胡美華 ,劉秀娟 ,萬全玉 ,胡貴祥 ,段文麗 ,王歌云

(1.南昌師范學(xué)院 化學(xué)與食品科學(xué)學(xué)院,南昌 330032;2.傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室研究基地,江西省動物源與媒介生物性傳染病重點實驗室,南昌市疾病預(yù)防控制中心,南昌 330038)

玉米赤酶烯酮(ZEN)是由鐮刀菌產(chǎn)生的一種真菌毒素,又稱F-2毒素,其化學(xué)名稱為6-(10-羥基-6-氧基碳烯基)-B-二羥基苯甲酸-H-內(nèi)酯,廣泛存在于小麥、玉米、大米等谷物及其制品中[1]。當(dāng)食用被ZEN 污染的食物后,ZEN 通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積,易引起生殖發(fā)育毒性和免疫毒性,嚴(yán)重威脅人類健康[2]。因此,許多國家和組織將ZEN 在食品中的含量作了限制,如歐盟規(guī)定各類谷物及其制品中ZEN 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20～400μg·kg－1[3];我國規(guī)定谷物及其制品中ZEN 的限量為60μg·kg－1[4]。

近年來,國內(nèi)外已開發(fā)多種測定ZEN 的方法[5-6]。其中,高效液相色譜(HPLC)-熒光檢測法因成本低、準(zhǔn)確度高、靈敏度高等特點被廣泛使用[7]。眾所周知,儀器檢測前,樣品的前處理是非常關(guān)鍵的,不僅能有效去除雜質(zhì)干擾,還能富集目標(biāo)物,提高分析結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度。常見的前處理技術(shù)包括液-液萃取法[8]、固相萃取法[9]、免疫親和柱法[10]等。這些方法盡管在某種程度上提高了ZEN 檢測的靈敏度和選擇性,但液-液萃取和固相萃取在樣品的純化效率和選擇性方面不夠理想,免疫親和柱的使用成本較高[11]。因此,有必要開發(fā)一種環(huán)境友好、選擇性高、成本低廉的ZEN 前處理技術(shù),以適合現(xiàn)代綠色化學(xué)的要求。

磁性分子印跡聚合物是一種具有特異識別能力的高分子仿生納米材料[12]。基于以下原因,磁性分子印跡聚合物在樣品前處理領(lǐng)域引起了研究者的廣泛關(guān)注[13]。一是具有超順磁性,在外加磁場作用下,達到快速分離,提高了分離效率[14];二是具有分子印跡獨特性質(zhì)(選擇性高、穩(wěn)定性好、專一性高)[15]。然而,傳統(tǒng)分子印跡聚合物在制備過程中存在一些不足,例如制備步驟繁瑣,反應(yīng)條件苛刻[16],且以目標(biāo)物作為模板時,易引起模板泄漏造成假陽性現(xiàn)象,增加成本并給操作者帶來健康危害等[17-18]。為了有效避免上述缺點,開發(fā)一種簡單、綠色、快速的分子印跡聚合物的制備方法是有必要的。

槲皮素是一種植物提取物,其結(jié)構(gòu)與ZEN 結(jié)構(gòu)類似(見圖1),而毒性和成本相較ZEN 均要低。以槲皮素為模擬模板分子制備的分子印跡聚合物,已成功應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)中ZEN 的萃取和富集[19]。多巴胺(DA)是一種天然的生物分子,其結(jié)構(gòu)中含有－OH和－NH2,能夠在弱堿性環(huán)境下自聚合,形成一種親水性和生物相容性良好的聚多巴胺膜,可作用于任何材料的表面[20]。利用DA 的這一特性,用于分子印跡聚合物的制備,顯著縮減了傳統(tǒng)分子印跡聚合物的制備過程?；诙叩奶攸c,本工作以四氧化三鐵納米粒子(Fe3O4NPs)為磁源,槲皮素為模擬模板分子,DA 為功能單體和交聯(lián)劑,在三羥甲基氨基甲烷(Tris)-HCl緩沖溶液(pH 8.5)中,一步法制備 Fe3O4磁性分子印跡聚合物(Fe3O4＠PDA MIPs),并對所得到的Fe3O4＠PDA MIPs進行結(jié)構(gòu)表征和吸附性能評價。以ZEN 為研究對象,以Fe3O4＠PDA MIPs為固相吸附劑,優(yōu)化了萃取和富集條件,并結(jié)合HPLC,最終實現(xiàn)食品樣品中ZEN 含量的測定。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

UltiMate 3000 型高效液相色譜儀;JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM);WQF-510A 型傅里葉變換紅外光譜(FTIR)儀;DP63C 型真空干燥箱;KQ-500DB型超聲波清洗器;2-16 KL型離心機;所有玻璃儀器均經(jīng)體積比為3∶1 的鹽酸-硝酸混合液浸泡、水沖洗,并烘干備用。

ZEN 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液:1 g·L－1,準(zhǔn)確稱取1 mg ZEN,用乙腈溶解并定容于1 mL 容量瓶中,混勻,配制成質(zhì)量濃度為1 g·L－1的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,于－20 ℃的冰箱中儲存,使用前自然恢復(fù)至室溫。

ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液:5 mg·L－1,移取適量的ZEN標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于10 mL容量瓶中,用乙腈稀釋至刻度,混勻,配制成質(zhì)量濃度為5 mg·L－1的ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液,于－20 ℃的冰箱中儲存,使用前自然恢復(fù)至室溫。

ZEN 的純度為99.5%;黃曲霉毒素B1(AFB1)的純度大于99%;伏馬毒素B1(FB1)溶液,質(zhì)量濃度為50.5 mg·L－1;赭曲霉毒素A(OTA)的純度為98.14%;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)溶液,質(zhì)量濃度為100.5 mg·L－1;Tris的純度大于99.8%;甲醇、乙腈、乙酸均為色譜純;六水合三氯化鐵、無水乙酸鈉、乙二醇、多巴胺鹽酸鹽、槲皮素、鹽酸均為分析純;試驗用水為超純水。

食品樣品(大米、玉米、小麥、葡萄酒和食用油)均隨機購自某超市。

1.2 色譜條件

色譜條件參照GB/T 5009.209－2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤酶烯酮的測定》,并進行了部分改進。具體如下:Eclipse Plus C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,3μm);柱溫35 ℃;進樣體積20μL;熒光檢測器,激發(fā)波長274 nm,發(fā)射波長440 nm;流動相A 為乙腈,B 為水,C 為甲醇;流量1.0 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～4 min時,A 由40%升至55%,B 由52%降至37%,保持2 min;6～7 min時,A 由55%降至40%,B 由37%升至52%。

1.3 試驗方法

1.3.1 Fe3O4＠PDA MIPs的制備

Fe3O4＠PDA MIPs的制備參照本課題組前期研究[17],并略作改變。具體步驟如下:稱取Fe3O4NPs(本課題組前期已制備)0.2 g于三頸瓶中,加入10 mmol·L－1Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.5)80 mL,室溫機械攪拌1 h,直至磁性材料均勻分散。隨后,滴加含0.8 g·L－1槲皮素(模擬模板分子)的乙腈溶液5 mL,繼續(xù)攪拌2 h,使槲皮素分子充分與Fe3O4NPs表面接觸。接著,加入多巴胺鹽酸鹽100 mg,再次攪拌6 h后,用磁鐵將所得產(chǎn)物與溶液分離。用3%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸-20%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙腈混合液洗滌固體產(chǎn)物,直至模擬模板分子不被HPLC 檢出(紫外檢測波長為374 nm),再用水洗滌5次。最后,得到的Fe3O4＠PDA MIPs于45 ℃真空干燥24 h。Fe3O4磁性非分子印跡聚合物(Fe3O4＠PDA NIPs)采用相同的條件制備,僅制備過程中不添加模擬模板分子。

1.3.2 吸附性能試驗

稱取3 mg Fe3O4＠PDA MIPs置于10 mL 含不同初始質(zhì)量濃度(1.0～80.0 mg·L－1)的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液中,室溫下進行吸附試驗。超聲萃取5 min后磁分離,上清液用HPLC檢測,并根據(jù)公式(1)計算Fe3O4＠PDA MIPs 對ZEN 的吸附情況。以Langmuir[21]和Freumdlich[22]等溫吸附模型評價吸附劑的吸附性能[見公式(2)和(3)],通過數(shù)據(jù)擬合可分別得到公式(4)和(5)。

式中:qe為平衡吸附容量,mg·g－1;qmax為最大吸附容量,mg·g－1;ρ0 和ρe 分別表示初始質(zhì)量濃度和平衡質(zhì)量濃度,mg·L－1;V為溶液體積,m L;m為吸附劑的質(zhì)量,g;b、Kf和n表示Langmuir和Freumdlich的常數(shù)。

1.3.3 樣品分析

1)提取 依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.209－2016中方法對樣品進行提取,略作改進,具體如下:固體樣品稱量前需粉碎,液體樣品需混勻。稱取40.0 g樣品于燒杯中,加入體積比為9∶1的乙腈-水的混合液100 mL,超聲提取30 min,過濾,備用。

2)萃取和凈化 準(zhǔn)確移取上述提取液20 mL于頂空瓶中,氮氣吹至近干,再分別加入30 mg Fe3O4＠PDA MIPs和10 mL 水,室溫超聲萃取5 min后,在外加磁鐵作用下,將磁性分子印跡聚合物從溶液中分離,棄去上清液。在頂空瓶中加入2 mL乙腈解吸2次(每次1 mL),磁鐵分離。吸取0.5 mL解吸液于1.5 mL 進樣瓶中,加入0.5 mL水,其目的是保證進樣溶液與初始流動相接近,混勻,供HPLC測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 Fe3 O4＠PDA MIPs的制備和表征

試驗以槲皮素為模擬模板分子制備磁性分子印跡聚合物,制備過程如圖1所示?；贒A 在弱堿性環(huán)境下自聚合作用,Fe3O4NPs表面形成一層聚多巴胺薄膜;聚多巴胺結(jié)構(gòu)中－NH2和－OH 官能團和槲皮素結(jié)構(gòu)中－OH 和＝O 官能團之間通過非共價鍵作用,有效地將槲皮素固定在其中;洗脫后,該材料表面形成了與槲皮素在空間構(gòu)型上相匹配的孔穴和結(jié)合位點。利用槲皮素在結(jié)構(gòu)上與ZEN 相似的特點,Fe3O4＠PDA MIPs能有效吸附ZEN,達到分離富集的目的。

圖1 ZEN 和槲皮素的結(jié)構(gòu)以及Fe3 O4＠PDA MIPs的制備過程Fig.1 Structures of ZEN and quercetin,and the preparation process of Fe3 O4＠PDA MIPs

采用TEM 對Fe3O4NPs 和Fe3O4＠PDA MIPs的形貌進行表征,見圖2。

由圖2可知:Fe3O4NPs的分散性好,形貌為中空結(jié)構(gòu);在Fe3O4NPs表面明顯被一層灰色聚多巴胺包裹[見圖2(b)箭頭所示],厚度約為13 nm,該數(shù)據(jù)表明,分子印跡薄層已成功包裹在Fe3O4NPs表面。

圖2 Fe3 O4 NPs和Fe3 O4＠PDA MIPs的TEM 圖Fig.2 TEM images of Fe3 O4 NPs and Fe3 O4＠PDA MIPs

通過KBr 壓片獲得了DA、Fe3O4NPs 和Fe3O4＠PDA MIPs的FTIR 圖,見圖3。

圖3 DA、Fe3 O4 NPs和Fe3 O4＠PDA MIPs的FTIR 圖Fig.3 FTIR spectra of DA,Fe3 O4 NPs and Fe3 O4＠PDA MIPs

由圖3可知:在聚多巴胺包裹之前,Fe3O4NPs位于3 417 cm－1與569 cm－1處的吸收峰歸因于官能團－OH 和Fe－O 的伸縮振動(曲線2);從Fe3O4＠PDA MIPs 的紅外光譜圖來看,在1 616 cm－1處出現(xiàn)的吸收峰歸因于DA 芳香環(huán)中C＝C官能團的伸縮振動(曲線3),這表明在Fe3O4NPs表面包裹著一層聚多巴胺。

2.2 萃取條件的優(yōu)化

整個優(yōu)化過程以ZEN 回收率來評價萃取效率,考察了Fe3O4＠PDA MIPs用量、溶液酸度、超聲萃取時間、解吸溶劑種類和解吸方式等因素對萃取效率的影響。

2.2.1 Fe3O4＠PDA MIPs用量

試驗考察了Fe3O4＠PDA MIPs用量分別為2,5,10,20,30,50 mg時對ZEN 萃取效率的影響。結(jié)果表明:當(dāng)Fe3O4＠PDA MIPs的用量從2 mg增大到30 mg時,Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的萃取效率逐漸增大,ZEN 回收率由20.2%增加到82.8%;繼續(xù)增加Fe3O4＠PDA MIPs的用量,ZEN 的回收率無明顯變化。因此,試驗選擇30 mg 作為Fe3O4＠PDA MIPs的用量。

2.2.2 溶液酸度

據(jù)文獻[23]報道,當(dāng)溶液p H＜2時,磁性納米材料易被分解。因此,試驗重點考察了溶液pH 分別為2,3,4,5,6,7,8,9 時Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 萃取效率的影響。結(jié)果表明:當(dāng)溶液pH 為2～6時,Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的萃取效率基本保持不變,回收率為82.7%;隨著溶液pH 繼續(xù)增大,Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的萃取效率逐漸下降,甚至降至6.6%(pH 9)。這可能由于溶液p H＜6時(ZEN 的pKa為7.6[24]),ZEN 被質(zhì)子化,使其表面帶有正電荷,與PDA 的負(fù)電荷通過靜電吸引力拉近了與Fe3O4＠PDA MIPs材料之間的距離,進而促進了ZEN 在分子印跡孔穴中的吸附?？紤]到該分子印跡聚合物在水溶液中原始pH 為5.7,為保證試驗操作的方便性,本試驗不調(diào)節(jié)溶液的酸度,即溶液pH 為5.7。

2.2.3 超聲萃取時間

超聲萃取能有效地將Fe3O4＠PDA MIPs快速分散于溶液中,縮短了其與ZEN 分子接觸時間,提高了工作效率。為此,試驗考察了超聲萃取時間在1～20 min內(nèi),Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 萃取效率的影響。結(jié)果表明:當(dāng)超聲萃取時間為1～5 min時,該分子印跡聚合物對ZEN 萃取效率呈現(xiàn)明顯增大趨勢;當(dāng)超聲萃取時間大于5 min時,萃取效率達到最大值且保持不變(回收率為83.4%)。因此,試驗選擇5 min作為超聲萃取時間。

2.2.4 解吸溶劑種類和解吸方式

試驗對比了在甲醇、乙腈、含0.5%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸的甲醇溶液和含0.5%乙酸的乙腈溶液等4種溶劑解吸下ZEN 的洗脫效果,結(jié)果見圖4。

由圖4可知,甲醇和含0.5%乙酸的甲醇溶液對ZEN 的解吸效率明顯低于乙腈和含0.5%乙酸的乙腈溶液,且酸的加入對解吸效率無明顯影響。因此,試驗選擇乙腈作為解吸溶劑。

圖4 解吸溶劑對ZEN 洗脫效果的影響Fig.4 Effect of desorption solvent on elution effect of ZEN

試驗進一步考察了1 mL 乙腈解吸1次、2 mL乙腈解吸1次、2 mL乙腈解吸2次(每次1 mL)等3種解吸方式對ZEN 解吸效率的影響。結(jié)果表明,ZEN 的回收率依次為82.8%,83.5%,87.1%,當(dāng)采用2 mL乙腈解吸2次(每次1 mL)的方式解吸時,能滿足對ZEN 解吸效率的要求。因此,試驗選擇2 mL乙腈解吸2次(每次1 mL)的方式進行解吸。

2.3 Fe3 O4＠PDA MIPs的特異性

在吸附材料為30 mg、溶液pH 為5.7、超聲萃取時間為5 min、2 mL 乙腈解吸2次(每次1 mL)的解吸方式等優(yōu)化的試驗條件下,試驗還考察了Fe3O4＠ PDA MIPs、Fe3O4＠ PDA NIPs 和Fe3O4NPs對ZEN 的吸附和富集情況。結(jié)果表明,Fe3O4＠PDA MIPs、Fe3O4＠PDA NIPs和Fe3O4NPs對ZEN 的萃取回收率分別為87.1%,53.7%和8.7%,后兩種材料的富集能力明顯低于Fe3O4＠PDA MIPs,可能歸因于這兩種材料表面未有與ZEN 在空間構(gòu)型上相匹配的孔穴,僅依靠π-π鍵和物理作用將ZEN 吸附。不同吸附材料對10μg·L－1ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液吸附富集后的色譜圖見圖5。

由圖5 可知:相較于直接進樣的色譜圖,采用Fe3O4＠PDA MIPs吸附后的ZEN 的保留時間和峰面積幾乎一致;然而,經(jīng)Fe3O4＠PDA NIPs富集后,ZEN 峰面積明顯較小;而采用Fe3O4NPs吸附時,沒有檢出ZEN。這進一 步證明 了Fe3O4＠PDA MIPs印跡空腔的形成,展示了對ZEN 的特異性富集。

圖5 不同吸附材料處理下ZEN 的色譜圖Fig.5 Chromatograms of ZEN acquired under the treatment of different adsorbent materials

2.4 Fe3 O4＠PDA MIPs的穩(wěn)定性

為了進一步評價Fe3O4＠PDA MIPs的穩(wěn)定性,將Fe3O4＠PDA MIPs連續(xù)進行吸附-洗脫-吸附循環(huán)試驗。每進行下一次吸附前均采取10 mL 解吸溶劑(乙腈)活化2次,每次5 mL。結(jié)果顯示,該材料在經(jīng)過7次循環(huán)使用后,對ZEN 的吸附能力沒有明顯下降,回收率穩(wěn)定在85.1%左右,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%。這說明Fe3O4＠PDA MIPs具有良好的穩(wěn)定性,至少可重復(fù)使用7次,節(jié)約了試驗成本。

2.5 吸附性能

對公式(1)計算的結(jié)果作圖(圖6)可知,隨著ZEN 初始質(zhì)量濃度的增加,Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的平衡吸附容量逐漸增大,且ZEN 初始質(zhì)量濃度為20 mg·L－1時,該分子印記聚合物對ZEN的吸附達到飽和,得到平衡吸附容量,為1.28 mg·g－1。由公式(4)和(5)分別計 算,25 ℃時,Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的Langmuir等溫吸附模型參數(shù)為:qmax為1.49mg·g－1,b為0.22 L·mg－1,相關(guān)系數(shù)R2為0.993 0。Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的Freundlich等溫吸附模型參數(shù)為:Kf為0.061,n為1.20,相關(guān)系數(shù)R2僅為0.925 0。這闡明了Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 吸附方式符合Langmuir模型,即Fe3O4＠PDA MIPs通過單分子層的形態(tài)將ZEN 吸附在其表面,且最大吸附容量為1.49 mg·g－1,與試驗測定值接近。

圖6 等溫吸附曲線Fig.6 Isothermal adsorption curve

2.6 共存物的影響

為了評價試驗制備的Fe3O4＠PDA MIPs的選擇性,選取食品中常見真菌毒素(AFB1、FB1、OTA和DON)為模型,考察了在各共存物存在下,該分子印記聚合物對ZEN 吸附能力的影響。試驗規(guī)定,測定誤差的絕對值小于5%,且萃取回收率大于80%,表示共存物不干擾目標(biāo)物的檢測。試驗向5μg·L－1ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液中分別加入不同質(zhì)量濃度的上述單一真菌毒素,采用最優(yōu)試驗條件萃取,以HPLC測定。結(jié)果顯示,150倍(750μg·L－1)的AFB1和DON,200倍(1 000μg·L－1)的FB1和OTA 均不干擾Fe3O4＠PDA MIPs對ZEN 的萃取和檢測。因此,Fe3O4＠PDA MIPs展示出對ZEN 的較高選擇性。

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

向頂空瓶中分別加入30 mg Fe3O4＠PDA MIPs和10 mL質(zhì)量濃度分別為1,2,5,10,20μg·L－1的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,在優(yōu)化的試驗條件下測定。以ZEN 的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到線性回歸方程為y＝4.229×103x－9.464×102,線性范圍為1～20μg·L－1,相關(guān)系數(shù)r為0.999 8。

以3倍信噪比(S/N)計算ZEN 的檢出限(3S/N),得到結(jié)果為0.68μg·L－1,明顯低于國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.209－2016中的檢出限(10μg·L－1)。

2.8 精密度和回收試驗

按照試驗方法分析5種不同基質(zhì)樣品(玉米、大米、小麥、食用油和葡萄酒),結(jié)果均未檢出ZEN。向上述5種陰性基質(zhì)樣品中添加質(zhì)量濃度為2,10,16μg·L－1的ZEN 標(biāo)準(zhǔn)溶液,進行加標(biāo)試驗,每個加標(biāo)水平平行測定5 次,計算回收率和測定值的RSD,結(jié)果見表1。

由表1可知,在實際樣品中ZEN 的加標(biāo)回收率為80.1%～101%,RSD 為5.0%～8.6%。這表明以該分子印跡聚合物為固相萃取劑,結(jié)合HPLC 對ZEN 的檢測結(jié)果展現(xiàn)出較為滿意的精密度和準(zhǔn)確度。

表1 精密度和回收試驗結(jié)果(n＝5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

本工作以表面印跡技術(shù)為基礎(chǔ),以Fe3O4NPs為磁核,槲皮素為模擬模板分子,DA 為功能單體和交聯(lián)劑,在室溫條件下,一步法制備了磁性分子印跡聚合物。該聚合物表現(xiàn)出以下特征:①超順磁性,無需離心或過濾操作,就能快速從溶液中分離,節(jié)約時間和成本;②高選擇性,利用與模擬模板分子在空間構(gòu)型上相類似的孔穴,準(zhǔn)確識別ZEN;③克服了因模板泄露而引起的誤差。與傳統(tǒng)分離材料相比,基于Fe3O4＠PDA MIPs建立的前處理方法具有材料使用量小、富集能力強、選擇性高、可重復(fù)使用的優(yōu)點,與HPLC-熒光檢測法結(jié)合,構(gòu)建了ZEN的定量分析方法。該方法準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度均能滿足復(fù)雜食品樣品中ZEN 的檢測需求,具有較好的應(yīng)用前景。