江 珊 ，虞凌雪 ,2，于 海 ，姜一峰 ，李國新 ，劉長龍 ，周艷君 ，高 飛 ，趙 款 ，張玉嬌 ，曹云雷，白淵哲，童光志,2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009）

巨噬細(xì)胞是最早接觸病原微生物的免疫防御細(xì)胞之一，具有多種生物學(xué)功能，是宿主天然免疫和特異性免疫的重要執(zhí)行者[1]。巨噬細(xì)胞在非特異性免疫中，可通過吞噬作用殺滅及清除病原體和異物介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，參與先天性免疫應(yīng)答；在特異性免疫中，作為抗原遞呈細(xì)胞加工和遞呈抗原并啟動獲得性免疫應(yīng)答，同時可分泌細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2]。病毒可通過感染巨噬細(xì)胞，阻遏巨噬細(xì)胞吞噬作用、抑制抗原呈遞能力和調(diào)節(jié)促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，影響宿主的獲得性免疫應(yīng)答，并且不同分化狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞對病毒的易感性不同[3]。因此研究骨髓源巨噬細(xì)胞對病毒研究至關(guān)重要。

巨噬細(xì)胞是一種可塑性強(qiáng)且功能多樣性的細(xì)胞群體，是免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)及效應(yīng)細(xì)胞，它的極化是微環(huán)境信號刺激從而獲得不同表型和功能特征的過程，目前普遍采用的體外獲得巨噬細(xì)胞的手段是骨髓單核細(xì)胞經(jīng)M-CSF培養(yǎng)形成的[4]。巨噬細(xì)胞活化包括兩種途徑：經(jīng)典活化途徑和選擇性活化途徑。經(jīng)典活化的M1型巨噬細(xì)胞由IFN-α及脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）刺激而來，其特征是分泌Th1相關(guān)細(xì)胞因子IL-12、IL-6、IL-1、TNF-α，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗原遞呈及吞噬能力[5]；而IL-4/IL-13驅(qū)動M2型巨噬細(xì)胞極化，分泌Th2相關(guān)因子IL-10等，可減輕局部炎性反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)能力[6]。根據(jù)刺激因子不同，可將M2型巨噬細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)化為M2a（IL-4和IL-13誘導(dǎo)）、M2b（通過免疫復(fù)合物和TLR或IL-1R激動劑誘導(dǎo)）及M2c巨噬細(xì)胞（由IL-10誘導(dǎo)），M2a和M2b發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能并驅(qū)動Th2型反應(yīng)，M2c與抑制免疫反應(yīng)和組織修復(fù)相關(guān)[7]。

巨噬細(xì)胞是許多豬源性病毒靶向的主要細(xì)胞，而骨髓源巨噬細(xì)胞由于其在機(jī)體分布廣泛且可塑性較強(qiáng)因此相比較于肺泡巨噬細(xì)胞有更高的潛在研究意義[8]。目前對豬骨髓源巨噬細(xì)胞及其亞型的培養(yǎng)研究還不深入，建立起成熟的培養(yǎng)方法及分化手段能對今后病毒機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、儀器及耗材 實(shí)驗(yàn)中涉及到的PBS、胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）、1640培養(yǎng)基、胰酶均購自Gibco公司，PrimocinTM原代細(xì)胞抗生素購自Invivogen公司；紅細(xì)胞裂解液購自Biosharp公司；M-CSF、LPS、IFN-γ和IL4均購自美國R&D公司；pHrodoTMGreen zymosan A BioParticlesTMconjuage購自Invitrogen公司；DCFH-DA購自Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 本實(shí)驗(yàn)所用的試驗(yàn)動物為15日齡健康仔豬，經(jīng)檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型均陰性。

1.3 豬骨髓細(xì)胞的分離培養(yǎng) 我們選取15日齡健康仔豬的股骨及脛骨，剔除表面組織，在操作時小心勿將骨膜劃破以免后期沖洗時污染。將處理好的骨置于75%酒精中浸泡5 min，隨后轉(zhuǎn)至超凈臺中用無菌PBS沖洗，借助骨鉗截去骨兩端，穿刺針插入兩端以便沖洗。用20 mL針管吸取包含10%血清及1%抗生素的1640培養(yǎng)基沖洗骨髓，骨的兩端各沖洗一次至50 mL離心管中，于低溫水平離心機(jī)4℃、550 ×g離心6 min，棄掉上清液。培養(yǎng)基沖洗兩遍后4℃、550 ×g離心6 min棄上清液，5 mL紅細(xì)胞裂解液裂解5 min，期間每隔兩分鐘顛倒混勻幾次，4℃、550 ×g離心6 min，培養(yǎng)基洗兩遍棄掉上清液后，離心的細(xì)胞1%primocin抗生素+10%FBS+100 ng/mL M-CSF的1640培養(yǎng)基重懸成單細(xì)胞懸液。重懸的細(xì)胞以2×107的密度鋪于100 mm平皿中，3 d后換培養(yǎng)基，6～7 d后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。經(jīng)M-CSF誘導(dǎo)培養(yǎng)的BMDM以每孔2×106細(xì)胞鋪于6孔板中，以1 μg/mL LPS及100 ng/mL IFN-γ共刺激，可將巨噬細(xì)胞分化成M1亞群；選取100 ng/mL IL-4誘導(dǎo)BMDM形成M2型巨噬細(xì)胞。

1.4 吞噬實(shí)驗(yàn) 將M0、M1、M2型骨髓源巨噬細(xì)胞以每孔1×106細(xì)胞鋪于6孔板中，培養(yǎng)過夜后無菌PBS沖洗兩遍，F(xiàn)ITC conjugated zymosan bioparticles（Molecular Probes）以1 mL/106細(xì)胞的比例加入后在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，同時以在4℃進(jìn)行同樣操作作為陰性對照。孵育1 h后，PBS洗兩遍，通過流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光強(qiáng)度來說明細(xì)胞吞噬能力。

1.5 ROS檢測 將M0、M1、M2型骨髓源巨噬細(xì)胞以每孔1×106細(xì)胞數(shù)鋪于6孔板中，過夜培養(yǎng)后PBS沖洗兩遍，加入20 μmol/L DCFH-DA在37℃的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，隨后PBS洗3次，消化重懸，通過流式細(xì)胞儀分析平均熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 選取15日齡的健康仔豬的骨髓干細(xì)胞（bone marrow stem cell, BMHC），在含M-CSF 100 ng/mL的RPMI 1640培養(yǎng)液的誘導(dǎo)條件下進(jìn)行體外貼壁培養(yǎng)，6～7 d時獲得純度較高的M0型骨髓源巨噬細(xì)胞（Bone marrow-derived macrophage,BMDM），隨后通過LPS、IFN-γ共同刺激將巨噬細(xì)胞分化成M1亞群、IL-4等極化得到M2型巨噬細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察可見M-CSF活化第1 d巨噬細(xì)胞貼壁狀態(tài)不明顯，培養(yǎng)6 d后巨噬細(xì)胞狀態(tài)更好，貼壁更牢固，而極化后M1、M2型骨髓源巨噬細(xì)胞與未極化的M0型相比更大、更平坦、顆粒狀更明顯，且相較于M1型，M2型巨噬細(xì)胞長有小的觸角及偽足（圖1）。

圖1 骨髓巨噬細(xì)胞亞群形態(tài)觀察Fig.1 Morphology observation of polarized Bone marrow-derived macrophages

2.2 吞噬實(shí)驗(yàn) 為鑒定巨噬細(xì)胞分化狀態(tài)，我們進(jìn)行了吞噬實(shí)驗(yàn)，將分化的巨噬細(xì)胞與帶FITC熒光標(biāo)記的酵母顆粒相互作用，在37℃培養(yǎng)條件下巨噬細(xì)胞的吞噬作用較強(qiáng)，可以吞噬顆粒并在熒光顯微鏡下觀察到熒光，而對照組4℃條件下巨噬細(xì)胞活性弱且吞噬能力較弱。經(jīng)顯微鏡觀察到在37℃培養(yǎng)條件下的巨噬細(xì)胞M0、M1、M2都表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光水平，通過流式細(xì)胞術(shù)分析可知，與對照相比，各樣品陽性細(xì)胞數(shù)所占比例顯著性提高，表明分化的巨噬細(xì)胞純度較高，具有吞噬功能（圖2）。

圖2 巨噬細(xì)胞亞群吞噬活性鑒定Fig.2 Phagocytic activity of pig bone marrow-derived macrophages

2.3 細(xì)胞內(nèi)活性氧（Reactive oxygen species, ROS）的檢測 為了檢測活化的骨髓源巨噬細(xì)胞各亞群細(xì)胞活性氧的變化，將DCFH-DA與分化后巨噬細(xì)胞亞群相互作用，通過流式細(xì)胞儀檢測選定陽性區(qū)域的綠色熒光強(qiáng)度以顯示不同亞群中的ROS水平，發(fā)現(xiàn)較M0型巨噬細(xì)胞，分化后的M1及M2型FITC平均熒光強(qiáng)度都有所提升，這表明在分化后細(xì)胞內(nèi)的活性氧分泌增加，如圖3所示。

圖3 骨髓巨噬細(xì)胞的ROS含量檢測Fig.3 Intracellular reactive oxygen species of pig bone marrow-derived macrophages

3 討論

單核源巨噬細(xì)胞及骨髓源巨噬細(xì)胞在微環(huán)境刺激條件下能經(jīng)歷特定的活化途徑，包括經(jīng)典活化途徑的M1型巨噬細(xì)胞及選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞。體外研究表明，IFN-γ、LPS和IL-4誘導(dǎo)可分別誘導(dǎo)M1型和M2型極化[9-10]。本實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)分化后的巨噬細(xì)胞與未分化M0型巨噬細(xì)胞相比細(xì)胞更大且呈顆粒狀。同時，M1、M2型巨噬細(xì)胞在表型上有一定差異，主要體現(xiàn)在M2型巨噬細(xì)胞有更多細(xì)小的偽足。

巨噬細(xì)胞最主要的生物學(xué)特性是具有強(qiáng)大的吞噬能力，我們在鑒定中采用酵母顆粒的吞噬實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證巨噬細(xì)胞的吞噬功能，發(fā)現(xiàn)所有分化的M1、M2型巨噬細(xì)胞都有吞噬作用?；钚匝踝杂苫ㄓ袡C(jī)氧化物、臭氧、單體氧和過氧化物等，線粒體氧化呼吸過程釋放的ROS是細(xì)胞內(nèi)源性ROS的主要來源。單核巨噬吞噬細(xì)菌或其他病原后，分布在其胞膜的氧化酶引起大量活性氧的產(chǎn)生，是形成內(nèi)源性ROS的另一來源[11]。細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）被認(rèn)為是胞內(nèi)第二信使，主要參與轉(zhuǎn)錄因子NF-κB激活和靶基因調(diào)控等[12-13]。本研究表明，LPS和IFN-γ共同誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞極化和IL-4誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞極化，雖然分化方向不同，但均有ROS的增加。M1型和M2型巨噬細(xì)胞的激活過程中涉及了多種轉(zhuǎn)錄因子的活化調(diào)控，其中ROS發(fā)揮的作用機(jī)制尚不明確[9-10]。

綜上所述，本研究采用重組表達(dá)蛋白M-CSF對骨髓干細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng)，在短時間內(nèi)可以獲得大量的貼壁細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)觀察、吞噬實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞活性氧ROS檢測驗(yàn)證所培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞是高純度、高活性的骨髓源巨噬細(xì)胞，為進(jìn)一步研究巨噬細(xì)胞的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。