李 涵，樊成奇，陳 莎，周 進(jìn)，周俊芳，陸亞男，馬麗艷，田曉清，3

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部低洼鹽堿地水產(chǎn)養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

地球表面約70%以上的面積都是海洋，海洋由于其特殊的環(huán)境（高壓、高鹽、低溫等）擁有著非常豐富的微生物資源［1］。為了在海洋獨(dú)特的環(huán)境中生存，海洋微生物產(chǎn)生了不同的適應(yīng)機(jī)制，包括產(chǎn)生一些特定的生物分子，以及一些陸生環(huán)境中未曾發(fā)現(xiàn)的具有生物活性的化合物等［2］。種類豐富、代謝獨(dú)特的海洋微生物是海洋天然產(chǎn)物的重要生產(chǎn)力，也是發(fā)現(xiàn)新藥的一個重要來源［3］，這一方面彌補(bǔ)了因新的陸生生物活性次級代謝產(chǎn)物越來越少的不足［4］，另一方面也為發(fā)現(xiàn)新的活性次級代謝產(chǎn)物提供了新的途徑。

海洋來源的真菌，其次級代謝產(chǎn)物因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和活性的多樣性，在近些年受到了研究者們的廣泛關(guān)注。在來源于南海海域可培養(yǎng)真菌中已經(jīng)分離到多種具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，例如核苷類［5］、萜類［6－7］、吲哚生物堿類［8］、聚酮類化合物［9］、生物堿［9－10］等，分離出來的次級代謝產(chǎn)物具有很好的抗菌活性［9］、抗腫瘤活性［9］、抗氧化活性［9］、抗細(xì)胞毒性［10］、抗煙草花葉病毒［11］等。由此可見，從海洋來源的真菌中發(fā)掘新的活性物質(zhì)具有很好的發(fā)展前景。

南海是中國面積最大的海域，地處熱帶-亞熱帶地區(qū)，最大深處大于5 000 m，周圍有多種生態(tài)系統(tǒng)分區(qū)如海島、珊瑚、紅樹林等［12］，蘊(yùn)含著非常豐富的微生物資源，是研究海洋微生物多樣性的理想?yún)^(qū)域之一。但近年來對南海微生物的多樣性研究主要集中在沉積物中［13－15］，僅有少數(shù)文獻(xiàn)對海水中微生物的多樣性進(jìn)行報(bào)道［16－20］。本文通過對南海表層海水微生物的多樣性及真菌粗提物的組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制活性、抗腫瘤和抑菌活性進(jìn)行研究，旨在篩選和發(fā)現(xiàn)可以作為海洋藥物來源的天然產(chǎn)物，為南海微生物資源開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

海水樣品的采集和保存：2019年10月于南海北部海域選取8個站位（15號、17號、19號、21號、39號、41號、43號和45號站位）采集樣品，具體站位信息如表1。樣品采集后冷藏運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱中保存。

表1 南海北部海域采樣站位信息Tab.1 Information of sampling stations in the northern South China Sea

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離和純化

海水樣品5 L，用0.22μm的無菌濾膜過濾，濾膜剪碎后放入無菌離心管中，加入10 mL無菌水充分振蕩混勻后靜置于4℃冰箱過夜。取菌懸液1 mL至9 mL無菌水中，常溫混勻，并梯度稀釋3次（10－1、10－2、10－3），取300μL混合液至細(xì)菌、真菌平板中，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～28 d。所有分離培養(yǎng)基均按照文獻(xiàn)［21］方法配制。真菌分離培養(yǎng)基：YPD合成培養(yǎng)基、PDA合成培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基；細(xì)菌分離培養(yǎng)基：2216E合成培養(yǎng)基；放線菌分離培養(yǎng)基：高氏1號培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、Qligo培養(yǎng)基、2216E合成培養(yǎng)基。肉眼觀察菌落的特征（形態(tài)、大小、顏色等），初步篩選后挑選出不同形態(tài)的菌落至相對應(yīng)的培養(yǎng)基中，三線法純化至單菌落，斜面保存至4℃冰箱中。真菌分離過程中在培養(yǎng)基中兩兩加入抗生素：青霉素、鏈霉素、氯霉素各30 mg·mL－1。細(xì)菌分離過程中在培養(yǎng)基中兩兩加入抗生素：放線菌酮50 mg·mL－1，萘啶酮酸25 mg·mL－1，重鉻酸鉀50 mg·mL－1。

1.2.2 菌株鑒定

將微生物單菌落分別接種到5 mL相應(yīng)液體培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱中28℃，160 r·min－1培養(yǎng)2～5 d。細(xì)菌DNA提取，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Takara miniBest Bacteria DNA Extraction Kit Ver3.0，生工生物工程（上海）股份有限公司）說明書步驟提取目標(biāo)基因組DNA。真菌DNA委托上海生工生物工程有限公司進(jìn)行提取，根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒（E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit（M5635-02），OMEGA）說明書步驟提取目標(biāo)基因組DNA。

使用細(xì)菌通用引物：27F：（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R：（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）；真菌通用引物：ITS1：（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4：（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。

細(xì)菌PCR反應(yīng)體系為50μL：2X Taq PCR Master Mix 25μL，DMSO 0.5μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2μL，ddH2O 20.5μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5 min；變性95℃30 s、退火56℃30 s、延伸72℃1 min，35個循環(huán)；延伸72℃10 min。真菌PCR反應(yīng)系為25μL：10X PCR Buffer 2.5μL，MgCl（25 mmol·L－1）2μL，dNTP（2 mmol·L－1）0.5μL，上下引物各1μL，Taq DNA Polymerase（5 U·μL－1）0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 16.5μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃5 min；變性94℃30 s、退火60℃30 s、延伸72℃1 min，35個循環(huán)；延伸72℃8 min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將所測得細(xì)菌序列上傳至EZbiocloud網(wǎng)站進(jìn)行比對，真菌序列提交至NCBI網(wǎng)站并進(jìn)行Blast比對，下載同源性較高的序列，用Clustal W對所得序列進(jìn)行校正比對分析，利用Mega 7.0軟件構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 真菌培養(yǎng)與粗提物制備

結(jié)合真菌序列比對結(jié)果和真菌所處站位的不同，從中挑選出16株真菌（表2）在真菌平板上活化。挑取一定量活化好的菌絲體接種于500 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28℃、120 r·min－1條件下培養(yǎng)18 d。培養(yǎng)結(jié)束后加入1.5 L無水乙醇浸泡，靜置過夜，超聲2次，每次30 min，待菌絲體沉降后，收集濾液，減壓濃縮，濃縮液用DMSO溶解，制成10 mg·mL－1的粗提物備用。

表2 參與活性篩選的16株真菌的具體分類信息匯總Tab.2 Summary of specific taxonomic information of 16 strains of fungi in activity screening

1.2.4 活性篩選

1.2.4.1 HDAC抑制活性篩選

按照HDAC抑制劑藥物篩選試劑盒（BioVision，貨號K340-100）說明書操作。采用黑色96孔板，總反應(yīng)體系為100μL。SAHA作為陽性對照1，以DMSO溶解，配置成100μmol·L－1的SAHA溶液；TSA（試劑盒自帶的抑制劑）作為陽性對照2。Reaction Mix體系為50μL：10μL 10X HDAC Assay Buffer，2 μL Hela Nuclear Extract，5μL HDAC Substrate，33μL超純水。待測粗提物反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，49 μL的超純水，1μL的待測粗提物。陽性對照1的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，49μL的超純水，1μL的SAHA溶液。陽性對照2的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，47μL的超純水，2 μL的DMSO溶液，1μL的TSA溶液。陰性對照的反應(yīng)體系為50μL的Reaction Mix，49μL的超純水，1μL的DMSO。每個樣本設(shè)置3個平行重復(fù)，計(jì)算HDAC的抑制活性。

1.2.4.2 抗腫瘤活性篩選

按照MTT［22］法測定16株真菌粗提物對HeLa細(xì)胞（購自中科院細(xì)胞庫，上海）的活性。真菌粗提物稀釋到60μg·mL－1，紫杉醇作為陽性對照其濃度為2μg·mL－1，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4.3 抑菌活性篩選

按照K-B紙片法［23］測定16株真菌粗提物的抑菌活性。具體步驟為：將10 mg·mL－1的真菌粗提物稀釋至0.2 mg·mL－1，將待測的兩株指示菌嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、維氏氣單胞菌（Aeromonas vickers）（來源于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所）接種到液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)12 h進(jìn)行菌株活化，調(diào)整其菌液濃度為104個·mL－1。將兩株指示菌液分別吸取100μL均勻涂布在LB固體平板上。等待菌液吸收后，在平板上放置滅菌的濾紙片，加入稀釋后的真菌粗提物5μL，28℃培養(yǎng)12 h，空白平板作為陰性對照，以抑菌圈的直徑來表示粗提物抑菌活性的強(qiáng)弱，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離結(jié)果

采用稀釋涂布的方法對2019年采集的8個站位的海水樣品中微生物進(jìn)行菌株分離培養(yǎng)。經(jīng)16S rRNA基因序列比對分析，合并相似度在98%以上的菌株為同一種［24］，共分離得到162株細(xì)菌。對162株細(xì)菌進(jìn)行16SrRNA基因序列比對結(jié)果顯示：分屬于4個門，5個綱，15個目，21個科，35個屬的61個種，系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建如圖1。從門水平上來看，變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinomycetes）為優(yōu)勢類群，變形菌門一共分 離 出105株，其 中α-變 形 菌 綱（α-Proteobacteria）84株，占51.8%，γ-變形菌綱（γ-Proteobacteria）21株，占12.9%。放線菌門50株，占30.8%，擬桿菌門（Bacteroidetes）4株，占2.5%，厚壁菌門（Firmicutes）3株，占1.9%。

圖1 基于NJ法對部分細(xì)菌代表菌株16S r RNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Neighbour-joining（NJ）tree based on bacterial 16S r DNA sequences of some representative bacterial strains

從屬水平上來看（圖2），微桿菌屬（Microbacterium）和赤桿菌屬（Erythrobacter）為優(yōu)勢屬，分別分離得到40株和23株，袁其鵬屬（Qipengyuania）、假單胞菌屬（Pseudomonas）和斯塔普氏菌屬（Stappia）分別分離得到14株、10株和9株。Salipiger屬 分 離 得 到6株，Brachybacterium、Citromicrobium、Marinobacter、Sulfitobacter屬各分離得到5株，Pseudooceanicola屬 分 離 得 到4株，Bacillus、Brevundimonas、Croceicoccus、Roseibium屬 各 分 離 得 到3株，Limimaricola、Mesoflavibacter、Psychrobacter、Paracoccus、Sphingobium屬各分離得到2株，Agrococcus、Arthrobacte、Chromohalobacter、Devosia、Dietzia、Gulosibacter、Halomonas、Janibacter、Leeuwenhoekiella、Pannonibacter、Pseudidiomarina、Salinicola、Thalassospira和Zunongwangia屬都只分離得到1株。

圖2 分離得到的細(xì)菌屬分類及數(shù)量占比情況Fig.2 Classification of isolated bacteria strains by genus and number proportion

從菌株數(shù)量上來看（圖3），Erythrobacter pelagi分離得到的菌株數(shù)量最多，共12株；E.flavus和Microbacterium aurantiacum、M.schleiferi次之，分別分離得到10、9、9株。

圖3 分離得到細(xì)菌種分類及數(shù)量占比情況Fig.3 Classification of specific species of isolated bacteria strains and number proportion

2.2 不同站位可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性

在不同站位間分離出來的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性有明顯差異。從門水平上來看（圖4-A），8個站位都分離到變形菌門和放線菌門的細(xì)菌，且在每個站位中變形菌門菌株數(shù)均高于放線菌門菌株數(shù)，只有3個站位分離到厚壁菌門和擬桿菌門。19號站位和21號站位分離得到細(xì)菌菌落組成相同，變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門菌株在這兩個站位中都有分離到。17號、39號和41號站位的細(xì)菌菌落為放線菌門和變形菌門。15號和45號站位雖然都分離到3個門的細(xì)菌，但是它們的菌落組成不一樣，兩個站位均分離到來自放線菌門和變形菌門中的細(xì)菌，15號站位未能分離到擬桿菌門細(xì)菌但分離到厚壁菌門的芽孢桿菌屬，45號站位未能分離到厚壁菌門但有來自擬桿菌門的細(xì)菌。

從屬水平上來看（圖4-B），15、19和21號站位分離到的屬種類最豐富，分別為15、13、14種，17號站位中分離出來的細(xì)菌數(shù)最少且屬的種類也最少，只有4個屬。Erythrobacter、Microbacterium、Qipengyuania這3個屬分布較廣，從7個 站 位 中 分 離 出 來。Stappia和Citromicrobium屬從5個站位中分離出來、Pseudomonas和Brevundimonas屬從4個站位中分離出來，Roseibium、Pseudooceanicola、Marinobacter和Bacillus屬從3個站位中分離出來，Salipiger、Paracoccus、Croceicoccus和Brevibacterium屬從2個站位中分離出來。另有20個屬的細(xì)菌都只在特定的站位中被分離出來，分屬于21、19、15、45和39號站位，占總屬多樣性的57%，其中21號站位分離出特定屬的數(shù)量是最多的（6個屬），19號站位中有5個屬，15號站位中有4個屬，45號站位中有3個屬，39號站位中有2個屬。

圖4 不同站分離得到細(xì)菌門（A）和屬（B）水平多樣性Fig.4 Phylum（A）and genus（B）level diversity of bacteria isolated from different sites

2.3 可培養(yǎng)真菌的多樣性

從8個站位的海水樣品中分離出真菌，共43株。經(jīng)過ITS基因序列比對后發(fā)現(xiàn)這43株真菌分屬于2個門，5個綱，7個目，7個科，7個屬的14個種，系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建如圖5。

圖5 基于NJ法對ITSr DNA序列的部分真菌所屬菌株構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.5 Neighbour-joining（NJ）tree based on fungi ITS r DNA sequences of some representative fungi strains

從門水平上來看，這43株真菌分屬于子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota），子囊菌門中所分離出來的菌株數(shù)量是最多的，有40株，其余3株是擔(dān)子菌門。從屬水平上來看，Aspergillus為優(yōu)勢屬，共分離得到21株，占48.8%；其次是Penicillium，分離得到9株，占20.9%； Cladosporium、 Cystobasidium、Purpureocillium、Exophiala和Candida分別分離得到5、3、2、2和1株，各占11.6%、7%、4.7%、4.7%和2.3%。從菌株數(shù)量上來看，Penicillium oxalicum分離得到的菌株數(shù)量是最多的，共分離得到9株，其次是Aspergillus versicolor，分離得到7株。A.sydowii和A.carneus則分別分離得到4株。Cystobasidium minutum和Aspergillus flavus分別分離得到3株。Purpureocillium lilacinum、Cladosporium halotolerans、 Cladosporium sphaerospermum和Exophiala xenobiotica分別分離得 到2株，Aspergillus hiratsukae、A.niger、A.tabacinus、Candida tropicalis和Cladosporium cladosporioides都分別只分離得到1株。從分離到的真菌序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中已有的序列相比，其相似性都大于98%。

2.4 部分真菌的活性分析

HDAC抑制活性篩選結(jié)果顯示（圖6），這16株真菌粗提物對HDAC均有一定的抑制作用，但與陽性對照組相比抑制率較低，抑制率在44%～54%之間，陽性對照組SAHA和TSA對HDAC的抑制率達(dá)92.3%和94.7%。Aspergillus sydowii b-96、Aspergillus versicolor h-291、Aspergillus versicolor e-118、Cladosporium halotolerans b-61、Cystobasidium minutum e-114、Penicillium oxalicum f-112、Cystobasidium minutum e-129、Penicillium oxalicum b-49的真菌粗提物對組蛋白去乙?；傅囊种坡试?0%～54%之間，其余真菌粗提物對HDAC的抑制率在44%～49%之間，A.sydowii b-96的真菌粗提物的抑制率最高，為54%，A.versicolor h-291的抑制率次之，為53%，A.flavus f-111的抑制率最低，為44%。

抗癌活性結(jié)果顯示（圖6），這16株真菌粗提物在濃度為60μg·mL－1時對Hela細(xì)胞的抑制率較低，其中編號為P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291的真菌粗提物對腫瘤細(xì)胞的抑制率為37%和35%，A.sydowii b-96和E.spinifera c-110這兩株真菌粗提物對Hela細(xì)胞的抑制率最低，僅為2%。

圖6 16株真菌HDAC、抗腫瘤活性篩選結(jié)果Fig.6 Screening results of HDAC and antitumor activity of 16 strains of fungi

抑菌活性測試發(fā)現(xiàn)，這16株真菌粗提物對嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌沒有抑菌效果。

3 討論

本研究從南海局部地區(qū)采集了8個站位的表層海水樣品，經(jīng)過基因序列比對分析后共分離得到162株細(xì)菌和43株真菌。162株細(xì)菌是由變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門組成的，其中α-變形菌綱和放線菌綱為優(yōu)勢類群，與蘇悅［16］從南海北部海域分離到的細(xì)菌的優(yōu)勢類群相同。本實(shí)驗(yàn)中分離到的厚壁菌門數(shù)量最少，且都是芽孢桿菌屬，與徐重［17］、盧靖雯等［18］從南海表層海水中分離的結(jié)果一致，而蘇悅［16］未能從南海北部海域表層海水中分離到厚壁菌門菌株。有研究顯示，可培養(yǎng)的芽孢桿菌屬在南海沉積物中分離到的菌株數(shù)量多于表層海水［25－27］，推測是芽孢桿菌屬在海水中的分布少于沉積物中，原因可能是海水中的營養(yǎng)物質(zhì)相較于沉積物中偏少，導(dǎo)致芽孢桿菌未能在海水中形成芽孢幫助它抵御復(fù)雜的海洋環(huán)境，不足以支撐其在海水中存活下來；亦或是實(shí)驗(yàn)室中使用的培養(yǎng)基選擇性不強(qiáng)，不適合芽孢桿菌的生長，對于海水中分離芽孢桿菌屬較少的原因還需要進(jìn)行更深入的探討。

基于本研究分離結(jié)果，不同站位分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性、數(shù)量存在差異。從采樣的空間水平分布來看，15～21號這4個站位的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性多于39～45號站位，造成站位間分離到的可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性差異的原因，可能是受到各個站位水文因素的影響，如洋流、營養(yǎng)組成［28］。

從8個站位中分離得到43株真菌，經(jīng)過與數(shù)據(jù)庫比對后其ITS序列與真菌相似性均大于98%。大多數(shù)的海洋真菌都屬于子囊菌門，從中分離到的擔(dān)子菌門代表性卻不足［29］，本實(shí)驗(yàn)中真菌分離結(jié)果與其相同。其中曲霉屬（Aspergillus）和青霉屬（Penicillium）為優(yōu)勢屬，分別占48.8%和20.9%。曲霉屬和青霉屬在自然界中分布較廣，從馮麗等［30］、曾奇等［15］和曲佳等［31］從南海沉積物中分離出的真菌多樣性結(jié)果來看，曲霉屬和青霉屬在沉積物中也為優(yōu)勢屬。

抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，真菌P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291粗提物對Hela細(xì)胞活性的抑制率最高，分別為37%和35%。AWAD等［32］對A.versicolor Faesay4進(jìn)行深層發(fā)酵后獲得L-谷氨酰胺酶，對其進(jìn)行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)其對人肝癌細(xì)胞（HepG-2）、結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT-116）、乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、肺癌細(xì)胞（A-549）和宮頸癌細(xì)胞（Hela）細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗癌活性，IC50分別為39.61、12.8、6.18、11.48、7.25μg·mL－1。SHI等［33］從海洋真菌P.oxalicum中分離出一種新型二氫噻吩縮合色酮（POA），POA是具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，被認(rèn)為是一種具有生物活性的抗癌藥物。本實(shí)驗(yàn)中，從兩株不同屬真菌中獲得的粗提物對Hela腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用，與既往文獻(xiàn)研究結(jié)果相似，后續(xù)可以對這兩株真菌擴(kuò)大發(fā)酵，以期從中分離出具有抗腫瘤活性的次級代謝產(chǎn)物。

WANG等［34］從中國西沙群島采集到的海綿上分離到一株Aspergillus sydowii，對其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后從乙酸乙酯提取部位分離得到一個已知化合物aspergillusene A，這種化合物對嗜水氣單胞菌有顯著的抗菌活性。LI等［35］從深海沉積物真菌A.versicolor SD-330中分離鑒定了1個新的芳香族雙烯型倍半萜和4個已知的類似物，其中3個化合物對嗜水氣單胞菌、大腸桿菌、遲緩愛德華菌和哈維弧菌等人畜共患致病菌具有選擇性抑制活性，最低抑菌濃度（MIC）為1.0～8.0 μg·mL－1。通 過 已 有 文 獻(xiàn) 表 明［34，35］，部 分Aspergillus真菌的次級代謝產(chǎn)物對水生致病菌如嗜水氣單胞菌有抑菌作用，而本實(shí)驗(yàn)中16株真菌的粗提物對嗜水氣單胞菌均沒有抑菌作用，推測是因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)中只測試了單一粗提物濃度，其中可能的活性次級代謝產(chǎn)物濃度低于其最低抑菌濃度，后續(xù)研究將繼續(xù)開展對這16株真菌分離鑒定的次級代謝產(chǎn)物的抑菌作用的篩選，有望發(fā)現(xiàn)活性化合物。

綜合以上分析，編號為P.oxalicum h-287和A.versicolor h-291兩株真菌的粗提物在活性篩選實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)優(yōu)異，HDAC抑制率為49%和53%，抗腫瘤抑制率為37%和35%，可以作為潛在的目標(biāo)活性菌株對其次級代謝產(chǎn)物和活性進(jìn)行深入研究。

4 小結(jié)

本文對南海局部地區(qū)表層海水中分離到的微生物進(jìn)行初步鑒定，共分離得到162株細(xì)菌和43株真菌。樣品中162株細(xì)菌屬于由變形菌門、放線菌門、擬桿菌門和厚壁菌門組成的35個屬，43株真菌屬于由子囊菌門和擔(dān)子菌門組成的14個種，該地區(qū)的微生物多樣性較高。通過對分離得到的部分真菌進(jìn)行HDAC活性、抗腫瘤活性和抑菌活性篩選后發(fā)現(xiàn)，16株真菌粗提物對HDAC都一定的抑制作用，對人宮頸癌細(xì)胞的抑制率在2%～37%范圍內(nèi)，對兩株細(xì)菌指示菌沒有抑菌效果。本研究結(jié)果可為研究南海菌株資源及其代謝產(chǎn)物提供資料，也可為研究人員從南海中發(fā)現(xiàn)有生物活性的天然藥物提供參考。

致謝：感謝浙江工業(yè)大學(xué)占扎君教授團(tuán)隊(duì)完成了體外抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)。