王 妍，趙潤澤，譚 旭，張子微，李 桐，李春琪，郭利偉，楊小林，劉國平

（長江大學(xué)，荊州 434000）

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由冠狀病毒科、冠狀病毒屬的豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，具有高傳染性、高致病性和高死亡率特點。發(fā)病豬以厭食、水樣腹瀉、嘔吐以及脫水為主要癥狀?？砂l(fā)生于任何年齡的豬，年齡越小，癥狀越嚴(yán)重，死亡率越高[1]，成年豬發(fā)病較輕，但可長期隱性帶毒，康復(fù)豬可持續(xù)排毒1～2個月，嚴(yán)重危害我國養(yǎng)豬業(yè)。PED發(fā)病急，傳播速度快，短時間內(nèi)豬場可反復(fù)發(fā)病。1971年P(guān)ED首次報道于英國，之后陸續(xù)在比利時、荷蘭、德國等發(fā)生與流行[2]。2010年開始，PEDV感染出現(xiàn)大面積暴發(fā)[3]。王顥然等[4]統(tǒng)計2008-2018全國18個省市地區(qū)共計6951份樣本，PEDV陽性樣本數(shù)3345份，陽性率為48.12%。徐麗華等[5]對2011-2017年浙江省PEDV流行情況的調(diào)查顯示，PEDV的總陽性率為71.25%（389/546），年均陽性率均為50%以上。段群棚等[6]對2016-2019年廣西部分豬場的PEDV陽性情況進行統(tǒng)計，結(jié)果顯示PEDV的平均陽性率為59.74%。近幾年來，豬流行性腹瀉在我國各地頻發(fā)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失。

PEDV為有囊膜正鏈RNA病毒，基因組全長為28 kb左右。PEDV可編碼20種蛋白（4種結(jié)構(gòu)蛋白和16種非結(jié)構(gòu)蛋白）。其中N蛋白是一種與病毒基因組相關(guān)的磷酸化結(jié)構(gòu)蛋白，大量存在于病毒感染的細(xì)胞中，促使RNA復(fù)制體的形成和病毒組裝，促進病毒的繁殖，在誘導(dǎo)免疫和病毒感染的致病機制中起重要作用[7]。在早期感染PEDV時，宿主體內(nèi)就能產(chǎn)生抗N蛋白高水平的抗體[8]，由于N蛋白高度保守，因此它是用作早期診斷試劑和疫苗開發(fā)抗原的最佳候選蛋白[9-10]。

為進一步了解中國湖北地區(qū) PEDV的流行態(tài)勢以及變異情況，本研究使用反轉(zhuǎn)錄PCR方法對2021年3月至2022年2月收集的來自湖北地區(qū)部分規(guī)?；B(yǎng)豬場的1580份出現(xiàn)腹瀉癥狀的樣品進行PEDV檢測，對12株檢測陽性樣本的N基因部分序列進行擴增和測序，并對變異情況進行分析和預(yù)測，掌握PEDV在湖北地區(qū)的流行特點及變異情況，為有效防控該病提供科學(xué)依據(jù)，為研制安全、有效的PEDV疫苗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品收集 2021年3月-2022年2月，從湖北省部分規(guī)模化豬場收集有流行性腹瀉癥狀病豬的糞便-肛門拭子，共計1580份，其中春季321份、夏季386份、秋季322份、冬季551份。

1.2 主要試劑和儀器 PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自寶日醫(yī)生物（北京）有限公司；瓊脂糖，為Spanish公司產(chǎn)品；Taq-DNA聚合酶、TS-GelRed 核酸凝膠染料、DL-2000 DNA marker，購于擎科生物科技有限公司；AxyPrepTM Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit 試劑盒，購自美國 AXYGEN公司。

1.3 樣品處理及病毒RNA提取 將收集的糞便-肛門拭子樣品存于5 mL無菌離心管中，加入適量的PBS緩沖液浸潤棉拭子頭部，渦旋振蕩，置于恒溫?fù)u床上300 rpm 30 min，取上清液；樣品病毒RNA提取采用Axygen體液提取試劑盒，具體步驟參照試劑盒說明書進行。用Nanodrop1000檢測所提取RNA的濃度和純度，將RNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PEDV病原學(xué)檢測 采用本實驗室建立的巢式RTPCR檢測PEDV的方法（表1），對樣品進行病原學(xué)檢測。檢測引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 對不同日齡段、不同季節(jié)的檢測結(jié)果，采用SPSS 24.0卡方檢驗進行差異性分析，P＜0.05為差異顯著。

1.6 PEDV-N基因測序與序列分析 以巢式PCR的內(nèi)側(cè)引物作為測序引物，將選出的12份PEDV的陽性PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。應(yīng)用DNA Star中的MegAlign軟件將測序正確的PEDV-N基因序列與GenBank上發(fā)表的24條PEDV-N基因參考序列（表2）進行比對分析。利用MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。1.7 PEDV-N蛋白抗原表位預(yù)測 應(yīng)用DNA Star.v7.1中的Protean軟件對N蛋白抗原表位進行預(yù)測分析，對比本研究12份測序序列與經(jīng)典疫苗株CV777和AJ1102的N蛋白抗原表位的差異。

2 結(jié)果

2.1 臨床樣品的檢測結(jié)果 對2021-2022年湖北地區(qū)的規(guī)?；i場收集的1580份臨床樣品進行巢式 RTPCR擴增，共檢測到PEDV陽性樣品318份，樣品總陽性率為20.13%（318/1580），圖1為部分樣品擴增結(jié)果。

圖1 部分樣品擴增結(jié)果Fig.1 Amplification results of some samples

2.1.1 不同日齡階段 對不同日齡段豬群PEDV的感染情況進行分析（表3），0～28日齡的陽性率為40.27%（118/293)，28～70日齡的陽性率為26.89%（135/502)，70～120日齡的陽性率為10.33%（31/300)，120～270日齡的陽性率為8.07%（23/285)，大于270日齡的陽性率為5.50%（11/200）。結(jié)果表明小于70日齡豬群PEDV的檢出率遠(yuǎn)高于其它日齡段，不同日齡段豬群之間PEDV檢出率的差異顯著（P＜0.05），表明PEDV易感群體為0～70日齡，0～28日齡豬最為嚴(yán)重。

表3 不同階段樣品陽性率Table3 Positive rate of samples at different stages

2.1.2 不同季節(jié) 不同季節(jié)PEDV感染情況進行分析（表4），冬季的PEDV檢出率最高為36.66%（202/551），其余依次為春季19.00%（61/321）、秋季11.49%（37/322），最低為夏季4.66%（18/386），不同季節(jié)PEDV檢出率差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，PEDV的感染多發(fā)于冬季，春季和秋季也需加強PEDV的防控。

表4 不同季節(jié)樣品陽性率Table4 Positive rate of samples in different seasons

2.2 PEDV-N基因序列測序及分析

2.2.1 PEDV-N基因的核苷酸同源性比對及分析 將本研究12份測序序列與GenBank上已發(fā)表的26株P(guān)EDV參考毒株的N基因核苷酸序列進行同源性分析，12株測序毒株之間的核苷酸同源性為94.0%～99.7%，氨基酸同源性為93.9%～100.0%；與參考毒株N基因的核苷酸同源性為94.5%～99.8%，氨基酸同源性為94.6%～100.0%（圖2、3）。利用MEGA 7.0軟件中的最大似然法對38份PEDV-N基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖4），系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，PEDV-N基因可分為G1-a、G1-b、G2-a、G2-b四個亞型，本研究的12株P(guān)EDV-N序列分布于亞型G1-a、G1-b和G2-a。其中測序序列HB-1、HB-3與經(jīng)典毒株CV777、Br1-87株、SM98株、LZC株均屬于G1-a型；HB-7與Ah2016/2株、HLJBY株、CV777均屬于G1-b型；另外9份測序序列均為G2-a型，該亞型還包括SD2020株、GXGG07株、AH2012株等。

圖2 PEDV-N核苷酸同源性分析Fig.2 Nucleotide homology analysis of PEDV-N

圖3 PEDV-N氨基酸同源性分析Fig.3 Homology analysis of amino acids of PEDV-N

圖4 PEDV-N基因遺傳進化分析Fig.4 Genetic evolution analysis of PEDV-N gene

2.2.2 抗原表位預(yù)測分析 通過DNAStar.v7.1中的Protean軟件對N蛋白抗原表位進行預(yù)測分析（圖5），用本研究12份測序序列對比經(jīng)典疫苗株CV777和AJ1102的N蛋白的抗原表位差異。本研究12份測序序列與CV777和AJ1102在抗原表位上發(fā)生了較大變異，這可能使PEDV疫苗產(chǎn)生的抗體不能中和流行毒，從而導(dǎo)致免疫失敗的發(fā)生。

圖5 PEDV-N抗原表位預(yù)測Fig.5 Epitope prediction of PEDV-N

3 討論

本研究對2021-2022年湖北地區(qū)PEDV的調(diào)查結(jié)果顯示，總陽性率為20.13%（318/1580）。其中0～28 d仔豬、28～70 d保育豬、70～120 d后備豬、270 d中大豬、＞270 d豬的陽性率依次為40.27%、26.89%、10.33%、8.07%和5.50%。結(jié)果表明，0～70日齡段豬群PEDV的感染率遠(yuǎn)高于其它階段豬群。韓英明等[12]對2016-2018年間山東省16個地區(qū)不同日齡豬群的PEDV檢出情況進行統(tǒng)計，0～14日齡豬和14～28日齡豬PEDV檢出率與其它日齡段相比差異顯著（p＜0.05）；秦世新等[13]對湘西部分豬場不同生長階段的糞便樣品進行PEDV調(diào)查分析，哺乳仔豬的陽性率接近70%，保育豬的陽性率僅次于哺乳仔豬，且與其他生長階段的豬群陽性率差異顯著。以上結(jié)果表明PEDV易感齡段為0～70 d，且0～28 d的感染情況尤為嚴(yán)重。

綜上研究，推測0～70日齡段豬群易感原因如下：（1）＞70日齡豬群隨著日齡增加可耐過PEDV，無嚴(yán)重的臨床癥狀，但病豬可能持續(xù)性的排毒。通過直接或間接性的傳播途徑感染0～70日齡的豬群；（2）初生仔豬主要通過攝取初乳獲得母源抗體的保護，而PEDV屬冠狀病毒，其疫苗的保護期短，分娩母豬的抗體水平極大的影響仔豬的成活率[14-15]；（3）斷奶仔豬入群前未對豬群和環(huán)境進行PEDV的評估，健康豬與帶毒豬的直接傳播；帶毒豬受應(yīng)激排毒污染車輛、走道、工具等間接傳播，為PEDV的感染提供有利途徑。

PEDV在湖北地區(qū)一年四季均有檢出，其中冬季（36.66%）為PEDV的高發(fā)期，其余依次為春季19.00%和秋季11.49%，最低為夏季4.66%。分析其原因，湖北地處亞熱帶，降水充沛，雨熱同季，春季氣溫多變，秋季氣溫下降迅速，且春、秋季的降水期較長。豬舍的溫度和濕度影響著PEDV的存活狀態(tài)，其存活狀態(tài)與傳播能力呈現(xiàn)正相關(guān)。冬季和雨季豬舍內(nèi)環(huán)境溫度低且濕度大，防寒措施的不完善，豬群受冷應(yīng)激的影響加速PEDV的傳播；不利于飼料的儲備，連續(xù)陰雨天氣，易使飼料霉變加劇腹瀉病毒的傳播和發(fā)生。

N蛋白作為病毒中含量最高的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染早期的豬體內(nèi)就能夠檢測到高水平的N蛋白抗體，在病毒感染初期的實驗室診斷及病毒防控和疫苗研制中具有重要的意義[16]。本研究12株P(guān)EDV-N基因序列與GenBank上登錄的參考毒株相比，12株測序毒株之間的核苷酸同源性為94.0%～99.7%，氨基酸同源性為93.9%～100.0%；與參考毒株N基因的核苷酸同源性為94.5%～99.8%，氨基酸同源性為94.6%～100.0%（圖2，3）。用湖北地區(qū)12株P(guān)EDV流行毒株的N基因核苷酸序列與GenBank上發(fā)表的27條PEDV-N核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)遺傳進化樹（圖4）；并對比本研究獲得的12株序列與經(jīng)典疫苗株CV777和AJ1102的N蛋白的抗原表位差異[17]。結(jié)果顯示，湖北地區(qū)12株P(guān)EDV-N序列分布于G1-a、G1-b和G2-a亞型，其中大部分屬于G2-a亞型，未檢出與當(dāng)前流行變異毒株AJ1102同一進化分支的G2-b亞型。本研究獲得的12株序列與CV777和AJ1102的抗原表位差異較大。這表明，湖北地區(qū)流行毒株與經(jīng)典疫苗株CV777尤其是AJ1102遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，毒株的變異仍然在持續(xù)發(fā)生，這可能提示以CV777和AJ1102為免疫原設(shè)計的傳統(tǒng)疫苗對目前湖北地區(qū)的流行毒株的保護率下降，在預(yù)防PED方面可能作用不顯著，無法提供全面的免疫保護，成為PEDV暴發(fā)的主要隱患[18-19]。

研究結(jié)果表明，2021-2022年間湖北地區(qū)豬群存在不同程度的PEDV感染，其抗原表位發(fā)生了較大的變異。這提示在生產(chǎn)管理中，加強生物安全管理水平，在冬季、雨季來臨前需注意豬舍防寒保暖措施的準(zhǔn)備及溫濕度的控制；加強飼養(yǎng)管理水平，提升豬群自身抵抗力，嚴(yán)格執(zhí)行免疫接種程序，并關(guān)注生豬調(diào)運及引種帶來的風(fēng)險。PEDV的變異仍然在持續(xù)，目前廣泛使用的疫苗存在與流行毒株不匹配的現(xiàn)象，使疫苗無法提供有效的保護。建議加強對PEDV的豬群動態(tài)監(jiān)測及毒株變異規(guī)律的研究，及時掌握其變異特征，以此來篩選與豬場流行毒株基因型相匹配的疫苗，并指導(dǎo)PEDV疫苗的改進和研制。