吳雙虎，侯金星，江 悅，朱俊儒，韋 唯，劉淑娟，夏樹立，韓 靜，安小鵬

(1.三原縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 三原 713800；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物工程分院，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4.渭南市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，陜西 臨渭區(qū) 714000；5.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300112)

泌乳性狀是奶山羊產(chǎn)業(yè)的重要經(jīng)濟(jì)性狀。中國是世界上奶山羊存欄數(shù)最多的國家，但奶中乳蛋白較低，影響了奶制品的質(zhì)量。因此，為了滿足消費(fèi)者對(duì)高質(zhì)量乳制品的需求，急需解析奶山羊乳蛋白合成的分子機(jī)理，以期快速提高羊乳制品的質(zhì)量。

乳腺由乳腺上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞組成。乳腺上皮細(xì)胞具有合成、分泌乳汁的功能。泌乳是一個(gè)十分復(fù)雜的過程，與乳腺導(dǎo)管的正常發(fā)育、體內(nèi)激素水平等多種因素密切相關(guān)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA與多種細(xì)胞的免疫應(yīng)答、增殖、凋亡、異化、侵襲等多種生物進(jìn)程有著密不可分的聯(lián)系。Zhu等研究發(fā)現(xiàn)，miR-8516可以通過調(diào)控斯鈣素2(Stannio calcin 2,2)的表達(dá)促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞β-酪蛋白及甘油三酯的分泌。

依賴鈉的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(The sodium-dependent bicarbonate transporter，SLC4A8)可調(diào)節(jié)鈉和碳酸氫鹽的運(yùn)輸以交換氫化物，同介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路并參與多種生理過程。溶質(zhì)載體4(The solute carrier 4，SLC4)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族由陰離子交換體(SLC4A1-3和SLC4A9)、Na偶聯(lián)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC4A4和SLC4A5)、電中性Na/碳酸氫鹽共轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC4A7和SLC4A10)和電中性Na驅(qū)動(dòng)的碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體(SLC4A8)組成。這些SLC4蛋白作為第二信使、脂質(zhì)、結(jié)合蛋白、自動(dòng)調(diào)節(jié)域等調(diào)節(jié)因子在運(yùn)輸CO、多種上皮細(xì)胞運(yùn)輸以及細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)具有廣泛而重要的生理作用。碳酸氫鹽是維持人體的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)主要緩沖物質(zhì)之一，因此在生長發(fā)育過程中SLC4蛋白會(huì)得到廣泛表達(dá)，基因發(fā)生突變時(shí)則會(huì)影響骨骼、胰腺、大腦、腎臟、心臟、甲狀腺和肺等器官的生長發(fā)育和功能。

研究表明SLC4A8主要分布于大腦、心臟和睪丸。目前SLC4A8在乳腺上皮細(xì)胞中的功能作用尚不清楚。實(shí)驗(yàn)室前期通過對(duì)低泌乳期(產(chǎn)后2 d)、泌乳高峰期(產(chǎn)后90 d)和干奶期(產(chǎn)前7 d)的3只薩能奶山羊的乳腺組織進(jìn)行高通量測序，根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果篩選出泌乳高峰期差異高表達(dá)的Chi-miR-8516并且已驗(yàn)證48為其靶基因。本試驗(yàn)首先在體外合成si-SLC4A8，并將其轉(zhuǎn)染至奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，通過CCK-8，EdU試驗(yàn)，RT-qPCR，Western blot，ELISA檢測等方法，探究si-SLC4A8對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳功能的作用，為闡明乳腺上皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

本試驗(yàn)所用的乳腺組織采自陜西省扶風(fēng)縣某奶山羊養(yǎng)殖場，用PBS將乳腺組織沖洗3次后放入已經(jīng)滅菌并加有青霉素(100 μg/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)的PBS溶液中，用組織塊培養(yǎng)法貼壁培養(yǎng)乳腺上皮細(xì)胞以備后續(xù)試驗(yàn)。

試劑和試劑盒：RNAiso Plus試劑(TAKARA)、ELISA試劑盒(TG試劑盒和β-casein試劑盒購于mlbio)、CCK-8試劑盒(ZETA)、EdU試劑盒(Beyotime)、高純總RNA快速提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)、熒光定量試劑盒(寶生物工程大連有限公司)、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen)、β-actin Antibody(Beyotime)、SLC4A8 Antibody(BBI)、青霉素和鏈霉素(Gibco)、DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco)、Opti-MEMⅠ(Gibco)、胎牛血清(Gibco)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將奶山羊乳腺上皮細(xì)胞分別培養(yǎng)至6孔板、12孔板、96孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，換用F12培養(yǎng)液培養(yǎng)4 h后，將si-SLC4A8、陰性對(duì)照組NC(negative control)和si-SLC4A8+miR-8516 inhibitor分別轉(zhuǎn)染進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞中。用細(xì)胞轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)液OPTI-MEMI分別孵育Lipofectamine 2000及si-SLC4A8 5 min后，混合后常溫孵育20 min，再將其加入細(xì)胞培養(yǎng)板中放置于37 ℃、5% CO恒溫培養(yǎng)箱中。4 h后將F12培養(yǎng)液更換為含有10%血清細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h或48 h。

si-SLC4A8序列：sense：5'-GCCCUCAGCUUACAGUGUUTT-3'，antisense：5'-AACACUGUAAGCUGAGGGCTT-3'。

miR-8516 inhibitor序列：5'-GGCCUCCGUUGCCCUCAGCC-3'。引物均合成于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。

1.3 RT-qPCR

將1.2中所述處理的12孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用RNAiso Plus試劑按照試劑盒說明書提取各處理組和對(duì)照組細(xì)胞中的RNA。用20 μL反應(yīng)體系(10 μL eaction solution，4 μL 5×Prime Script Buffer，1 μL rime Script RT Enzyme Mix I和1 μL RT Prime Mix，加滅菌水至20 μL)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，反轉(zhuǎn)錄程序?yàn)椋?7 ℃ 15min，85 ℃ 5 s，4 ℃保存。

之后進(jìn)行RT-qPCR，其反應(yīng)體系為：12.5 μL latinum RTS SYBR Super Mix，48基因和內(nèi)參基因β-actin的實(shí)時(shí)定量引物的上游引物F、下游引物R各1 μL，1 μL cDNA模板，加滅菌水至20 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性15 s，退火溫度為60 ℃，退火時(shí)間20 s，72 ℃延伸20 s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。

48基因的實(shí)時(shí)定量引物如下：

F：5'-CCAGCAGATCACAGCCGTCATC-3'；R：5'-ATCAGCAGGTCCAGGTGGTAGC-3'；內(nèi)參基因-的實(shí)時(shí)定量引物如下：

F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'。

試驗(yàn)結(jié)果以-作為內(nèi)參進(jìn)行處理，用2分析48 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 Western blot

根據(jù)1.2中所述處理6孔板中的細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞中的總蛋白。具體操作：收集細(xì)胞，棄去原培養(yǎng)液后用PBS清洗3遍，胰酶充分消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清液，留細(xì)胞沉淀，向每管沉淀中加300 μL蛋白裂解液和3.0 μL的蛋白酶抑制劑，在4 ℃放置30 min，后12 000 r/min、4 ℃離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中，加入蛋白上樣液，沸水煮6～8 min獲取細(xì)胞總蛋白。

進(jìn)行SDS-PAGE電泳，先80 V電泳30 min，再換成120 V繼續(xù)電泳至樣品中溴酚藍(lán)遷移到分離膠最下端。將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜，冰浴，300 mA、80 V電泳1.5 h。轉(zhuǎn)膜完成后用脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，1×TBST緩沖液洗3次，每次10 min。接著按照1∶1 000的稀釋比例進(jìn)行一抗孵育，4 ℃過夜孵育或室溫?fù)u床上孵育4 h，接著用1×TBST緩沖液漂洗3次，每次10 min，按照一抗稀釋的方法稀釋二抗，室溫?fù)u床上孵育2 h，用1×TBST緩沖液漂洗3次后即可進(jìn)行分析顯影和灰度分析。

1.5 細(xì)胞活力檢測(CCK-8)

根據(jù)1.2中所述處理96孔板中的細(xì)胞，24 h后依照CCK-8試劑盒中的使用說明書，在每孔中加入15 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后在520 nm波長下用酶標(biāo)儀讀取到各孔的吸光值(A)，用以計(jì)算細(xì)胞的增殖率。

1.6 細(xì)胞增殖情況檢測(EdU)

根據(jù)1.2中所述處理96孔板中的細(xì)胞24 h后，根據(jù)EdU試劑盒說明書，每孔加入50 μmol/L EdU培養(yǎng)基100 μL，培養(yǎng)2 h后用PBS清洗2～3次，加入50 μL細(xì)胞固定液，室溫孵育15 min后去除固定液，每孔加入1×Apollo染色反應(yīng)液100 μL，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后棄染色反應(yīng)液，加入100 μL滲透劑，脫色搖床孵育10 min后用100 μL甲醇清洗2～3次，再用PBS清洗2～3次；每孔加入100 μL 1×Hoechst 33342反應(yīng)液，避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后棄染色反應(yīng)液，PBS清洗3次；加入100 μL DAPI溶液(1 μg/μL)，室溫避光孵育15 min，PBS清洗3次，熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.7 ELISA

根據(jù)1.2中所述處理6孔板中的細(xì)胞，24 h后收集細(xì)胞，按照ELISA試劑盒的使用說明書檢測β-酪蛋白和甘油三酯在奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的合成量。具體實(shí)驗(yàn)步驟詳見說明書。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)處理得到的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，并通過獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的方法分析數(shù)據(jù)的顯著性。三次重復(fù)的數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)表示。差異水平用P值來顯示，<0.05*表示數(shù)據(jù)差異顯著，<0.01**表示數(shù)據(jù)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLC4A8干擾效率檢測

將si-SLC4A8和NC轉(zhuǎn)染進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，通過RT-qPCR和Western blot法分別檢測48在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量，結(jié)果如圖1A所示,si-SLC4A8轉(zhuǎn)染組中48的mRNA含量較NC組極顯著降低(<0.01)，圖1B顯示,si-SLC4A8組的蛋白表達(dá)量較NC組極顯著降低(<0.01)，表明合成的si-SLC4A8干擾效果良好能夠滿足試驗(yàn)要求。

圖1 SLC4A8干擾效率檢測

2.2 si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

為了研究si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，將NC、si-SLC4A8、si-SLCA8+inhibitor分別轉(zhuǎn)染進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，按照CCK-8試劑盒說明書檢測乳腺上皮細(xì)胞增殖能力。結(jié)果如圖2A所示，轉(zhuǎn)染si-SLC4A8組乳腺上皮細(xì)胞增殖率較NC組極顯著降低(<0.01)，轉(zhuǎn)染si-SLC4A8+inhibitor組乳腺上皮細(xì)胞增殖率較si-SLC4A8組極顯著上升(<0.01)。隨后用EdU方法檢測了乳腺上皮細(xì)胞增殖能力，計(jì)算EdU-陽性細(xì)胞數(shù)目在總細(xì)胞數(shù)目中的比例。結(jié)果如圖2B、2C所示，與NC組相比，轉(zhuǎn)染si-SLC4A8后EdU-陽性細(xì)胞比例極顯著下降(<0.01)，EdU結(jié)果與CCK-8結(jié)果均表明si-SLC4A8抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖。

圖2 si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響

2.3 si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯和β-酪蛋白合成的影響

為了研究si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞中甘油三酯和β-酪蛋白合成的影響，將NC、si-SLC4A8和si-SLCA8+inhibitor轉(zhuǎn)染進(jìn)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中，用ELISA試劑盒檢測甘油三酯和β-酪蛋白的含量。結(jié)果如圖3A所示，si-SLC4A8轉(zhuǎn)染組乳腺上皮細(xì)胞中的甘油三酯濃度較NC組極顯著下降(<0.01)。如圖3B所示，si-SLC4A8轉(zhuǎn)染組乳腺上皮細(xì)胞中的β-酪蛋白濃度較NC組極顯著下降(<0.01)，si-SLCA8+inhibitor轉(zhuǎn)染組的β-酪蛋白濃度較si-SLC4A8組極顯著升高(<0.01)。

圖3 si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯(A)和β-酪蛋白(B)合成的影響

3 討 論

miRNAs不僅可以調(diào)節(jié)乳腺干細(xì)胞和祖細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)乳腺導(dǎo)管和腺泡的正常發(fā)育也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，與此同時(shí)乳腺周期性分化和去分化過程中還常常伴隨著乳腺上皮細(xì)胞周期性的增殖和凋亡。試驗(yàn)前期通過高通量測序以及生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，泌乳高峰期的薩能奶山羊乳腺組織中差異高表達(dá)的Chi-miR-8516可以通過PI3K/AKT/mTOR通路促進(jìn)甘油三酯和β-酪蛋白的合成，通過Ras/MEK/ERK通路促進(jìn)山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMECs)的增殖。因此我們設(shè)計(jì)si-SLC4A8試說明48對(duì)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞增殖及泌乳功能的作用，為闡明乳腺上皮細(xì)胞功能的分子機(jī)制提供一定的理論基礎(chǔ)。

山羊奶以乳蛋白、乳脂、乳糖、非脂固型物為主要成分。酪蛋白是山羊奶乳蛋白的主要成分，包括κ-酪蛋白、αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白，占所有蛋白質(zhì)的70%～80%。β-酪蛋白是一種兩親性磷酸蛋白，約占酪蛋白總量的30%，形成的酪蛋白膠束可以攜帶鈣、磷等礦物質(zhì)，且與人的酪蛋白相似，更易被人體消化吸收。而甘油三酯是乳脂的最大組成部分(近98%)，包括大量酯化脂肪酸。而且山羊奶中短鏈和中鏈脂肪酸含量較多，這也有利于更高的消化率和更健康的脂質(zhì)代謝，同時(shí)也是羊奶獨(dú)特風(fēng)味的來源。為研究48對(duì)于乳成分的影響，通過ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)干擾48后乳腺上皮細(xì)胞分泌的甘油三酯和β-酪蛋白顯著下降，表明在乳腺上皮細(xì)胞中48可以促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的甘油三酯和β-酪蛋白的合成。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)與NC組相比，干擾48后乳腺上皮細(xì)胞的活力顯著下降，EdU試驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染si-SLC4A8后抑制細(xì)胞的增殖，表明在乳腺上皮細(xì)胞中48促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的增殖。目前，關(guān)于4家族基因在乳腺方面的功能研究較少，盡管在本研究中證明干擾48后能抑制奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的增殖、乳蛋白和甘油三酯的合成，但是48對(duì)泌乳功能的調(diào)控機(jī)理仍不完善，有待進(jìn)一步研究。

4 小 結(jié)

綜上所述，本試驗(yàn)通過RNA干擾抑制48基因的表達(dá)，采用CCK-8、EdU試驗(yàn)分析了si-SLC4A8對(duì)乳腺上皮細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果表明，干擾48后顯著抑制乳腺上皮細(xì)胞的增殖。ELISA試驗(yàn)表明，干擾48基因后顯著抑制乳腺上皮細(xì)胞中β-酪蛋白和甘油三酯的合成。