鞏新民，祝永華，郭龍宗

（山東益生種畜禽股份有限公司，煙臺(tái) 264680）

沙門菌是危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的最重要細(xì)菌性病原之一，可引起禽類各種各樣的急性和慢性疾病[1]。其具有復(fù)雜的抗原結(jié)構(gòu)，一般包括三種抗原，它們分別是菌體抗原（O）、表面抗原（Vi）、鞭毛抗原（H），O抗原是每株沙門菌均含有的抗原成分。沙門菌是一種需氧及兼性厭氧菌，在普通瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)20～24 h，生長良好，并形成圓形、中等大小、表面光滑、邊緣整齊、無色半透明的單菌落，是革蘭氏陰性菌、無莢膜、無芽孢，除雞白痢沙門菌、禽傷寒沙門菌外，其他都具有鞭毛可以運(yùn)動(dòng)，多數(shù)沙門菌具有菌毛結(jié)構(gòu)，可吸附在宿主細(xì)胞表面[2]。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)2600多種血清型的沙門菌[3]。對(duì)家禽危害較大的血清型包括傳統(tǒng)意義上的雞白痢沙門菌和禽傷寒沙門菌，以及其他引起禽副傷寒的諸多沙門菌血清型。禽副傷寒沙門菌的感染非常普遍，是使各種幼禽遭受嚴(yán)重死亡損失的細(xì)菌性疾病之一，臨床感染的血清型以腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌為主，也因?yàn)槠涫侨祟愂澄镌葱约膊〔≡哂蟹浅Ｖ匾墓残l(wèi)生意義[4]，因而受到廣泛關(guān)注。目前對(duì)于沙門菌病的主要防控措施有定期監(jiān)測(cè)、藥物預(yù)防、疫苗免疫及應(yīng)用益生菌等，而免疫一直是所有疫病防控的基礎(chǔ)策略。沙門菌的活疫苗和弱毒活疫苗已經(jīng)在全世界應(yīng)用，它們的效果已經(jīng)通過攻毒實(shí)驗(yàn)得到驗(yàn)證，這將是今后家禽沙門菌病防控的必要手段[5]。

本研究通過對(duì)某大型白羽肉種雞公司A、B兩個(gè)規(guī)模化父母代肉種雞場(chǎng)，前后各一個(gè)種雞批次，分別采用兩次和三次腸炎沙門菌活疫苗免疫的效果進(jìn)行了跟蹤對(duì)比，為種雞場(chǎng)腸炎沙門菌活疫苗免疫程序的制定提供科學(xué)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)雞群 山東某大型白羽肉種雞公司規(guī)模化父母代種雞場(chǎng)，A、B兩場(chǎng)前后飼養(yǎng)的4個(gè)批次，分別為A場(chǎng)的170511/20批和190706批、B場(chǎng)的201705批和201812批，每批飼養(yǎng)量約20萬套。同一場(chǎng)內(nèi)分別先后飼養(yǎng)兩個(gè)批次，采樣2次和3次良種免疫程序。飼養(yǎng)期間場(chǎng)區(qū)管理人員、硬件條件、操作流程相同。

1.2 主要試劑 雞白痢-傷寒多價(jià)染色平板凝集試驗(yàn)抗原及陰性和陽性血清均購自北京中海生物科技有限公司；用于微生物分離鑒定的培養(yǎng)液和培養(yǎng)基等均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；沙門菌屬O多價(jià)診斷血清A-F購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。

1.3 免疫疫苗 雞腸炎沙門菌病活疫苗（AviPro?Salmonella Vac E），2000羽份/瓶，德國羅曼動(dòng)物保健有限公司生產(chǎn)。

1.4 凈化藥物 藥物a，阿莫西林，山東華辰制藥有限公司安力素；藥物b，多西環(huán)素，鄭州福源動(dòng)物藥業(yè)有限公司呼欄；藥物c，磺胺，天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司速可能；藥物d，氟苯尼考山東華辰制藥有限公司?？尚?。

1.5 免疫程序 同一場(chǎng)飼養(yǎng)的前后2批雞腸炎沙門菌活疫苗免疫分別采用兩次和三次方式，采用兩次免疫的批次是在6周齡和16周齡飲水免疫，每只雞劑量為羽份；采用三次免疫的批次是在1日齡、6周齡和16周齡飲水免疫，每只雞劑量為1羽份。詳見表1。

表1 免疫程序Table 1 Immunization procedures

1.6 樣品采集與處理 用雞白痢-傷寒平板凝集試驗(yàn)對(duì)種雞血清跟蹤監(jiān)測(cè)，每次采集數(shù)量為雞群飼養(yǎng)量的1%。按照NY/T 536-2002《雞傷寒和雞白痢診斷技術(shù)》[6]方法執(zhí)行，檢測(cè)出的陽性血清用生理鹽水依次做4倍和8倍稀釋，再進(jìn)行平板凝集，觀察結(jié)果，記錄不同陽性率。種雞所產(chǎn)種蛋孵化后的毛蛋及雛雞從卵黃囊進(jìn)行沙門菌的分離與鑒定，每次至少100只/枚。分離鑒定方法，參照GB4789.4-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》[7]、《NY/T 536-2017雞傷寒和雞白痢診斷技術(shù)》[8]方法執(zhí)行，分離出的疑似沙門菌，通過生化實(shí)驗(yàn)、單因子血清凝集實(shí)驗(yàn)、PCR方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 血清雞白痢-傷寒平板凝集結(jié)果 A場(chǎng)兩次免疫批次雞血清雞白痢-傷寒平板凝集陽性率全程保持為3%～17%，血清做4倍和8倍稀釋后的平板凝集陽性率顯示，在產(chǎn)蛋后期有明顯波動(dòng)，但比例也較低。A場(chǎng)三次免疫批次血清雞白痢-傷寒平板凝集陽性率除25周和54周超過10%以外，其他周齡均在8%以下，血清做4倍和8倍稀釋后的平板凝集結(jié)果均為陰性。B場(chǎng)兩次免疫批次雞血清雞白痢-傷寒平板凝集陽性率全程保持為10%～30%，血清做4倍和8倍稀釋后平板凝集檢測(cè)結(jié)果顯示產(chǎn)蛋高峰階段和產(chǎn)蛋后期有明顯波動(dòng)。B場(chǎng)三次免疫批次血清雞白痢-傷寒平板凝集陽性率全程保持在10%以下，血清4倍和8倍稀釋后均為陰性（表3）。

表2 采樣周齡Table 2 Sampling week age

表3 血清雞白痢-傷寒平板凝集結(jié)果Table 3 Results of serum plate agglutination of pullorum and typhoid

2.2 沙門菌分離與血清型鑒定結(jié)果 A場(chǎng)兩次免疫批次45周齡后所產(chǎn)毛蛋基本每次都有沙門菌分離出，但雛雞中未分離出沙門菌，經(jīng)生化、單因子血清凝集、PCR鑒定，毛蛋中分離菌株均為腸炎沙門菌。A場(chǎng)三次免疫批次毛蛋和雛雞中均未分離到沙門菌。B場(chǎng)兩次免疫批次35周齡后所產(chǎn)毛蛋每次都有沙門菌分離出，在49周的雛雞中也分離出沙門菌，經(jīng)生化、單因子血清凝集、PCR鑒定，毛蛋和雛雞中分離到的均為腸炎沙門菌。B場(chǎng)三次免疫批次毛蛋和雛雞中均未分離到沙門菌（表4）。

表4 毛蛋與健康雛雞的沙門氏菌分離結(jié)果Table 4 Results of salmonella isolation from wool eggs and healthy chicks

2.3 開產(chǎn)后抗生素治療費(fèi)用的統(tǒng)計(jì) 開產(chǎn)后根據(jù)雞群健康狀況決定是否使用抗生素治療，以B場(chǎng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為例。B場(chǎng)兩次免疫批次共使用8次抗生素，總藥費(fèi)為2.4元/只，B場(chǎng)三次免疫批次共使用兩次抗生素，總藥費(fèi)為0.3元/只，比兩次免疫批次節(jié)約藥費(fèi)2.1元/只。其中兩次免疫批次專門針對(duì)治療沙門氏菌病的C藥共使用4次，共2元/只（表5）。

表5 開產(chǎn)后抗生素治療費(fèi)用的統(tǒng)計(jì)Table 5 Statistics of postpartum antibiotic treatment costs

3 討論

雞白痢-傷寒平板凝集試驗(yàn)受抗原試劑批次穩(wěn)定性、敏感性、血清質(zhì)量變化及其他雜菌感染、雞群細(xì)菌性滅活苗免疫等多重因素的干擾，其檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽性[9]，日常檢測(cè)中出現(xiàn)的陽性，不能充分、準(zhǔn)確說明雞群的感染狀況。ELISA方法更加敏感和可靠，但因其費(fèi)用過高，不適于臨床大規(guī)模樣品的常規(guī)監(jiān)測(cè)。郭龍宗等[10]發(fā)現(xiàn)血清8倍稀釋后的陽性與ELISA檢測(cè)數(shù)據(jù)之間具有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)性，血清8倍稀釋后雞白痢-傷寒沙門菌平板凝集陽性率可有效評(píng)估臨床沙門菌野毒感染的狀態(tài)。

沙門菌在毛蛋中的分離率遠(yuǎn)高于雛雞，與沙門菌在種蛋孵化過程中大量生長、增殖，落盤后交互污染有關(guān)，從而更容易被檢出。毛蛋檢測(cè)結(jié)果對(duì)于種雞群是否感染沙門菌具有明顯的病原學(xué)指示作用。

通過兩個(gè)場(chǎng)，前后分別采用2次和3次免疫的4批雞大群田間實(shí)驗(yàn)檢測(cè)跟蹤，可以發(fā)現(xiàn)，腸炎沙門菌2次活疫苗免疫批次，血清4、8倍稀釋后平板凝集長期陰性或陰性周齡段為主，證明雞群感染率不高，血清抽樣檢測(cè)時(shí)，難以檢出；同時(shí)毛蛋中沙門菌的分離率A場(chǎng)全程在13%以內(nèi)，大部分周齡在5%以內(nèi)，B場(chǎng)則全程控制在23%以內(nèi)，毛蛋與雛雞的沙門菌檢出率與血清的雞白痢-傷寒平板凝集試驗(yàn)結(jié)果，尤其是血清8倍稀釋后的結(jié)果，并沒有呈現(xiàn)全程的關(guān)聯(lián)性（同時(shí)陽性或同時(shí)陰性），主要還是與雞群的感染率低有關(guān)，毛蛋在孵化過程中存在沙門菌的增殖或相互污染，而更容易被檢測(cè)出，同時(shí)腸炎沙門菌和雞白痢、禽傷寒雖同屬于D群且有相同的抗原位點(diǎn)，但相比自身菌體抗原的識(shí)別而言，還是要低一些。但在血清8倍稀釋使用雞白痢-傷寒平板凝集檢測(cè)出現(xiàn)結(jié)果陽性時(shí)，雞群的沙門菌的感染是可以確認(rèn)的，并需對(duì)雞群采取對(duì)應(yīng)的控制措施。

2次疫苗免疫，配合藥物凈化作用，對(duì)雞群的腸炎沙門氏菌感染能起到較好的控制作用。但相比而言，三次免疫批次，血清4、8倍稀釋后平板凝集和毛蛋分離全程都為陰性，效果優(yōu)于2次免疫批次，分析可能與1日齡免疫，而更早的建立免疫保護(hù)有關(guān)，控制了雞群的早期感染，育雛期是雛雞對(duì)沙門菌的最為易感階段。

按照Kauffman-White規(guī)則，雞白痢、禽傷寒和腸炎沙門菌被統(tǒng)一劃分為D亞群，這主要基于其O抗原一致，并具有相同的1、9、12的抗原位點(diǎn)，也進(jìn)而決定了屬于同一亞群的沙門菌之間有較好的交叉保護(hù)，腸炎沙門菌活疫苗三次免疫可以有效抵抗禽傷寒的注射攻毒，顯著減少雞群死亡率，降低糞便中沙門菌排毒率和器官中沙門菌定植率[11]。白羽肉雞種源目前主要為國外引種，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)雞白痢、傷寒凈化，在良好生物安全控制條件下，白羽肉雞很少出現(xiàn)雞白痢、禽傷寒的感染，本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)反應(yīng)的是免疫腸炎沙門菌對(duì)雞群感染腸炎沙門氏菌野毒的保護(hù)力。

通過血清8倍稀釋平板凝集、毛蛋和雛雞沙門菌分離結(jié)果，可以確定腸炎沙門菌活疫苗的三次免疫批次臨床保護(hù)要好于兩次免疫，開產(chǎn)后的藥品投入相比兩次免疫批次也明顯減少，這說明腸炎沙門菌活疫苗三次免疫可對(duì)種雞全生產(chǎn)周期腸炎沙門菌的感染提供良好保護(hù)，證明了三次免疫中盡早對(duì)雞群進(jìn)行首免占位的重要性。

沙門菌是一種胞內(nèi)寄生病原微生物[12]，具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力，并且分布廣泛，要徹底根除雞群中的沙門菌是一項(xiàng)艱巨的工作，需要多環(huán)節(jié)的全面綜合措施，包括疫苗免疫的特異性措施和場(chǎng)區(qū)生物安全、清洗消毒、有害生物控制在內(nèi)的非特異性措施。腸炎沙門菌活疫苗可用于降低家禽腸炎沙門菌的感染壓力，免疫三次腸炎沙門菌活疫苗的效果明顯優(yōu)于免疫兩次，可對(duì)種雞整個(gè)生產(chǎn)周期提供良好保護(hù)力。