何 靜，楊珊珊，黃明月，張 倩，洪 煬，林矯矯，柏 熊，謝建蕓，傅志強(qiáng)

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203）

東方田鼠（Microtus fortis）屬倉鼠科，田鼠亞科，田鼠屬[1]，在我國主要分布在東北、西北、黃河流域、長江流域和浙江、福建等地，是分布地的重要鼠種。東方田鼠是我國迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一種具有天然抗日本血吸蟲病特征的哺乳動(dòng)物。上世紀(jì)五六十年代，我國在血吸蟲病流行地區(qū)調(diào)查的39種哺乳動(dòng)物中，唯有東方田鼠體內(nèi)未找到日本血吸蟲成蟲或蟲卵，流行病學(xué)調(diào)查和人工感染試驗(yàn)均證明其對日本血吸蟲具有天然抗性，且這種抗性能穩(wěn)定遺傳[2-3]。東方田鼠抗血吸蟲病機(jī)制研究可為血吸蟲病的防治技術(shù)研究提供線索。

巨噬細(xì)胞來源于骨髓，在機(jī)體各部分分布廣泛，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，在抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)中起著非常的重要作用。在固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)中巨噬細(xì)胞起著關(guān)鍵性的作用，是炎性反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)細(xì)胞。當(dāng)宿主發(fā)生病原體感染后，巨噬細(xì)胞在有效清除病原體方面起了關(guān)鍵的作用[4]。Chung等[5]研究表明，在體外培養(yǎng)體系中小鼠腹腔巨噬細(xì)胞依賴于抗體對曼氏血吸蟲具有較大的殺傷作用。本文報(bào)告了一種東方田鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外分離培養(yǎng)與鑒定的方法，為研究東方田鼠巨噬細(xì)胞對日本血吸蟲殺傷作用提供一種簡便可行的實(shí)驗(yàn)方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡雄性東方田鼠來自由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心維持的封閉群，8周齡雄性KM鼠購自購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hycolon公司；、HE染液、印度墨汁、酸性磷酸酶染液、α-醋酸奈酚酯酶染液等購自少辛生物有限公司。

1.2 巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 8周齡東方田鼠麻醉后眼眶采血處死，用75%酒精浸泡消毒5 min，先去除東方田鼠胸腹部表皮以完全暴露腹部肌層，再用眼科鑷提起腹膜，用5 mL注射器向腹腔內(nèi)注射5 mL預(yù)冷的無血清DMEM培養(yǎng)液和1 mL空氣，注意進(jìn)針勿過深，不要損傷內(nèi)臟及血管?？焖偎秸袷? min，靜置5 min，觀察腸管變扁且腹腔液為淡黃色時(shí)，然后用鑷子提起腹膜用注射器刺入腹腔，吸取腹腔灌洗液。無菌條件下在腹膜上剪一小口，用1 mL PBS重復(fù)灌洗2次。將回收的腹腔灌洗液置于離心管于1000 ×g、4℃離心5 min。用常規(guī)DMEM培養(yǎng)液（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）調(diào)整細(xì)胞至所需濃度，接種于培養(yǎng)瓶或置有無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，置于37、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h后換液，去除未貼壁細(xì)胞。用KM鼠同樣進(jìn)行腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)，作為參考和比較。

1.3 細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞培養(yǎng)后每日用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況。并擇時(shí)將培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗后，用甲醛固定，常規(guī)HE染色，中性樹膠封片。用顯微鏡觀察并記錄圖像。

1.4 細(xì)胞吞噬功能檢測 細(xì)胞培養(yǎng)3 d后用印度墨汁進(jìn)行吞噬功能檢測。在培養(yǎng)孔中加入10%印度墨汁50 μL，放回培養(yǎng)箱中孵育3 h后取出蓋玻片，PBS沖洗，甲醛固定，甘油明膠封片。顯微觀察胞漿中吞有墨粒3個(gè)以上的為陽性細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)算吞噬細(xì)胞陽性率。

1.5 酸性磷酸酶染色 將培養(yǎng)5 d的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗后，甲醛固定，用Gomori酸性磷酸酶（Acid phosphatase, ACP）硫化鉛法染色，甘油明膠封片[6]。顯微觀察酶活性部位為棕黃色或棕黑色顆粒，定位于細(xì)胞胞漿中。光鏡下每張載片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)算陽性率。

1.6 α-醋酸奈酚酯酶染色（α-ANE） 培養(yǎng)3 d的細(xì)胞經(jīng)PBS沖洗后，冷甲醛-丙酮緩沖液固定，α-醋酸奈酚酯酶染色法染色，甲綠復(fù)染，甘油明膠封片[6]。酶活性部位為彌漫性紅棕色產(chǎn)物，定位于細(xì)胞胞漿中，胞核為綠色。光鏡下每張載片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞并計(jì)算陽性率。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞形態(tài)觀察 東方田鼠腹腔巨噬細(xì)胞培養(yǎng)明場觀察可見細(xì)胞核明顯，胞質(zhì)較豐富，活躍時(shí)內(nèi)含有顆?；蚩张?。具有變形運(yùn)動(dòng)和吞噬能力，細(xì)胞形狀不一，外周多突起及偽足（圖1）。HE染色后可見細(xì)胞呈圓形、橢圓形、三角形或不規(guī)則形，有偽足和突起，界限清楚。核大為卵圓形、腎形、馬蹄型或不規(guī)則形，偏居于細(xì)胞的一端，著色較深（圖2）。東方田鼠腹腔巨噬細(xì)胞和KM鼠在外觀形態(tài)上相似。

圖1 巨噬細(xì)胞明場下觀察Fig.1 Macrophage observation under bright field

圖2 巨噬細(xì)胞的HE染色觀察Fig.2 HE staining of macrophages

2.2 巨噬細(xì)胞的吞噬功能 將分離培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞加印度墨汁培養(yǎng)3 h后可見其吞噬功能被激活，培養(yǎng)細(xì)胞的胞質(zhì)及偽足和突起均有密集的墨汁顆粒，吞噬率為98%，顯示東方田鼠具有較強(qiáng)的吞噬功能。同樣處理的KM小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬也較強(qiáng)，兩者無明顯差異（圖3）。

圖3 巨噬細(xì)胞的墨汁吞噬試驗(yàn)Fig.3 Ink Phagocytosis test of macrophages

2.3 巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶表達(dá) 將培養(yǎng)5 d的巨噬細(xì)胞制備細(xì)胞爬片，酸性磷酸酶染色后可見東方田鼠巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)有大量的棕黑色顆粒，陽性率為98%；KM小鼠巨噬細(xì)胞胞漿的著色程度和東方田鼠類似（圖4）。

圖4 ACP染色觀察巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶表達(dá)Fig.4 ACP staining to observe the expression of acid phosphatase in macrophages

2.4 巨噬細(xì)胞的非特異性酯酶表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)3 d后經(jīng)α-醋酸奈酚酯酶染色顯示，大部分細(xì)胞的胞質(zhì)呈藍(lán)色，為強(qiáng)陽性細(xì)胞，少部分細(xì)胞的胞質(zhì)呈略淺的紅棕色，東方田鼠巨噬細(xì)胞陽性率為98%，染色后KM鼠的巨噬細(xì)胞非特異性酯酶的表達(dá)和東方田鼠相似（圖5）。

圖5 α-ANE染色觀察巨噬細(xì)胞的非特異性酯酶表達(dá)Fig.5 α-ANE staining to observe non-specific esterase expression in macrophages

3 討論

東方田鼠是我國唯一對日本血吸蟲病具有天然抗性的哺乳動(dòng)物。東方田鼠體中的日本血吸蟲先后移行經(jīng)過皮膚、肺臟和肝臟等器官，最終在肝臟中消亡[7]。東方田鼠抗日本血吸蟲病機(jī)制可能涉及多種因素，但無疑免疫機(jī)制是令人關(guān)注的。一些研究結(jié)果表明東方田鼠的抗性可能與其補(bǔ)體活性相關(guān)[7-9]，也有報(bào)告觀察了東方田鼠血細(xì)胞在其感染過程中的表現(xiàn)[10-11]。孫軍等[12]應(yīng)用基因表達(dá)譜研究的結(jié)果表明，感染后東方田鼠肺肝組織中非特異性免疫和特異性免疫相關(guān)基因表達(dá)活躍。Jiang等[13]進(jìn)一步研究表明東方田鼠感染后與免疫相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，其中包括補(bǔ)體和Fc受體等。Hu等[14]應(yīng)用RNAseq分析顯示大量與免疫相關(guān)的基因差異表達(dá)與感染相關(guān)，推測固有免疫與適應(yīng)性免疫反應(yīng)在殺傷血吸蟲過程中起重要作用。Han等[15]研究結(jié)果表明東方田鼠感染后表達(dá)差異的miRNAs主要與免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)代謝相關(guān)。

天然免疫細(xì)胞在先天免疫反應(yīng)中起到重要作用并且還可以通過分泌細(xì)胞因子來調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)[16]。巨噬細(xì)胞是重要的天然免疫細(xì)胞，對血吸蟲具有殺傷作用[5]。王慶林等[11]觀察到感染日本血吸蟲后3～16 d，東方田鼠血液嗜酸性粒細(xì)胞具有趨化性和粗大的嗜酸性顆粒，其中含有過氧化物酶和酸性磷酸酶，可以有效殺死寄生蟲。劉金明等[17]在體外培養(yǎng)中觀察到東方田鼠巨噬細(xì)胞能黏附在日本血吸蟲童蟲表面，但所用的巨噬細(xì)胞是經(jīng)石蠟油刺激后獲得，獲得量大但功能特性上可能與原始巨噬細(xì)胞差異較大。本文在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)應(yīng)用快速振蕩法分離腹腔巨噬細(xì)胞，簡單易行，數(shù)量足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)用，在形態(tài)上與其它物種并無差異。HE染色和墨汁吞噬試驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞純度和均一性較好，細(xì)胞的吞噬活性很高。酸性磷酸酶和特異性酯酶是溶酶體酶，是巨噬細(xì)胞執(zhí)行其生物學(xué)功能的重要分子，也是巨噬細(xì)胞的標(biāo)志酶。本研究結(jié)果顯示，東方田鼠腹腔巨噬細(xì)胞的酸性磷酸酶和非特異性酯酶的表達(dá)和KM鼠類似，但其對血吸蟲是否有殺傷效應(yīng)和在抗性機(jī)制中的作用有待于進(jìn)一步研究。

本文應(yīng)用振蕩法分離培養(yǎng)東方田鼠腹腔巨噬細(xì)胞，操作簡便，細(xì)胞形態(tài)、吞噬活性和酶活性等較好，為研究巨噬細(xì)胞在東方田鼠抗性機(jī)制中的作用提供了基礎(chǔ)。