趙 炎，王叢叢，2，3，4，5，劉必林，2，3，4，5，林龍山，李 淵

（1.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；2.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；3.國(guó)家遠(yuǎn)洋漁業(yè)工程技術(shù)研究中心，上海海洋大學(xué)，上海 201306；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)開(kāi)發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；5.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部大洋漁業(yè)資源環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，上海 201306；6自然資源部第三海洋研究所，福建廈門(mén) 361005）

鳶烏賊（Sthenoteuthis oualaniensis）隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)（Mollusca），頭足綱（Cephalopoda），鞘亞綱（Coleoidea），槍形目（Teuthoidea），柔 魚(yú)科（Ommastrephidae），鳶烏賊屬，廣泛分布于赤道太平洋、印度洋等海域，其中以印度洋西北部和中國(guó)南海海域資源最為豐富［1－2］。鳶烏賊作為次要經(jīng)濟(jì)種，潛在資源量尤為可觀，南海鳶烏賊潛在資源量約為457萬(wàn)t［3］，西北印度洋鳶烏賊潛在資源量約為1 000萬(wàn)t［4］，具有極大的潛在商業(yè)價(jià)值。近年來(lái)，關(guān)于鳶烏賊的漁業(yè)資源［5－6］、漁業(yè)生物學(xué)［7］、營(yíng)養(yǎng)生態(tài)位［8］、角質(zhì)顎生長(zhǎng)特性［9］、耳石微結(jié)構(gòu)及微量元素［10－12］等方面的研究日趨完善。

鳶烏賊種群結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，種群內(nèi)除了不同產(chǎn)卵群外，尚具有不同的體型群，且分布較為廣泛。劉金立等［13］對(duì)西北印度洋海域兩個(gè)鳶烏賊種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)種群內(nèi)遺傳變異較高，且種群遺傳背景差異顯著。李敏等［14］利 用 線 粒 體NADH（nicotinamide adenine dinucleotide）脫氫酶亞基2基因（ND2）的全序列對(duì)南海兩個(gè)表型群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)種群之間存在顯著遺傳分化，但是各類(lèi)群分布范圍高度重合，不存在地理差異。劉連為等［15］采用線粒體細(xì)胞色素b基因?qū)|海、南海與菲律賓3個(gè)地理區(qū)域的鳶烏賊群體進(jìn)行遺傳研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)地理群體間遺傳差異顯著，在漁業(yè)管理上應(yīng)劃分為不同單元。李敏等［16］利用線粒體ND2、細(xì)胞色素氧化酶I（cytochrome oxidase subunit I，CO I）和16S核糖體DNA序列對(duì)南海的鳶烏賊進(jìn)行種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，研究發(fā)現(xiàn)，該海域兩個(gè)形態(tài)學(xué)群體（中型群和微型群）分布區(qū)域重合但是遺傳分化顯著，其中中型群和微型群遺傳分化達(dá)到種間水平，揭示該海域地理群體分布不單一的現(xiàn)象。

總體而言，關(guān)于鳶烏賊的遺傳結(jié)構(gòu)研究主要集中在南海、印度洋西北部和太平洋海域［13－17］，缺乏對(duì)東印度洋鳶烏賊的研究，且該海域鳶烏賊群體與其他海域群體間的關(guān)系也尚不明確。東印度洋赤道海域洋流模式復(fù)雜［18］，使得東印度洋赤道海域可能存在不同的種群遺傳模式。Cytb基因是廣泛應(yīng)用于種群遺傳結(jié)構(gòu)研究以及分子系統(tǒng)地理學(xué)研究重要分子標(biāo)記［19－21］。因此，本研究采用Cytb基因序列來(lái)檢測(cè)東印度洋赤道和南海海域的鳶烏賊種群遺傳結(jié)構(gòu)，以期填補(bǔ)東印度洋海域研究空缺，也期望為鳶烏賊漁業(yè)資源的可持續(xù)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 站點(diǎn)位置與采樣時(shí)間

本研究所用鳶烏賊樣本共120尾，其中鳶烏賊群體1（東印度洋北部）、2（東印度洋南部）采集于東印度洋赤道海域（60尾，88°E～92°E、2°N～5°S），群體3（南海南部）、4（南海北部）采集于南海海域（60尾，112°E～117°E、11°N～20°N），存放于船艙冷庫(kù)并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。采樣及分組情況見(jiàn)表1。

表1 鳶烏賊樣本站點(diǎn)信息Tab.1 Sample site information of S.oualaniensis

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA提取

實(shí)驗(yàn)中剪取背部或腹部肌肉組織，置于無(wú)菌離心管中，保存于冰箱備用。采用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）提取鳶烏賊基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的DNA質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)（NanoDrop2000C）DNA濃度以及純度A260/A280值，－80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

參照NCBI（National Center for Biotechnology Information）上傳的鳶烏賊線粒體DNA序列中Cytb基因，序列號(hào)：NC＿010636.1，使用Primer5.0軟件自行設(shè)計(jì)引物。引物序列為：

上游引物F：TGTTTAGTCGTTCAAGTGGCT

下游引物R：ACACTCAACACTCGACCGATC

PCR（polymerase chain reaction）反應(yīng)體系為25μL體系，其中Taq PCR Master Mix（2×）15 μL，上下游引物（10μmol·L－1）各1μL，DNA模板0.1μL，用ddH2O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃、2 min；變性94℃、30 S，退火58℃、45 S，延伸72℃、45 S，30個(gè)循環(huán)；最后延伸72℃、2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用紫外分光光度計(jì)（NanoDrop 2000C）檢測(cè)其濃度和A260/A280值。選取合格樣本送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化并進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)拼接之后，使用MEGA 7.0軟件進(jìn)行校對(duì)并加以人工比對(duì)，序列整理校對(duì)之后計(jì)算DNA的堿基組成、個(gè)體間以及種群間的遺傳距離。使用DNASP 5.0軟件計(jì)算單倍型多樣性指數(shù)（h）、單倍型數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)（π）等遺傳多樣性指數(shù)。構(gòu)建單倍型NJ（neighborjoining tree）進(jìn)化樹(shù)和最小跨度樹(shù)，揭示不同單倍型之間的連接關(guān)系，由NetWork 10.2軟件完成。利用Arlequin 3.5.2軟件進(jìn)行AMOVA（analysis of molecular variance）、兩兩群體之間的遺傳分化系數(shù)Fst（F-statistics）（重復(fù)次數(shù)1 000次）、Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)和核苷酸不配對(duì)分布的估算。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cytb基因片段序列分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析校對(duì)之后共獲得120條序列，長(zhǎng)度為757 bp，T、A、C、G堿基平均含量分別為36.9%、30.3%、15.2%、17.6%，其中A＋T含量（67.2%）明顯高于C＋G含量（32.8%）（表2）。在120條Cytb基因片段中共檢測(cè)到484個(gè)變異位點(diǎn)，其中包括單堿基變異位點(diǎn)31個(gè)，簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)453個(gè)，無(wú)插入和缺失，轉(zhuǎn)換和顛換分別為90個(gè)和109個(gè)。全部120條分析的序列一共定義了84個(gè)單倍型，其中單倍型H1、H5為S1和S2共有，單倍型H43、H44、H47、H49和H52為S3和S4共有；單倍型H2和H9為S1獨(dú)有，單倍型H22為S2獨(dú)有，單倍型H46為S3獨(dú)有，單倍型H81為S4獨(dú)有；其余單倍型僅為群體中單個(gè)個(gè)體具有，且沒(méi)有4個(gè)群體共享單倍型。

表2 鳶烏賊Cytb基因片段序列組成Tab.2 Sequence composition of Cytb gene of S.oualaniensis

2.2 種群遺傳多樣性

基于Cytb基因片段所有序列得到的4個(gè)群體總的單倍型多樣性指數(shù)（h）、單倍型數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)（π）和平均核苷酸差異數(shù)（k）分別為0.981、84、0.273 32、196.794。由表3可以看出，S3、S4的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)均高于S1和S2，尤其是核苷酸多樣性指數(shù)和平均核苷酸差異數(shù)顯著高于其他兩個(gè)群體。

表3 基于Cytb基因片段序列的鳶烏賊遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity index of S.oualaniensis based on Cytb sequence

AMOVA分析結(jié)果表明，來(lái)自群體間的遺傳變異為54.90%，且遺傳分化顯著（P＜0.01），來(lái)自群體內(nèi)部的遺傳變異為45.10%，地理隔離導(dǎo)致的遺傳變異要略高于群體內(nèi)部個(gè)體間的變異（表4）。

表4 基于Cytb基因序列的鳶烏賊群體AMOVA分析Tab.4 AMOVA analysis of S.oualaniensis based on Cytb sequence

評(píng)估群體間的遺傳分化常用遺傳分化系數(shù)（Fst），其取值范圍在0～1之間，數(shù)值大小與遺傳分化程度成正比［22］。根 據(jù)WRIGHT和MAXSON［23］的研究，本文中兩兩群體間的Fst分析表明（表5），S1與S2兩個(gè)群體間有中等程度遺傳分化；S3與S4兩個(gè)群體間沒(méi)有遺傳分化；東印度洋群體S1和S2與南海群體S3和S4之間遺傳分化很大。

表5 基于Cytb基因序列的鳶烏賊群體間遺傳分化系數(shù)（F st）分析Tab.5 F-statistics（F st）analysis among populations of S.oualaniensis based on Cytb sequence

基于Cytb基因序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，120個(gè)個(gè)體聚為3類(lèi)。絕大多數(shù)S1、S2聚為一類(lèi)；S1中有5個(gè)個(gè)體與S3、S4部分個(gè)體親緣關(guān)系較近；剩余S3、S4個(gè)體聚為一類(lèi)（圖1）。Cytb單倍型最小跨度樹(shù)呈現(xiàn)星狀結(jié)構(gòu)，單倍型之間通過(guò)多步突變或單一突變彼此相連接，S1和S2形成一個(gè)單倍型組群，S3和S4形成兩個(gè)單倍型組群（圖2）。

圖1 基于Cytb基因序列的鳶烏賊分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of S.oualaniensis based on Cytb sequence

圖2 基于Cytb基因序列的鳶烏賊單倍型最小跨度樹(shù)Fig.2 Reduced median network showing genetic relaionship in S.oualaniensis based on Cytb sequence

2.3 群體歷史動(dòng)態(tài)

Tajima’s D和Fu’s Fs中性檢驗(yàn)的D值和Fs值均為負(fù)值，且統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)如果均顯著，就可以證明該鳶烏賊群體近期內(nèi)可能經(jīng)歷過(guò)歷史擴(kuò)張。結(jié)果表明（表6），僅S2滿足該條件，對(duì)該群體核苷酸不配對(duì)分布進(jìn)行分析可得，核苷酸不配對(duì)分布圖呈現(xiàn)單峰類(lèi)型（圖3），S1、S3、S4均呈現(xiàn)雙峰。上述結(jié)果顯示，S2群體可能經(jīng)歷群體擴(kuò)張。核苷酸分歧速率按照2.15%/百萬(wàn)年～2.60%/百萬(wàn)年，基于Cytb核苷酸不配對(duì)分布可以得到τ值為2.429，計(jì)算得到S2的種群擴(kuò)張時(shí)間為7.3萬(wàn)年前—6.1萬(wàn)年前。

表6 鳶烏賊Cytb序列的中性檢驗(yàn)Tab.6 Result of neutrality test on Cytb sequences of S.oualaniensis

3 討論

3.1 種群遺傳多樣性及種群遺傳結(jié)構(gòu)

Cytb分子標(biāo)記由于進(jìn)化速率適中，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于柔魚(yú)種群內(nèi)、種群間遺傳研究，進(jìn)行遺傳多樣性分析［24－26］。其中根據(jù)Cytb核苷酸的分歧速率，常常被用來(lái)估算種群的歷史擴(kuò)張事件［27］?；贑ytb分子標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)，鳶烏賊兩個(gè)地理群體（東印度洋赤道、南海）均具有較高的單倍型多樣性（h＝0.981）和核苷酸 多 樣 性（π＝0.273 32），說(shuō)明兩個(gè)群體遺傳多樣性較高，遺傳資源豐富，這可能與鳶烏賊生命周期短、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)卵周期較長(zhǎng)且孵化期貫穿全年等生活史特性有關(guān)［28］。兩個(gè)地理群體核苷酸多樣性存在顯著差異，南海群體（π＝0.277 18）和（k＝200.001）遠(yuǎn)高于東印度洋群體（π＝0.007 57）和（k＝5.612），反映出每條序列間堿基組成差異巨大，極有可能是南海海域群體組成不單一，中型群和微型群多個(gè)種群交叉存在。

東印度洋三面皆是陸地，南部則是開(kāi)闊的海洋，因此形成了很多獨(dú)特性質(zhì)，主要表現(xiàn)在它具有季風(fēng)海洋的特點(diǎn)，在季風(fēng)影響下，洋流系統(tǒng)復(fù)雜多變。在印度洋季風(fēng)轉(zhuǎn)換期春季和秋季（4—5月、10—11月），印度洋赤道海域附近會(huì)出現(xiàn)一支自西向東的強(qiáng)流-赤道急流（Wyrtki），也有報(bào)道稱其核心位置在赤道偏南［18］，影響深度在50 m左右。與此同時(shí)，赤道以南有一支自東向西的洋流-南赤道流，以及東西兩個(gè)邊界流，共同組成了一個(gè)順時(shí)針的閉合環(huán)流。在印度洋夏季和冬季（6—9月、12—3月），赤道附近的赤道急流消失，夏季赤道北部的莫桑比克海流與赤道以南的南赤道流、以及東西兩個(gè)邊界流，構(gòu)成一個(gè)環(huán)流系統(tǒng)。冬季，赤道以北的西北向東北季風(fēng)流，和赤道偏南的南赤道流被赤道附近東向的南赤道逆流分隔開(kāi)［29］（圖4）。南海海域地處熱帶西太平洋的邊緣地帶，與其他大洋相比，是一個(gè)半封閉性的海域，因此也具備了某些大洋的特征，也是一個(gè)典型的季風(fēng)海洋［30］。南海海域群體S4主要受到南海暖流和廣東沿岸流影響［31］，S3群體所處海域受季風(fēng)影響，容易形成渦流（圖5）。基于東印度洋復(fù)雜的海流變化，導(dǎo)致赤道南北群體之間產(chǎn)生一定的遺傳分化，特別是冬季的南赤道逆流則把赤道兩側(cè)阻隔。而在夏季，北部的莫桑比克海流則有可能穿過(guò)S1群體進(jìn)入馬六甲海峽，從而有可能與南海海域群體發(fā)生基因交流。這也很好地解釋了本研究中鳶烏賊群體組成不是單一群體的原因。

圖4 熱帶東印度洋海流圖（此圖參照WU等［33］的圖13）Fig.4 Tropical East Indian Ocean current chart（This figure refers to figure 13 in WU et al［33］）

圖5 南海海流圖（此圖參照何映輝等［30］的圖3）Fig.5 South China Sea current chart（This figure refers to figure 3 in He et al［30］）

基于遺傳距離繪制的鳶烏賊個(gè)體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，東印度洋北部海域S1群體中的個(gè)體2、3、4、6、25與南海海域S3、S4部分個(gè)體遺傳距離較小，而東印度洋南部海域S2群體則沒(méi)有類(lèi)似情況，推測(cè)東印度洋北部群體S1部分個(gè)體可能通過(guò)馬六甲海峽與南海海域部分個(gè)體有一定的基因交流，而印度洋南部海域受赤道逆流影響，從而與南海海域群體交流困難。這也與鳶烏賊分布廣泛以及有較強(qiáng)的游泳能力相關(guān)［1］。S3和S4個(gè)體互相交織，但是形成兩個(gè)支系，也印證了表3中k值和π值的異常數(shù)據(jù)。

兩兩群體的Fst顯示，東印度洋北部群體S1與南部群體S2之間Fst＝0.085 88、南海南部群體S3 Fst＝0.549 90、南海北部群體S4 Fst＝0.709 65，顯示兩個(gè)地理群體之間的遺傳差異顯著，但是S1與S3之間的Fst小于S1與S4的，與遺傳距離顯示的結(jié)果一致。南海海域兩個(gè)群體（Fst＝0.025 36），沒(méi)有遺傳差異，但是有一定的遺傳距離（0.597），且圖3中，南海兩個(gè)采樣群分化為兩個(gè)支系，但是均包含兩個(gè)群體的樣本，這也印證了南海海域種群結(jié)構(gòu)復(fù)雜，與李敏等［16］研究該海域種群高度重合、但是種間遺傳差異顯著的結(jié)果相一致。圖4中S3、S4有明顯的雙峰，極有可能是每個(gè)采樣群包含了有遺傳差異的連個(gè)群體，每個(gè)群體對(duì)應(yīng)一個(gè)峰?？傮w而言，東印度洋赤道北部群體S1和南部群體S2之間遺傳距離要遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于東印度洋與南海之間的遺傳距離，說(shuō)明地理隔離影響效應(yīng)可能要遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)洋流對(duì)其的影響。

大洋性柔魚(yú)的群體遺傳學(xué)研究主要依賴于形態(tài)學(xué)標(biāo)記，劃分不同種群結(jié)構(gòu)的有效方法之一是依據(jù)其外部形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行判斷［32］。但是，種群結(jié)構(gòu)的差異往往與性別、年齡、產(chǎn)卵季節(jié)、性成熟胴長(zhǎng)等諸多因素有關(guān)，穩(wěn)定性不高［33］。因此，形態(tài)學(xué)與分子標(biāo)記相結(jié)合，一起對(duì)其群體進(jìn)行遺傳變異分析會(huì)更為準(zhǔn)確。今后有必要增加形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)分子標(biāo)記結(jié)果加以佐證。同時(shí)，增加馬六甲海峽海域的鳶烏賊樣本能更好地證明以上的結(jié)果。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育地理格局和群體歷史動(dòng)態(tài)

系統(tǒng)發(fā)育地理格局和群體歷史動(dòng)態(tài)隸屬于分析系統(tǒng)地理學(xué)，其針對(duì)種群歷史性的進(jìn)化特征進(jìn)行推論，得出相應(yīng)的結(jié)論［27］。基于S2鳶烏賊種群Cytb單倍型核苷酸不配對(duì)分布的τ值為2.429，計(jì)算可得S2鳶烏賊種群發(fā)生種群擴(kuò)張事件的時(shí)間在7.3萬(wàn)年前—6.1萬(wàn)年前，處于末次冰期（7.5萬(wàn)年前—1萬(wàn)年前）［34］。在過(guò)去100萬(wàn)年間，地球經(jīng)歷了一系列周期為10萬(wàn)年的冰期-間冰期變化，伴隨著每次冰期，海平面下降的峰值可達(dá)120～140 m［35］，冰期的溫度要比間冰期低3～4℃［36］。全球氣候變化以及海洋環(huán)境因子的變化對(duì)眾多海洋生物的空間結(jié)構(gòu)分布產(chǎn)生了深遠(yuǎn)影響，從而形成了當(dāng)今格局。

4 小結(jié)

本研究通過(guò)對(duì)東印度洋赤道南北海域、南海南部、北部海域120尾鳶烏賊個(gè)體的Cytb基因研究，揭示了東印度洋赤道海域群體和南海海域群體遺傳分化顯著，在漁業(yè)管理上應(yīng)該看作兩個(gè)獨(dú)立的單元管理，進(jìn)而更好地保護(hù)種群多樣性。而東印度洋赤道兩側(cè)群體出現(xiàn)中等程度的遺傳分化，未來(lái)可增加馬六甲海峽海域的鳶烏賊樣本以更好地驗(yàn)證本文的推測(cè)。

本研究所用Cytb基因片段只能反映母本的種群遺傳分化特征，而不同的基因片段進(jìn)化速率及其所展現(xiàn)的系統(tǒng)發(fā)育信息存在一定差異，今后有必要整合其他基因片段或基因組DNA數(shù)據(jù)，更全面地反映種群遺傳結(jié)構(gòu)信息。而且今后可以增加形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)信息，結(jié)合形態(tài)學(xué)所反映的種群結(jié)構(gòu)信息，更加深入地了解鳶烏賊的種群遺傳結(jié)構(gòu)。