王文逸，史振國，馮俊成，毛旭華

(1.蘇州大學(xué)附屬獨墅湖醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，江蘇 蘇州 215000；2.江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院心胸外科，江蘇 無錫 214200；3.江蘇大學(xué)附屬宜興醫(yī)院檢驗科，江蘇 無錫 214200)

食管癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一[1]，我國是食管癌高發(fā)地區(qū)，其發(fā)病率位居惡性腫瘤的第三位，死亡率位居第四位[2]，雖然近年來食管癌治療取得了很大進(jìn)展，但由于大多數(shù)食管癌患者確診時已進(jìn)展至晚期，故其5年生存率，僅有 19%[3-5]。因此，進(jìn)一步研究食管癌的發(fā)病機制并尋找相關(guān)標(biāo)志物顯得尤為重要。CST1基因定位于20p11.21染色體，其編碼一種半胱氨酸蛋白酶抑制劑Cystatin SN，屬于半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族中的2型亞家族[6]。近年來，國內(nèi)外有大量研究顯示CST1基因與腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6-8]。但是鮮見CST1基因在食管癌中的研究報道。本研究利用腫瘤基因組圖譜(TCGA)等數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)技術(shù)對食管癌組織中CST1基因進(jìn)行大數(shù)據(jù)分析，以期為食管癌的發(fā)病機制和早期診斷提供進(jìn)一步的科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1資料來源與數(shù)據(jù)處理:基因分析中常用的數(shù)據(jù)庫：TCGA(網(wǎng)址：https：//portal.gdc.cancer.gov/)，癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘數(shù)據(jù)庫(UALCAN，網(wǎng)址http：//ualcan.path.uab.edu)。正常人基因型-組織表達(dá)數(shù)據(jù)庫(Genotype-Tissue Expression，GTEx，網(wǎng)址：https：//commonfund.nih.gov/GTex)，基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析數(shù)據(jù)庫(GEPIA，網(wǎng)址：http：//gepia.cancer-pku.cn/)，人類蛋白質(zhì)圖譜圖像分類數(shù)據(jù)庫(HPA，網(wǎng)址：https：//www.proteinatlas.org)。

利用GEPIA和 UALCAN數(shù)據(jù)庫比較不同腫瘤類型TCGA數(shù)據(jù)庫和GTEx數(shù)據(jù)庫中腫瘤組織和正常組織數(shù)據(jù)。采用方差分析，選擇log2(TPM+1)參數(shù)對基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。利用HPA數(shù)據(jù)庫分析CST1蛋白在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中的表達(dá)。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫對CST1在食管癌不同人種中及在食管癌患者不同臨床病理特征下的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析CST1表達(dá)對食管癌患者生存期的影響。

1.2細(xì)胞系、試劑及儀器:TE-1和 KYSE520人食管癌細(xì)胞系購自美國菌種保藏中心(ATCC)。CST1 siRNA兩條序列(按照參考文獻(xiàn)合成[8])及其陰性對照(NC)由廣州銳博公司合成和提供。RPMI-1640、Opti-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶(美國Gibco公司)。CCK-8(日本同仁化學(xué)研究所)。Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染試劑、Trizol試劑和10%Bis-Tris預(yù)制膠套裝(美國Invitrogen 公司)。Primescript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物公司)。SYBR?Select Master Mix試劑盒(美國 ABI 公司)。兔抗人CST1多克隆抗體(批號：16025-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、兔抗人Cyclin D1多克隆抗體(批號：2978)以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號：7074，美國Cell Signaling公司)，兔抗人β-actin多克隆抗體(批號：AP0060，美國Bioword公司)。細(xì)胞周期和凋亡檢測試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和ECL發(fā)光試劑盒(上海碧云天公司)。酶聯(lián)儀(美國Biotek 公司)，BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(美國Thermo Scientific 公司)，ABI 7300 熒光定量PCR儀(美國ABI 公司)，Western印跡電泳設(shè)備及化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)：TE-1和 KYSE520細(xì)胞系分別給予含10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3～4天傳代1次，后續(xù)實驗取對數(shù)生長期細(xì)胞。

1.4siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)生長期的TE-1和 KYSE520細(xì)胞，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種約2×105個細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后按照Lipofectamine3000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實驗分為siNC組(NC siRNA轉(zhuǎn)染組)、siCST1-1組(CST1 siRNA序列1轉(zhuǎn)染組) 和siCST1-2組(CST1 siRNA序列2轉(zhuǎn)染組)，每組設(shè)4個復(fù)孔，其中1復(fù)孔轉(zhuǎn)染24 h 后用于CCK-8檢測；1復(fù)孔轉(zhuǎn)染48 h驗證mRNA 表達(dá)；其余復(fù)孔轉(zhuǎn)染72 h分別用于檢測蛋白表達(dá)和細(xì)胞周期分析。實驗均重復(fù)3次。

1.5CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖活力：取上述1.4中轉(zhuǎn)染24 h細(xì)胞經(jīng)2.5 g/L胰蛋白酶消化制備成單細(xì)胞懸液，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔接種2 000個細(xì)胞，每組設(shè)6個復(fù)孔，同時設(shè)立空白調(diào)零組(僅加培養(yǎng)液)。常規(guī)培養(yǎng)0 d、1 d、2 d、3 d、4 d后，按照 CCK-8 試劑盒說明書加入CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后在酶聯(lián)儀上測450 nm波長處的吸光度值(A值)，OD值=A(細(xì)胞組)-A(空白組)。

1.6實時熒光定量RT-PCR檢測mRNA表達(dá)：根據(jù) Trizol 試劑說明書提取上述1.4中轉(zhuǎn)染48 h 細(xì)胞(約106個)總RNA，NanoDrop 2000 超微量分光光度計測定總RNA濃度和比值(A260/A280均在1.8～2.0之間)，取1 μg RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照參考文獻(xiàn)，采用實時熒光定量 PCR 檢測CST1 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果以2-ΔΔCt法計算，公式：ΔΔCt = [(實驗組Ct目的基因/實驗組Ct內(nèi)參基因) -(對照組Ct目的基因- 對照組Ct內(nèi)參基因)]。實驗均重復(fù)3次。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：取1.4中轉(zhuǎn)染72 h后細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化收集所有細(xì)胞，1 000 r/min，5 min；冰浴預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗1遍后加入1 ml冰浴預(yù)冷70%乙醇，輕輕吹打混勻，-20℃固定。固定24 h后按照細(xì)胞周期和凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作上機收集熒光信號并分析。實驗均重復(fù)3次。

1.8Western印跡檢測蛋白表達(dá)：取上述1.4中轉(zhuǎn)染72 h細(xì)胞(約2×106個)，預(yù)冷PBS洗2遍加入預(yù)冷的RIPA蛋白裂解液冰浴裂解抽提蛋白，4℃，12 000 r/min，15 min；取上清按試劑盒說明書BCA 法測定蛋白濃度，按照預(yù)制膠套裝說明書蛋白變性后取15 μl(30 μg)加入10%Bis-Tris預(yù)制膠中，200 V電泳40 min，電泳結(jié)束后在400 V 恒壓條件下2 h將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉1 h。分別加入兔抗人CST1抗體(1∶1 000稀釋)、兔抗人Cyclin D1抗體(1∶1 000稀釋)以及兔抗人β-actin 抗體(1∶5 000稀釋)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋)后室溫下孵育1 h，TBST洗膜5次后ECL化學(xué)發(fā)光法顯影后經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光檢測目的條帶。實驗均重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析：采用GraphPad Prism5.01統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行t檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1CST1在不同腫瘤中的表達(dá)：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，在33種不同腫瘤類型中，CST1 mRNA在食管癌，膀胱尿路上皮癌，乳腺浸潤癌，結(jié)腸腺癌，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，肺腺癌，肺鱗癌，卵巢漿液性囊腺癌，胰腺癌，直腸腺癌，胃癌，睪丸癌，子宮內(nèi)膜癌等13種腫瘤中表達(dá)上調(diào)。見圖1。GEPIA數(shù)據(jù)庫和TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明CST1在食管癌中顯著高表達(dá)(P<0.05)。見圖2。

ACC：腎上腺皮質(zhì)癌；BLCA：膀胱尿路上皮癌；BRCA：乳腺浸潤癌；CESC：宮頸鱗癌和腺癌；CHOL：膽管癌；COAD：結(jié)腸腺癌；DLBC：彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤；ESCA：食管癌；GBM：多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；HNSC：頭頸部鱗狀細(xì)胞癌；KICH：腎嫌色細(xì)胞癌；KIRC：腎透明細(xì)胞癌；KIRP：腎乳頭狀細(xì)胞癌；LAML：急性髓細(xì)胞樣白血?。籐GG：腦低級別膠質(zhì)瘤；LIHC：肝細(xì)胞肝癌；LUAD：肺腺癌；LUSC：肺鱗癌；MESO：間皮瘤；OV：卵巢漿液性囊腺癌；PAAD：胰腺癌；PCPG：嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤；PRAD：前列腺癌；READ：直腸腺癌；SARC：肉瘤；SKCM：皮膚黑色素瘤；STAD：胃癌；TGCT：睪丸癌；THCA：甲狀腺癌；THYM：胸腺癌；UCEC：子宮內(nèi)膜癌；UCS：子宮肉瘤；UVM：葡萄膜黑色素瘤。圖中紅色代表腫瘤組織，綠色代表正常組織對照。T：腫瘤組織，N：正常組織，n：數(shù)量。X軸：腫瘤組織和正常組織數(shù)量，Y軸：每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本log2(TPM+1)圖1 GEPIA數(shù)據(jù)庫中CST1在不同腫瘤中的表達(dá)

A：GEPIA數(shù)據(jù)庫中CST1在食管癌中的表達(dá)，B：TCGA數(shù)據(jù)庫中CST1在食管癌中的表達(dá);圖中紅色代表腫瘤組織，黑色代表正常組織對照。X軸：腫瘤組織和正常對照組織數(shù)量，Y軸：A圖每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本log2(TPM+1)；B圖每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本,①P<0.05圖2 CST1 mRNA在食管癌中的表達(dá)

2.2CST1蛋白在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中的表達(dá):HPA數(shù)據(jù)庫中三種不同抗體(三家不同公司生產(chǎn)的CST1抗體)免疫組化分析結(jié)果均顯示，CST1蛋白在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中不表達(dá)。見圖3。

圖3 三家不同公司生產(chǎn)CST1抗體檢測CST1蛋白在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中的陰性表達(dá)

2.3CST1在不同人種食管癌患者中的表達(dá):UALCAN數(shù)據(jù)庫分析表明，東亞人群中CST1在食管癌患者腫瘤組織中顯著高表達(dá)(P<10-7)。見圖4。

X軸：Normal(正常對照)，Caucasian(高加索人)，African-American(非洲裔美國人)，Asian(亞洲人)；Y軸：TPM(每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的轉(zhuǎn)錄本)圖4 CST1在不同人種食管癌患者中的表達(dá)

2.4CST1表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系:UALCAN數(shù)據(jù)庫分析表明，CST1在食管腫瘤鱗狀細(xì)胞癌和腺癌組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖5A。食管癌腫瘤分期Ⅱ期，Ⅲ期，Ⅳ期腫瘤組織中CST1與正常組織相比高表達(dá)(P<0.05)。見圖5B。腫瘤分級Ⅰ級、Ⅱ級腫瘤組織中CST1與正常組織相比高表達(dá)(P<0.05)。見圖5C。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)N1，N2和N3腫瘤組織中CST1與正常組織相比高表達(dá)(P<0.05)。見圖5D。

圖5 CST1表達(dá)與食管癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5CST1表達(dá)對食管癌預(yù)后的影響:UALCAN數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，CST1高表達(dá)的食管癌患者生存期與CST1中低表達(dá)的食管癌患者相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.95)。見圖6A。CST1表達(dá)結(jié)合腫瘤分級表明，生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034)。見圖6B。

A：CST1表達(dá)對食管癌患者生存的影響；B：CST1表達(dá)結(jié)合腫瘤分級對食管癌患者生存的影響圖6 CST1表達(dá)對食管癌預(yù)后的影響

2.6siRNA敲低CST1后對食管癌細(xì)胞株細(xì)胞增殖能力的影響：兩條CST1 siRNA轉(zhuǎn)染TE-1和 KYSE520細(xì)胞后，實時定量PCR檢測結(jié)果表明，與siNC組相比siCST1組CST1的表達(dá)水平均顯著下調(diào)。見圖7A；CCK-8結(jié)果顯示在兩株細(xì)胞中siCST1-1和siCST1-2組細(xì)胞在培養(yǎng)2 d后OD值均低于siNC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，敲低CST1抑制了細(xì)胞的增殖能力。見圖7B，圖7C。

A：實時定量PCR檢測結(jié)果；B,C：CCK-8試驗檢測細(xì)胞增殖能力；與siNC組相比，①P<0.01圖7 siRNA敲低CST1后對TE-1和 KYSE520細(xì)胞增殖能力的影響

2.7siRNA敲低CST1后對食管癌細(xì)胞株細(xì)胞周期的影響：兩條CST1 siRNA轉(zhuǎn)染TE-1和 KYSE520細(xì)胞后，細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明，與siNC組相比，siCST1-1和siCST1-2組G1期細(xì)胞增加，而G2和S期細(xì)胞減少。見圖8A、圖8B；Western印跡結(jié)果表明，兩株細(xì)胞中siCST1-1和siCST1-2組CST1和cyclin D1蛋白表達(dá)水平均顯著低于siNC組。見圖8C。以上結(jié)果表明siRNA敲低CST1后細(xì)胞周期阻滯。

A、B：流式細(xì)胞術(shù)檢測siRNA轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞周期的影響；C：Western印跡檢測CST1、Cyclin D1蛋白結(jié)果圖8 siRNA敲低CST1后對TE-1和 KYSE520細(xì)胞周期的影響

3 討論

近年來，隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)已進(jìn)入大數(shù)據(jù)時代?；跀?shù)據(jù)的獲取積累、匯聚共享及挖掘利用的大數(shù)據(jù)分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床診治中發(fā)揮了重大作用。研究者們可以通過TCGA數(shù)據(jù)庫等平臺高效處理和分析海量基因測序數(shù)據(jù)，從中獲取高質(zhì)量的個性化腫瘤基因信息，并測試他們的研究假設(shè)[9]。

惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與基因突變、基因異常表達(dá)有著密切的關(guān)系。研究顯示CST1表達(dá)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。馮莉等研究[7]指出，CST1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且高表達(dá)患者生存期縮短，過表達(dá)CST1能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Dai等學(xué)者的研究[8]表明，CST1在膀胱癌中高表達(dá)，且CST1表達(dá)上調(diào)的患者復(fù)發(fā)率高。Choi等學(xué)者指出，胃癌中CST1基因高表達(dá)，RNA干擾其表達(dá)后可降低細(xì)胞增殖[11-12]。Dai等學(xué)者的研究[8]表明，CST1在乳腺癌組織中高表達(dá)，且與乳腺癌患者生存期負(fù)相關(guān)，CST1過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖，克隆形成，遷移及侵襲能力。而Chen等學(xué)者在食管癌中的研究[13]卻得出不同的結(jié)論，CST1在食管癌組織中低表達(dá)，而在正常組織中高表達(dá)，CST1表達(dá)與食管癌患者生存期呈正相關(guān)。

本研究從生物信息學(xué)角度，利用TCGA等數(shù)據(jù)庫分析表明CST1在結(jié)直腸癌，膀胱癌，胃癌，乳腺癌等腫瘤組織中高表達(dá)，這一結(jié)果與前述學(xué)者的研究一致。但數(shù)據(jù)庫分析表明CST1在食管癌組織中高表達(dá)，東亞人群中CST1在食管癌患者腫瘤組織中顯著高表達(dá)。且HPA數(shù)據(jù)庫中免疫組化分析結(jié)果顯示，CST1在正常食管鱗狀上皮細(xì)胞中不表達(dá)。這些結(jié)果均與Chen等學(xué)者CST1在食管癌組織中低表達(dá)的研究[13]結(jié)果相悖，推測可能是樣本選擇偏倚的原因，具體原因需進(jìn)一步研究。本研究進(jìn)一步通過細(xì)胞生物學(xué)實驗證實，敲低CST1抑制了細(xì)胞的增殖能力且細(xì)胞周期阻滯。

Choi等的研究[11]首次將CST1表達(dá)情況與患者pTNM分期結(jié)合分析，結(jié)果表明胃癌患者的pTNM分期越晚，腫瘤組織內(nèi)CST1表達(dá)越高。同時 CST1 的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究生物信息學(xué)分析結(jié)果也得到相似結(jié)果，同時食管癌患者CST1表達(dá)結(jié)合腫瘤分級分析，生存期差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

CST1表達(dá)與腫瘤發(fā)生和發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移之間的機制目前尚不明確。Kim等學(xué)者的研究[14]認(rèn)為CST1可與Cathepsin B競爭性結(jié)合CST3，該競爭性結(jié)合作用可以抵消CST3對組織蛋白酶的抑制活性，使細(xì)胞中組織蛋白酶活性恢復(fù)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。而徐湖波等學(xué)者的研究[12]認(rèn)為抑制CST1表達(dá)可降低p-STAT3，PCNA，MMP-2和MMP-9的表達(dá)，提示CST1基因?qū)Y(jié)直腸癌細(xì)胞生長的影響與下調(diào)STAT3信號通路有關(guān)。本研究尚未對其機制開展進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)，對TCGA等數(shù)據(jù)庫中食管癌患者CST1基因進(jìn)行分析，表明CST1在食管癌患者中高表達(dá)。其表達(dá)與臨床病理特征及生存期相關(guān)。同時從細(xì)胞生物學(xué)的角度驗證了敲低CST1抑制了細(xì)胞的增殖能力且細(xì)胞周期阻滯。CST1表達(dá)與食管癌發(fā)生和發(fā)展以及侵襲轉(zhuǎn)移之間的機制值得進(jìn)一步的研究。CST1基因可能是食管癌治療和預(yù)后的潛在靶標(biāo)。