等。隨著分子生物學和基因組學的快速發(fā)展，越來越多的學者開始研究布魯氏菌的核酸檢測技術(shù)，主要包括普通PCR(polymerase chain reaction)、多重PCR和實時熒光定量PCR(real-time fluorescence qPCR)。其中實時熒光定量PCR技術(shù)因其特異性強、靈敏度高、用時較短且能對DNA含量進行實時定量等優(yōu)勢，已逐漸成為研究熱點。

實時熒光定量PCR技術(shù)的發(fā)展應用已較為成熟，但運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測羊布魯氏菌的技術(shù)體系尚不成熟，主要原因在于選擇檢測的基因序列。本研究基于對NCBI數(shù)據(jù)庫中布魯氏菌的基因組數(shù)據(jù)進行分析，比對不同種屬來源的布魯氏菌基因組，篩選羊源布魯氏菌共有和特有基因序列，以期為羊布魯氏菌的PCR精準檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 羊布魯氏菌基因組信息

登錄NCBI(National Center for Biotechnology Information，NCBI)網(wǎng)站，選擇“Genome”，輸入羊布魯氏菌參考基因組名稱()，點擊list查找完整信息，篩選完整基因組并下載，以bv.1 str.16M菌株為參考。

1.2 羊布魯氏菌共有和特有基因分析

以羊布魯氏菌中均存在的同源基因作為共有基因(core gene)，獲取core gene使用軟件cd-hit(v4.6.1版本)。去掉共有基因后，得到非共基因(dispensable gene)，所有非共基因與共有基因合并作為泛集(pan gene)。將共有基因序列與NT數(shù)據(jù)庫(Non-Redundant Nucleotide Sequence Databaset)使用軟件blastn(版本號為2.2.30+；參數(shù) evalue 1e-5，identify>60%，其它默認)進行比對，篩選羊布魯氏菌特有基因(specific gene)。其中共有基因(core gene)和特有基因(specific gene)很可能與羊種布魯氏菌的共性和特性相對應，可以作為羊種布魯氏菌間功能差異研究依據(jù)。

1.3 羊布魯氏菌致病基因篩選

登錄VFDB數(shù)據(jù)庫(http://www.mgc.ac.cn/VFs/download.htm，2019.08.02)，下載VFDB_setB_pro.fas VFDB_setB_pro.fas和VFDB_setB_nt.fas兩個序列文件。致病性分析使用軟件blastp(v2.2.30+)，比對獲取結(jié)果，篩選比對率大于95%的致病基因信息(參數(shù)evalue 1e-5，其它默認)。

2 結(jié)果與分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得67株羊布魯氏菌基因組，共有3 699個基因(圖1A)，經(jīng)過BLAST比對后得到羊布魯氏菌共有基因2 850個(圖1B)，非共有基因849個(圖2)，分布在41個菌株上，其中SAMN12917484含有63個非共有基因，SAMN12917575含有58個非共有基因。其中26株未篩選到非共有基因，可能為不同研究者上傳的相同羊布魯氏菌菌株導致。

圖1 67 株羊種布魯氏菌所有基因和共有基因溶解曲線圖

圖2 67株羊種布魯氏菌的非共基因聚類分析

物種越多共有基因數(shù)目越少并趨于穩(wěn)定，最后保留的基因應具有同源性，且高度保守。在過濾去除部分與近緣物種同源性較高、致病性未注釋到的261個基因之后，獲得2 589個共有基因用于進一步分析，將得到的2 589個共有基因核酸序列同Nt庫比對，并未找到特有基因，可能由于不同菌株間親緣性密切，基因序列高度相似導致。同時，對2 589個共有基因進行致病性注釋，共篩選到可能的8個致病序列，注釋到6個基因上，分別為(flagellar motor switch protein FliM，SAMN02603416001957)、(acyl carrier protein，SAMN02603416002347)、(flagellar motor switch protein FliN，SAMN026034 16002460)、(proline racemase family protein，SAMN 02603416000151)、(flagellar biosynthetic protein，SAMN02603416000165)、(flagellar motor switch protein FliN，SAMN02603416000166)、(flagellar type III secretion system pore protein FliP，SAMN0260 3416001111)、(flagellar motor switch protein FliN，SAMN02603416001145)(表1)。

表1 羊布魯氏菌共有的8個致病基因信息

3 討 論

關(guān)于鞭毛的研究通常建立在細菌運動性的基礎(chǔ)上，而布魯氏菌并無運動特征也是布魯氏菌一直以來被認為無鞭毛的原因之一。2005年Freti從羊種布氏菌獲得的全細胞提取物進行蛋白質(zhì)印跡分析，在布魯氏菌指數(shù)增長期早期檢測到布魯氏菌鞭毛鉤蛋白FliE和鞭毛蛋白FliC的表達，后來又陸續(xù)有學者發(fā)現(xiàn)布魯氏菌具有趨化基因外所有鞭毛結(jié)構(gòu)基因，并且在透射電鏡下觀察其鞭毛屬單一極性鞭毛，同副溶血弧菌一樣在鞭毛表面包裹著一層鞘膜，有研究發(fā)現(xiàn)此鞭毛與布魯氏菌毒力相關(guān)，并在布魯氏菌持續(xù)感染中有不可或缺的意義。FliM、FliN(Flagellar motor switch protein)是形成鞭毛馬達旋翼開關(guān)復合物(C環(huán))的3種蛋白質(zhì)(FliG、FliN、FliM)中的1種，作為馬達的轉(zhuǎn)子(rotor)位于基底體的基部。另外，F(xiàn)lhB是形成鞭毛基部桿狀結(jié)構(gòu)所必需的一種蛋白，F(xiàn)liP是鞭毛Ⅲ型分泌系統(tǒng)孔蛋白，目前對其在布魯氏菌中的功能研究較少。烯脂酰ACP還原酶是細菌脂肪酸合成的關(guān)鍵酶之一，已經(jīng)作為新型抗菌藥物的作用靶標，用于新的抗菌藥物的篩選。流產(chǎn)布氏桿菌同時擁有2個同種類型的烯脂酰ACP還原酶，但是其在布魯氏桿菌致病性方面的功能有待進一步的研究。ProR家族中的PrpA是編碼脯氨酸消旋酶蛋白A或羥脯氨酸-2-差向異構(gòu)酶蛋白的基因，可使B細胞數(shù)量增加以及增強特異性抗體應答，而這些抗體又能促進細胞的感染，且布魯氏菌以prpA依賴方式在感染過程的急性期，改變INF-γ、IL-10、TGFβl和TNFa的細胞因子水平。

4 結(jié) 論

布魯氏菌是對人畜健康和公共衛(wèi)生安全能夠造成較大威脅的病原，且由于中國畜牧業(yè)發(fā)展規(guī)模龐大、部分區(qū)域人畜接觸較為密切等因素存在，須對該病嚴加防控。當前對于該病的診斷方法尚不夠準確，各方面的研究仍需加強。本研究通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中67株羊布魯氏菌()菌株基因組信息的分析比對，獲得羊布魯氏菌共有的6個致病基因及其序列，可為羊布魯氏菌PCR的精準檢測提供重要參考。