陳千思，方 明，李澤鋒，劉金燕，周會(huì)娜，侯建林，李 軍，吳文信，李思軍

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001 2.湖南省煙草公司郴州市公司，湖南省郴州市北湖區(qū)燕泉北路61號(hào) 423000

漂浮育苗技術(shù)具有育苗成本低、質(zhì)量好和產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)，是我國(guó)煙草生產(chǎn)中采用的一種主要育苗方式［1-3］，但該方法存在抗逆抗病性差、苗期延長(zhǎng)和根系發(fā)育遲緩等問題［4］。在我國(guó)南方的部分煙區(qū)，煙苗移栽前后氣溫偏低、光照不足，故這些問題尤為明顯［5］。湘南煙區(qū)在漂浮育苗技術(shù)的基礎(chǔ)上通過長(zhǎng)期實(shí)踐探索發(fā)展出水旱兩段式育苗技術(shù)，該技術(shù)能顯著促進(jìn)烤煙苗期不定根的生長(zhǎng)，提高壯苗率、縮短緩苗期、提高成苗質(zhì)量，還能有效降低倒春寒的低溫天氣對(duì)烤煙苗期生長(zhǎng)的不利影響，提高其在低溫脅迫下的成活率和抗逆性［1，6-8］，在湖南郴州、永州等煙區(qū)得到了大面積推廣。

低溫是限制植物生長(zhǎng)的主要環(huán)境脅迫之一，可導(dǎo)致植物細(xì)胞膜固化，破壞蛋白質(zhì)復(fù)合物的穩(wěn)定性并影響光合作用，導(dǎo)致作物減產(chǎn)［9］。植物通過激活相關(guān)的低溫響應(yīng)基因，調(diào)節(jié)脂質(zhì)組成、糖和可溶性蛋白含量、植物激素水平來適應(yīng)低溫環(huán)境［10-11］。其中CBF轉(zhuǎn)錄因子又稱為脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（Dehydration Responsive Element Binding 1，DREB1），在高等植物冷馴化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［12］。CBF家族成員CBF1～CBF3串聯(lián)排列在擬南芥基因組第4號(hào)染色體的8.7 kb區(qū)域［13］，Maruyama等［14］發(fā)現(xiàn)CBF1基因表達(dá)受低溫脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)CBF1基因的擬南芥植株具有較強(qiáng)的抗凍性。Gilmour等［15］發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CBF3基因的轉(zhuǎn)基因植株具有更高的干旱、鹽和冰凍脅迫耐受性。此外，一些冷誘導(dǎo)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與CBF類似，它們?cè)诘蜏孛{迫下誘導(dǎo)COR基因的表達(dá)，從而提高植物的耐寒性［16］。目前的CBF通路模型為CBF1～CBF3響應(yīng)低溫快速誘導(dǎo)，隨后CBF靶向基因CBF-regulon的表達(dá)發(fā)生改變，抗凍性提高［17］。研究表明，多個(gè)CBF-regulon轉(zhuǎn)錄因子受First wave基因（如HSFC1、ZAT12、ZAT10、ZF和CZF）的誘導(dǎo)，其中HSFC1、ZAT12、ZF和CZF基因可獨(dú)立于CBF途徑啟動(dòng)植物抗低溫應(yīng)答［18］。NtbHLH123轉(zhuǎn)錄因子可激活NtCBF、活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）清除相關(guān)基因（NtAPX、NtSOD和NtCAT）和脅迫應(yīng)答基因（NtLEA5、NtERD10C和NtERD10D），作為抗低溫的正調(diào)節(jié)因子，提高煙草抗凍性［19］。然而，目前水旱兩段式育苗方式提高煙苗抗低溫脅迫能力的分子機(jī)制尚不明確。為此，基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)，系統(tǒng)分析兩種育苗方式（水旱兩段式育苗和漂浮式育苗）煙草CBF和抗冷相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式差異，旨在篩選煙草受低溫響應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，明確兩種育苗方式在低溫脅迫下的響應(yīng)模式差異，為闡明水旱兩段式育苗提高煙草抗低溫能力的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

試劑：EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒（Lot No.RN3802，北京艾德萊生物科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit（Lot No.04897030001）和qRT-PCR試劑 盒FastStart Essential DNA Green Master（Lot No.06924204001）（瑞士羅氏公司）。

儀 器：LightCycler 96實(shí)時(shí) 定 量PCR儀（Lot No.05815916001，瑞士羅氏公司），勁力冷藏柜（Lot No.G1000LSF，中山市勁力冷凍設(shè)備制造有限公司）。

引物合成：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 煙草材料種植

實(shí)驗(yàn)材料按照湖南省煙草公司郴州市公司《烤煙水旱兩段式育苗技術(shù)規(guī)程》［Q/CZYC-J-ZD-JS-02（2018）］和《烤 煙 漂 浮 育 苗 技 術(shù) 規(guī) 程》［Q/CZYC-J-ZD-JS-01（2018）］進(jìn)行育苗。育苗在國(guó)家煙草基因研究中心溫室進(jìn)行，溫度25℃，相對(duì)濕度40%，光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2.2低溫處理和樣品采集

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4組處理（漂浮式育苗、水旱兩段式育苗、冷處理漂浮式育苗、冷處理水旱兩段式育苗），3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)至少6株。每株取頂部的第3和第4片真葉，取樣后液氮速凍，-80℃保存。冷處理流程：在煙苗長(zhǎng)至八葉一心（約60 d）時(shí)，對(duì)煙苗進(jìn)行低溫（模擬冷害）處理，時(shí)長(zhǎng)為3 h，溫度為4℃，相對(duì)濕度為95%，低溫處理后轉(zhuǎn)移至室溫，16 h光照/8 h黑暗交替條件下生長(zhǎng)，不使用化學(xué)調(diào)控劑。

此模塊包括學(xué)校人事檔案信息管理、教學(xué)檔案信息管理、科研項(xiàng)目與成果檔案信息管理、各職能部門相關(guān)政策文件檔案信息管理等子系統(tǒng)。各類檔案數(shù)據(jù)信息都以相對(duì)獨(dú)立又可通過關(guān)聯(lián)字段相互關(guān)聯(lián)的關(guān)系數(shù)據(jù)庫(kù)文件形式存在，其數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)構(gòu)由前述各職能部門的管理信息系統(tǒng)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)時(shí)一并形成，其庫(kù)中數(shù)據(jù)多由前述各子系統(tǒng)運(yùn)行中自動(dòng)歸檔而成，也有部分由本模塊管理員依據(jù)實(shí)情審核后上傳。

1.2.3 煙草中CBF基因家族

根據(jù)文獻(xiàn)［13，20-23］選取擬南芥（Arabidopsis thaliana）CBF基因及其蛋白序列，并參考Zhao等［19］的方法，選取煙草CBF基因及其蛋白序列（ftp：//ftp.solgenomics.net/genomes/Nicotiana_tabacum/）。

利用TBtools軟件（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools/releases）對(duì)獲得的煙草CBF蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.4 煙草中CBF基因系統(tǒng)發(fā)育分析

使用ClustalX V2.0軟件并用其默認(rèn)參數(shù)對(duì)篩選出的煙草CBF基因的氨基酸序列與擬南芥CBF基因的氨基酸序列進(jìn)行CBF蛋白的多序列比對(duì)。

使用MEGA 7.0軟 件，采 用鄰 近 法（NJ，Neighbor-Joining method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，采用p-distance模型，校驗(yàn)參數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1 000，其余均為默認(rèn)參數(shù)。

1.2.5 煙草中CBF基因結(jié)構(gòu)分析

使用在線基因結(jié)構(gòu)顯示軟件Gene Structure Display Server v2.0（GSDS：http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）繪制煙草CBF基因家族基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)顯示圖。利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）在線分析軟件，使用默認(rèn)參數(shù)查詢、分析由煙草CBF基因編碼的蛋白質(zhì)中的保守結(jié)構(gòu)域，使用TBtools軟件繪制保守結(jié)構(gòu)域圖。

1.2.6 煙草中CBF基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

提取CBF基因上游2 000 bp，利用在線工具PlantCARE對(duì)順式作用元件進(jìn)行搜索鑒定（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）［24］。其中，NtCBF1上游序列過短，未開展相關(guān)分析。

1.2.7 煙草中抗冷相關(guān)基因qRT-PCR分析

對(duì)冷處理前后兩種育苗方式煙草中CBF、CBF-regulon相關(guān)基因及非CBF-regulon相關(guān)基因等抗冷相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR分析。將1.2.2節(jié)中采集的樣品用液氮冷凍研磨成粉末，使用植物RNA快速提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA抽提和反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA稀釋至400 ng/μL。選取基因特異引物［19］（表1），利用qRT-PCR方法，取1 μLcDNA用于基因定量分析的模板，用煙草EF1α基因（GenBank ID：NM001326165）作為內(nèi)參，3次技術(shù)重復(fù)。依照qRT-PCR試劑盒說明書的操作步驟和反應(yīng)程序，使用qRT-PCR儀對(duì)抗冷相關(guān)基因進(jìn)行定量分析。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行，并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。利用GraphPad軟件（Version 9.3.0）繪制實(shí)時(shí)柱形圖，并分析顯著性。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

表1 （續(xù)）

2 結(jié)果與討論

2.1 煙草CBF基因家族的結(jié)構(gòu)特征、保守結(jié)構(gòu)域及啟動(dòng)子順式作用元件分析

對(duì)煙草的21個(gè)CBF基因和擬南芥的6個(gè)CBF基因的全長(zhǎng)氨基酸序列進(jìn)行了多重序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明，煙草NtCBF15、NtCBF16、NtCBF17、NtCBF18、NtCBF19、NtCBF20和NtCBF21基因與擬南芥的CBF5和CBF6基因進(jìn)化關(guān)系較近，而其余的煙草CBF基因則與擬南芥CBF1、CBF2、CBF3和CBF4基因進(jìn)化關(guān)系相近（圖1）。為研究煙草CBF基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)，分析了煙草CBF基因家族的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)和保守基序，結(jié)果表明煙草CBF家族成員中除了NtCBF14基因含有一個(gè)內(nèi)含子和兩個(gè)外顯子以外，其余成員均只含有一個(gè)外顯子（圖1）。

比較分析煙草CBF基因的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列，確定蛋白結(jié)構(gòu)域。結(jié)果顯示，煙草CBF基因家族的所有成員均具有Motif 1、Motif 2、Motif 4和Motif 5這些保守的蛋白結(jié)構(gòu)域（圖2），表明煙草CBF基因家族在進(jìn)化過程中較為保守。

圖1 煙草CBF基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹和基因結(jié)構(gòu)Fig.1 Phylogenetic tree and gene structures of NtCBFs

圖2 煙草CBF基因的蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 Protein domains of NtCBFs

對(duì)煙草CBF基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行順式作用元件分析，發(fā)現(xiàn)煙草CBF基因上游啟動(dòng)子區(qū)存在生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)和脅迫響應(yīng)等相關(guān)的順式作用元件，其中光響應(yīng)相關(guān)元件最多，其次為脫落酸響應(yīng)、茉莉酸甲酯響應(yīng)及厭氧誘導(dǎo)等相關(guān)元件。NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8個(gè)基因啟動(dòng)子序列分布有低溫響應(yīng)相關(guān)元件（圖3）。

圖3 煙草中CBF基因啟動(dòng)子順式作用元件Fig.3 Cis-acting elements of CBF promoters in tobacco

2.2 兩種育苗方式下的煙草CBF基因家族的低溫應(yīng)答分析

圖4 冷處理后兩種育苗方式的煙草CBF基因表達(dá)量分析Fig.4 Expression levels of NtCBFs under two seedling cultivation methods after cold treatment

分析低溫處理前后兩種育苗方式下煙草CBF基因家族表達(dá)量的變化（圖4），發(fā)現(xiàn)相較常規(guī)漂浮育苗，水旱兩段式育苗中NtCBF2、NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF9、NtCBF10、NtCBF11、NtCBF12、NtCBF13、NtCBF14、NtCBF20和NtCBF21基因的表達(dá)量顯著提高，表明水旱兩段式育苗中NtCBFs基因表達(dá)量更高；而低溫處理后，相較常規(guī)漂浮育苗，水旱兩段式育苗中NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13基因的表達(dá)量顯著提高，推測(cè)NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13基因可能與水旱兩段式育苗的抗低溫脅迫能力的提高有關(guān)。

2.3 兩種育苗方式下的煙草CBF-regulon基因的低溫應(yīng)答分析

對(duì)煙草CBF-regulon基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在兩種育苗方式下的低溫應(yīng)答進(jìn)行分析（圖5），發(fā)現(xiàn)相較常規(guī)漂浮育苗，水旱兩段式育苗中NtGOLS3和NtRD29A基因的表達(dá)量顯著升高；而低溫處理后，相較常規(guī)漂浮育苗，水旱兩段式育苗中NtGOLS3、NtRD29A和NtRD29B基因的表達(dá)量均顯著升高。推測(cè)水旱兩段式育苗可通過調(diào)控CBF-regulon基因NtGOLS3、NtRD29A和NtRD29B提高水旱兩段式育苗的抗寒能力。

圖5 冷處理后兩種育苗方式的CBF-regulon相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.5 Expression levels of CBF-regulon related genes under two seedling cultivation methods after cold treatment

2.4 煙草非CBF-regulon相關(guān)基因的低溫應(yīng)答分析

對(duì)8個(gè)煙草非CBF-regulon基因在兩種育苗方式下的低溫應(yīng)答進(jìn)行分析（圖6A），發(fā)現(xiàn)水旱兩段式育苗的NtERD10C表達(dá)量比常規(guī)漂浮育苗顯著降低，而其他7個(gè)基因均無顯著差異。同時(shí)，對(duì)5個(gè)First wave基因在兩種育苗方式下的低溫應(yīng)答進(jìn)行分析（圖6B），低溫處理后，水旱兩段式育苗的NtZAT12表達(dá)量比常規(guī)漂浮育苗顯著降低，其他4個(gè)基因均無顯著差異。綜上，未發(fā)現(xiàn)有非CBF-regulon基因表達(dá)量在兩段式育苗中高于常規(guī)漂浮育苗，推測(cè)水旱兩段式育苗抗寒能力的提高可能不依賴于非CBFregulon途徑。

圖6 冷處理后兩種育苗方式的非CBF-regulon相關(guān)基因表達(dá)量分析Fig.6 Expression levels of non-CBF-regulon related genes under two seedling cultivation methods after cold treatment

3 結(jié)論

系統(tǒng)分析21個(gè)煙草CBF基因進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)和啟動(dòng)子的順式作用元件，發(fā)現(xiàn)煙草CBF基因進(jìn)化上相對(duì)保守，可響應(yīng)生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)和脅迫等多種信號(hào)，其中NtCBF3、NtCBF4、NtCBF5、NtCBF6、NtCBF10、NtCBF13、NtCBF14和NtCBF18等8個(gè)基因具有低溫響應(yīng)元件。低溫脅迫下基因表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，煙草NtCBF5、NtCBF12和NtCBF13及CBF-regulon相 關(guān)基因NtRD29A、NtRD29B和NtGOLS3在低溫處理后表達(dá)量顯著升高，在煙草水旱兩段式育苗的抗低溫脅迫過程中發(fā)揮了重要作用。