朱麗穎，陳 凱，汪耀富，李澤鋒，謝小東，潘 婷，楊小年，蒲文宣，曹培健，楊 軍，羅朝鵬*

1.中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2號(hào) 450001 2.湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，長(zhǎng)沙市雨花區(qū)勞動(dòng)中路386號(hào) 410007

二氯喹啉酸是一種生長(zhǎng)素類除草劑，廣泛用于稻田中雜草的防治。由于常年大量使用此除草劑，近年來(lái)在湖南、廣東和江西等煙稻輪作區(qū)陸續(xù)出現(xiàn)煙草二氯喹啉酸藥害問(wèn)題［1-2］。二氯喹啉酸藥害在煙草上的癥狀主要表現(xiàn)為煙葉葉尖和葉緣向葉背卷曲，葉片變厚變窄，嚴(yán)重時(shí)呈線狀葉形。藥害主要發(fā)生在團(tuán)棵至旺長(zhǎng)期。若在煙草團(tuán)棵期前發(fā)生藥害將會(huì)造成煙葉絕收；旺長(zhǎng)期發(fā)生藥害，則會(huì)造成煙葉產(chǎn)量下降。藥害還可造成煙葉品質(zhì)明顯降低，煙葉總糖、還原糖和鉀含量降低，煙堿和淀粉含量明顯提高，煙葉化學(xué)成分不協(xié)調(diào)，工業(yè)可用性降低［2］。因此，煙草二氯喹啉酸藥害已成為影響我國(guó)煙葉生產(chǎn)的重要問(wèn)題之一。

二氯喹啉酸藥害機(jī)制可能與乙烯合成相關(guān)。該藥劑施用后，豬殃殃［3］、馬唐［4］和稗草［5］中乙烯含量均大幅增加，而相應(yīng)的抗性株系乙烯含量卻無(wú)明顯變化。因此通過(guò)抑制乙烯的合成，能夠減輕二氯喹啉酸的藥害癥狀［4-5］。乙烯是一種重要的植物激素，可調(diào)控植物種子休眠、萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、開花、果實(shí)成熟和葉片衰老等生理過(guò)程，在抵御生物和非生物脅迫中乙烯也發(fā)揮重要作用［6］。高等植物乙烯合成起始于甲硫氨酸，在腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase，SAMS）催化下合成S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM），然后在1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthase，ACS）作用下合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC），最后經(jīng)過(guò)ACO催化生成乙烯［7］。因此ACS和ACO是乙烯合成的限速酶［8］。ACO是2-酮戊二酸依賴型雙加氧酶超家族里的一個(gè)小家族，含有2OG-FeII_Oxy（PF03171.15）和DIOX_N（PF14226.1）兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域［9］。現(xiàn)已完成ACO基因家族鑒定的植物有擬南芥、水稻、番茄［8］和棉花［10］等，而煙草ACO基因家族的系統(tǒng)鑒定與分析尚未見報(bào)道。為此對(duì)普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草ACO基因家族進(jìn)行了鑒定，并對(duì)二氯喹啉酸藥害條件下的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，旨在明確煙草二氯喹啉酸藥害的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

以盆栽K326為材料，在5片真葉期進(jìn)行二氯喹啉酸處理，二氯喹啉酸濃度為0.2 mg/kg（75%可濕性粉劑，成都科利隆生化有限公司），每株煙澆灌20 mL二氯喹啉酸溶液，分別在處理2 h、6 h、1 d、7 d和14 d后采集煙草葉片和根組織，以未處理的煙株（澆灌同等體積的清水）為對(duì)照，以0 h表示。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣3株，每株為1次生物學(xué)重復(fù)。

IMAGENE GenePure Plus多糖多酚植物RNA快速提取試劑盒和KEMIX 2×SYBR Green qPCR試劑盒（北京密碼子生物科技有限公司）；AMV反轉(zhuǎn)錄酶［寶生物工程（大連）有限公司］；熒光定量PCR儀（CFX96，美國(guó)Bio-rad公司）。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 煙草ACO基因家族鑒定和基本特征分析

根據(jù)文獻(xiàn)［8］報(bào)道的擬南芥和番茄ACO蛋白序列，搜索煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（BLASTP，Expectation值＜100），將匹配的序列進(jìn)行家族保守結(jié)構(gòu)域分析（http://pfam.xfam.org/），鑒定獲得普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草ACO家族基因。利用在線軟件Compute pI/Mw（http：//www.expasy.ch/tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)。使用WoLF PSORT軟 件（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用MEGAX軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建。其中，多序列比對(duì)使用MUSCLE法；系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建采用鄰接法，以Poisson Model和Pairwise Deletion進(jìn)行分析，Bootstrap檢驗(yàn)設(shè)置為1 000，其他參數(shù)為默認(rèn)。

1.2.3 MicroRNA靶點(diǎn)分析

使用在線數(shù)據(jù)庫(kù)psRNATarget（http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/）進(jìn) 行miRNA靶 點(diǎn) 預(yù) 測(cè)，Expectation值設(shè)置為≤4，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.2.4 啟動(dòng)子分析

用于啟動(dòng)子分析的序列選擇起始密碼子上游2000bp。使用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析。

1.2.5 基因表達(dá)模式分析

根據(jù)普通煙草ACO基因的CDS序列，使用在線軟件Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)要求參考2×SYBR Green qPCR Mix試劑說(shuō)明書。第一鏈cDNA合成以O(shè)ligo（dT）為引物，內(nèi)參基因引物序列為26s-F：5′-GAAGAAGGTCCCAAG GGTTC-3′和26s-R：5′-TCTCCCTTTAACACCAACG G-3′。qPCR引物序列如表1所示，擴(kuò)增程序參考2×SYBR Green qPCR Mix試劑說(shuō)明書。使用2-ΔΔCT法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析［11］。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草ACO家族鑒定及基本特征分析

根據(jù)擬南芥和番茄ACO家族蛋白序列，分別從普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草基因組中鑒定出19、9和10個(gè)ACO家族蛋白，基本特征如表2所示。這些蛋白均含有該家族保守結(jié)構(gòu)域2OG-FeⅡ_Oxy（PF03171.15）和DIOX_N（PF14226.1）。在普通煙草中有15個(gè)ACO基因定位在染色體上，其中7和11號(hào)染色體上的數(shù)量最多，各有3個(gè)。有4個(gè)基因定位在scaffold上。林煙草和絨毛狀煙草基因組未組裝至染色體上。

普通煙草ACO基因外顯子有2～4個(gè)。CDS長(zhǎng)度范圍為888～966 bp，編碼的蛋白長(zhǎng)度為295～321 aa，分子量大小為33.45～36.56 kDa。等電點(diǎn)大小為4.62～6.29。在普通煙草中除Ntab0970910外，其他ACO均定位于細(xì)胞質(zhì)。林煙草ACO外顯子數(shù)為3～4個(gè)。CDS長(zhǎng)度為906～963 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度為301～320 aa，分子量大小為34.33～36.39 kDa，等電點(diǎn)大小為4.82～6.19，林煙草ACO全部定位于細(xì)胞質(zhì)。絨毛狀煙草ACO外顯子數(shù)為1～4個(gè)，CDS長(zhǎng)度為741～966 bp，編碼的蛋白長(zhǎng)度為246～321 aa，分子量大小為28.31～36.56 kDa，等電點(diǎn)大小為4.84～6.68，絨毛狀煙草ACO也全部定位于細(xì)胞質(zhì)。因此，3種煙草ACO幾乎全部定位于細(xì)胞質(zhì)中，與擬南芥等植物上的研究結(jié)果一致［8］。

表2 煙草ACO蛋白家族基本特征Tab.2 Essential characteristics of tobacco ACO family

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用來(lái)源于普通煙草、林煙草、絨毛狀煙草、番茄和擬南芥的50條蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果（圖1）顯示，ACO家族進(jìn)化形成3類，分別為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類，與擬南芥、水稻和番茄［8］的分類結(jié)果相同，但和棉花的分類結(jié)果不同。在棉花中ACO家族進(jìn)化形成4類［10］。在煙草中Ⅰ類成員最多，包括13個(gè)普通煙草ACO，6個(gè)林煙草和7個(gè)絨毛狀煙草ACO。在Ⅲ類中，普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草分別有4個(gè)、2個(gè)和2個(gè)成員。Ⅱ類成員最少，普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草分別只有2個(gè)、1個(gè)和1個(gè)成員。

圖1 煙草ACO蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of tobacco ACO family

2.3 MicroRNA靶點(diǎn)分析

對(duì)普通煙草ACO基因miRNA靶點(diǎn)的分析結(jié)果（表3）顯示，有6個(gè)ACO存在miRNA靶點(diǎn)，其中Ntab0147840含 有nta-miR396a、nta-miR396b、nta-miR396c和nta-miR6144 4個(gè)miRNA的靶點(diǎn)，Ntab0602500含有3個(gè)靶點(diǎn)，Ntab0220520含有2個(gè)靶點(diǎn)，Ntab0182750、Ntab0582680和Ntab0884340各含有1個(gè)靶點(diǎn)。靶點(diǎn)可及性代表了結(jié)合和切割靶位點(diǎn)所需的能量，數(shù)值越低表示miRNA與靶點(diǎn)相互作用的可能性越大［12］。Ntab0182750和nta-miR6020a-5p，Ntab0147840和nta-miR396a、nta-miR396b、ntamiR396c、nta-miR6144間靶點(diǎn)可及性都較低（＜20），因此這5個(gè)靶點(diǎn)和miRNA存在相互作用的可能性很大。

2.4 啟動(dòng)子分析

啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析結(jié)果（表4）顯示，普通煙草ACO含有激素反應(yīng)、低溫反應(yīng)、抗性和脅迫反應(yīng)、損傷反應(yīng)和干旱誘導(dǎo)等不同種類的順式作用元件。激素反應(yīng)包括5種激素10種類型的順式作用元件，其中生長(zhǎng)素反應(yīng)元件為TGA-element、TGA-box和AuxRR-core；赤霉素為GARE-motif、P-box、TATCbox；茉莉酸為CGTCA-motif、TGACG-motif；脫落酸為ABRE；水楊酸為TCA-element。脫落酸反應(yīng)元件ABRE無(wú)論是含有的基因數(shù)量還是元件總數(shù)均最多，有17個(gè)基因共含有38個(gè)ABRE元件。此外，ACO還含有低溫反應(yīng)（LTR）、抗性和脅迫反應(yīng)（TC-rich repeats）、損傷反應(yīng)（WUN-motif）和干旱誘導(dǎo)（MBS）等順式作用元件?？梢?，普通煙草ACO表達(dá)可能受生長(zhǎng)素、赤霉素和茉莉酸等激素調(diào)控，也可能響應(yīng)低溫、干旱脅迫和損傷等。

表3 煙草ACO的miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)Tab.3 Prediction of miRNA target sites of NtACO

表4 普通煙草ACO啟動(dòng)子順式作用元件分析Tab.4 Cis-elements analysis of NtACO promoter

2.5 表達(dá)模式分析

圖2 普通煙草ACO家族表達(dá)分析Fig.2 Expression analysis of NtACO family

相對(duì)表達(dá)分析結(jié)果（圖2）顯示，普通煙草ACO家族所有成員都受二氯喹啉酸誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。其中Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab022 0520 4個(gè)基因上調(diào)幅度最大，分別上調(diào)89、79、65和56倍。在不同組織中比較，大部分基因在葉片中上調(diào)幅度較大，在根系中上調(diào)幅度相對(duì)較小。而Ntab0970910、Ntab0582680、Ntab0141030、Ntab01 47840和Ntab0027650 5個(gè)基因在根系中的表達(dá)量卻高于葉片，特別是Ntab0141030和Ntab0147840在根系中的表達(dá)量顯著高于葉片，其最大表達(dá)量是葉片的1.9和2.9倍。在不同時(shí)間點(diǎn)，有8個(gè)基因在澆灌二氯喹啉酸溶液后24 h時(shí)表達(dá)量最高，6個(gè)基因在藥劑處理后7 d表達(dá)量最高。表達(dá)量最高的4個(gè)基因，最大表達(dá)量均出現(xiàn)在藥劑處理后7 d。

3 討論

在雜草對(duì)二氯喹啉酸抗性機(jī)制中，乙烯生物合成途徑發(fā)揮了關(guān)鍵作用。ACS和ACO是乙烯合成途徑的關(guān)鍵酶。二氯喹啉酸處理后，敏感型無(wú)芒稗（Echinochloa crus-galli var.mitis）2個(gè)ACS和3個(gè)ACO的表達(dá)量提高10倍，乙烯含量增加4.1倍，而無(wú)芒稗抗性生物型的基因表達(dá)量和乙烯含量均增加較少。無(wú)芒稗抗性生物型的乙烯產(chǎn)生量與抗性水平成負(fù)相關(guān)，與生長(zhǎng)抑制成正相關(guān)［13］。使用二氯喹啉酸處理馬唐，馬唐敏感型植株乙烯含量提高3倍，而馬唐抗性生物型植株乙烯含量沒有明顯變化。使用乙烯合成抑制劑進(jìn)行處理，馬唐敏感型的乙烯含量下降了89%，藥害癥狀減輕37%［4］。說(shuō)明通過(guò)抑制ACO表達(dá)，從而抑制乙烯合成，能夠減輕藥害癥狀，增加對(duì)藥害的抗性。本研究中發(fā)現(xiàn)，普通煙草ACO家族所有成員都受二氯喹啉酸誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。其中，Ntab0263610、Ntab0263620、Ntab0220530和Ntab0220520 4個(gè)基因上調(diào)幅度超過(guò)50倍，推測(cè)這4個(gè)基因可能在煙草二氯喹啉酸藥害引起的乙烯合成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

microRNAs（miRNAs）是一類長(zhǎng)度約為18～24 nt的內(nèi)源非編碼RNA，通過(guò)堿基互補(bǔ)的方式降解mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［14-16］。其中，miR396是植物中最保守的miRNA家族，該家族成員數(shù)量多，功能涉及非生物抗性［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR396家族成員miR396b與檸檬的抗寒性相關(guān)，并且miR396b的靶基因是ACO［18］。過(guò)表達(dá)miR396b，靶基因ACO被降解，乙烯合成受到抑制，而檸檬的抗寒性提高。本研究中對(duì)普通煙草ACO潛在的miRNA靶點(diǎn)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Ntab0147840和Ntab0602500中都存在nta-miR396a、nta-miR396b和nta-miR396c 3個(gè)miR396家族成員的靶點(diǎn)，推測(cè)煙草miR396可能通過(guò)調(diào)控Ntab0147840和Ntab0602500的表達(dá)影響乙烯合成，進(jìn)而影響煙草對(duì)非生物脅迫的抗性。這種推測(cè)還需要進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

普通煙草、林煙草和絨毛狀煙草分別含有19、9和10個(gè)ACO家族成員，幾乎所有蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)中。煙草ACO家族進(jìn)化形成三類，Ⅰ類成員最多，Ⅱ類成員最少。普通煙草6個(gè)ACO中含有潛在的miRNA靶點(diǎn)。啟動(dòng)子區(qū)含有激素反應(yīng)、低溫反應(yīng)、抗性和脅迫反應(yīng)、損傷反應(yīng)及干旱誘導(dǎo)等多種類型的順式作用元件。普通煙草ACO家族所有成員均受二氯喹啉酸誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)。