劉 欣，阮傳清，鄭雪芳，肖榮鳳，陳 崢，劉 波，王階平

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福建 福州 350003)

我國(guó)是產(chǎn)竹大國(guó)，純竹林面積420萬(wàn)hm2，其中食用筍竹點(diǎn)竹林總面積69.39%，年產(chǎn)值約450億元以上[1]。竹筍栽培及竹產(chǎn)業(yè)已成為福建、浙江、江西等產(chǎn)竹大省的新經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)點(diǎn)。筍殼是各種竹筍加工過(guò)程中的廢棄物，年產(chǎn)量可達(dá)15.7億kg[2]，大規(guī)模丟棄的筍殼極易腐爛，造成嚴(yán)重的污染威脅[3]。筍殼富含動(dòng)物必需的微量元素和多種功能性物質(zhì)，對(duì)動(dòng)物機(jī)體具有重要的生理活性作用[4]。鮮筍殼的中性洗滌纖維與緩沖能含量顯著高于草粉和麥麩[5]。但筍殼適口性差，且生筍殼中含有氰甙，當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破裂時(shí)，植物內(nèi)的葡萄糖苷酶水解氰甙生成劇毒的氫氰酸[6-7]。通過(guò)微生物發(fā)酵，不僅可以降解筍殼的大分子物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)吸收，而且可以降低其氰甙含量，提高筍殼適口性，使筍殼成為優(yōu)質(zhì)家畜飼料的原料來(lái)源[5]。王音等利用霉菌、芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌混合發(fā)酵筍殼生產(chǎn)動(dòng)物飼料，提高了飼料中粗蛋白含量[8]。梁磊等利用不同食藥用菌對(duì)竹筍殼進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)食藥用菌發(fā)酵后筍殼纖維結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，粗蛋白質(zhì)和多糖含量顯著提高，總黃酮含量有所降低[9]。鄭銳東等構(gòu)建了黑曲霉固態(tài)發(fā)酵筍殼動(dòng)力學(xué)模型，能夠反映黑曲霉固態(tài)發(fā)酵筍殼過(guò)程[10]。有關(guān)筍殼發(fā)酵飼料的研究仍較少，筍殼發(fā)酵過(guò)程中微生物群落及營(yíng)養(yǎng)組成的演變過(guò)程尚未見(jiàn)系統(tǒng)的研究報(bào)道。芽孢桿菌具有抗逆性強(qiáng)、易培養(yǎng)、耐貯藏、加工損失少的優(yōu)點(diǎn)，常被篩選為發(fā)酵飼料的發(fā)酵菌劑[11]。本研究采用分離培養(yǎng)的方法，觀察乳酸菌發(fā)酵筍殼過(guò)程中，可培養(yǎng)芽孢桿菌種群動(dòng)態(tài)與發(fā)酵物COD、總氮的變化，以了解探筍殼發(fā)酵規(guī)律，為篩選筍殼發(fā)酵菌劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 筍殼發(fā)酵樣品采集

利用福建省永春縣清水筍加工廠產(chǎn)生的筍殼開(kāi)展發(fā)酵試驗(yàn)。筍殼從清水煮熟的毛竹筍剝離下來(lái)，并機(jī)械粉碎。發(fā)酵試驗(yàn)在田間蓋膜堆垛形式進(jìn)行。試驗(yàn)分2組，每組5 t筍殼，置于田間發(fā)酵坑(長(zhǎng)2.5 m×寬2.0 m×高1.0 m)；第1組為處理組(TR-接種發(fā)酵組)，接種含菌濃度為108cfu·g-1植物乳桿菌菌劑150 kg(即接菌量3%)，與筍殼拌勻，堆體濕度調(diào)整到50%～60%；第2組為對(duì)照組(CK-自然發(fā)酵組)，不接種微生物菌劑，濕度調(diào)整到50%～60%；蓋上薄膜進(jìn)行發(fā)酵。處理組和對(duì)照組于發(fā)酵5、10、15 d分別取樣，共取得試驗(yàn)樣品6個(gè)，放至于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 筍殼發(fā)酵過(guò)程中物料總氮和COD的檢測(cè)

將不同發(fā)酵時(shí)間、不同處理筍殼發(fā)酵物料樣品配置成10%的水溶液，在25℃浸提1 h后，離心取上清液，稀釋200倍用于測(cè)定總氮(TN)和化學(xué)需氧量(COD)，指示可溶性有機(jī)碳化合物含量，重復(fù)3次，并以清水作對(duì)照。測(cè)定在水質(zhì)分析儀(日本TOADK)上進(jìn)行。測(cè)定時(shí)，將稀釋液依次放入檢測(cè)瓶中，儀器檢測(cè)總氮(TN)檢測(cè)方法為堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法，COD(化學(xué)需氧量)檢測(cè)方法為高錳酸鉀法。將測(cè)定結(jié)果構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，以總氮和COD為指標(biāo)，發(fā)酵時(shí)間為樣本，馬氏距離為尺度，用可變類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

1.3 筍殼發(fā)酵過(guò)程可培養(yǎng)芽孢桿菌的分離

稱取10 g筍殼發(fā)酵樣品加入到90 mL的無(wú)菌水中，再將其放入30℃、180 r·min-1的搖床中振蕩30 min，充分混勻，之后將其放置在80℃的水浴鍋中溫育10 min，殺死非芽孢桿菌。10倍梯度系列稀釋后，涂布NA平板，30℃培養(yǎng)2 d，統(tǒng)計(jì)樣本芽孢桿菌含量。分離的芽孢桿菌純化后，用20%甘油、-80℃超低溫冰箱保存，同時(shí)將純化的菌株進(jìn)行16S rDNA序列分析。

1.4 筍殼發(fā)酵過(guò)程可培養(yǎng)芽孢桿菌的16S rDNA鑒定

按細(xì)菌基因組提取試劑盒(generary bitehch，美國(guó))操作步驟提取分離到的芽孢桿菌的基因組DNA，采用16S rRNA通用引物27 F和1492 R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min；94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃復(fù)性1 min，重復(fù)35個(gè)循環(huán)，最后72℃下延伸10 min。PCR產(chǎn)物送至上海博尚測(cè)序，應(yīng)用NCBI Blastn完成序列同源性比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 筍殼發(fā)酵過(guò)程中物料的總氮(TN)和化學(xué)需氧量(COD)變化動(dòng)態(tài)

2.1.1筍殼發(fā)酵過(guò)程中物料的TN變化 從總氮含量變化看，自然發(fā)酵過(guò)程中(初期5 d、中期10 d、后期15 d)，筍殼樣品總氮含量分別為0.20 mg·L-1、3.73 mg·L-1、2.32 mg·L-1，呈初期低、中期高、后期低的變化動(dòng)態(tài)(圖1A)；而接種植物乳桿菌發(fā)酵過(guò)程中，總氮含量隨著發(fā)酵進(jìn)程顯著增加(P<0.05)，筍殼樣品總氮含量由初期的1.48 mg·L-1增加到中期的2.49 mg·L-1，后期達(dá)到高峰，為4.88 mg·L-1；研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵組總氮含量峰值在中期，接菌發(fā)酵峰值在后期，且發(fā)酵后期接菌發(fā)酵組總氮含量顯著高于自然發(fā)酵組，表明接菌發(fā)酵提升了筍殼中微生物的氮代謝活性。

2.1.2筍殼發(fā)酵過(guò)程中物料的COD變化 從COD含量變化看，自然發(fā)酵與接菌發(fā)酵過(guò)程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加物料COD含量也增加，接菌發(fā)酵COD含量增加水平高于自然發(fā)酵；表明接菌發(fā)酵促進(jìn)了筍殼中微生物的COD代謝活性(圖1B)。

圖1 筍殼發(fā)酵過(guò)程總氮量、化學(xué)需氧量及二者比值的變化 Fig.1 Changes of total nitrogen, chemical oxygen demand and their ratio during the fermentation process of bamboo shoot shell

2.1.3筍殼發(fā)酵過(guò)程物料的COD/N變化 從COD/N比變化看，COD為化學(xué)需氧量，主要成分為含碳有機(jī)物，COD/N比代表著碳氮比的變化趨勢(shì)；自然發(fā)酵過(guò)程中COD/N值逐漸下降，由發(fā)酵初期的179.01下降到發(fā)酵后期的12.79；接菌發(fā)酵過(guò)程中COD/N比值穩(wěn)定在36.78～38.52之間，這與接菌發(fā)酵增加總氮含量的同時(shí)同步增加COD相關(guān)(圖1C)。

2.2 筍殼發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)芽孢桿菌分離與鑒定

從6個(gè)筍殼發(fā)酵樣品中共分離得到12株芽孢桿菌，經(jīng)16S rDNA序列分析，為5個(gè)芽孢桿菌屬9個(gè)種，分別為芽孢桿菌屬Bacillus的暹羅芽孢桿菌Bacillussiamensis、蠟樣芽孢桿菌Bacilluscereus、環(huán)狀芽孢桿菌Bacilluscirculans、貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis和高地芽孢桿菌Bacillusaltitudinis；新芽孢桿菌屬Neobacillus的土壤新芽孢桿菌Neobacillussoli；賴氨酸芽孢桿菌屬Lysinibacillus的細(xì)長(zhǎng)賴氨酸芽孢桿菌Lysinibacillusmacroides；類芽孢桿菌屬Paenibacillus的飼料類芽孢桿菌Paenibacilluspabuli；魯梅爾芽胞桿菌屬Rummeliibacillus司氏魯梅爾芽胞桿菌Rummeliibacillusstabekisii(表1)。

表1 筍殼發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種類的分離與鑒定

2.3 筍殼發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)芽孢桿菌菌群變化

從筍殼發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)芽孢桿菌種類(圖2)可知，自然發(fā)酵組初期(5 d)主要種群為暹羅芽孢桿菌，含量為6×107cfu·g-1；中期(10 d)主要種群為細(xì)長(zhǎng)賴氨酸芽孢桿菌和暹羅芽孢桿菌，含量分別為6×107cfu·g-1和2×107cfu·g-1；后期(15 d)主要種群為高地芽胞桿菌、司氏魯梅爾芽胞桿菌和飼料類芽孢桿菌，含量分別為5×107、7×107、7×107cfu·g-1。接菌發(fā)酵組初期主要種群為暹羅芽孢桿菌(3×107cfu·g-1)、蠟樣芽孢桿菌(2×107cfu·g-1)和環(huán)狀芽孢桿菌(3×107cfu·g-1)；中期主要種群為暹羅芽孢桿菌(2×108cfu·g-1)和赫伯斯滕副芽孢桿菌(6×107cfu·g-1)；后期主要種群為暹羅芽孢桿菌(6.5×108cfu·g-1)和貝萊斯芽孢桿菌(8×107cfu·g-1)。

圖2 筍殼發(fā)酵過(guò)程不同處理組芽孢桿菌數(shù)量變化 Fig.2 Changes of the number of Bacillus in different treatment groups during the fermentation process of bamboo shoot shell

筍殼自然發(fā)酵組可培養(yǎng)芽孢桿菌數(shù)量總和(3.3×108cfu·g-1)顯著低于接菌發(fā)酵組數(shù)量總和(5.5×108cfu·g-1)。發(fā)酵初期(5 d)，自然發(fā)酵組芽孢桿菌數(shù)量總和(6×107cfu·g-1)與接菌發(fā)酵組(8×107cfu·g-1)相近；發(fā)酵中期(10 d)，接菌發(fā)酵組芽孢桿菌數(shù)量是自然發(fā)酵組的3.25倍；發(fā)酵后期(15 d)，接菌發(fā)酵組芽孢桿菌數(shù)量是自然發(fā)酵組的3.84倍；表明筍殼接菌發(fā)酵能促進(jìn)可培養(yǎng)芽孢桿菌種群數(shù)量的增長(zhǎng)(圖2)。

2.4 芽孢桿菌種群與物料生化物質(zhì)相關(guān)性分析

筍殼發(fā)酵過(guò)程中芽孢桿菌種群與物料生化物質(zhì)相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2。筍殼發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌數(shù)量與總氮TN和有機(jī)碳化合物COD含量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.712 4和0.973 3，與COD含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與碳氮比COD/TN呈負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性不顯著。表明筍殼發(fā)酵過(guò)程有機(jī)碳化合物含量的變化影響芽孢桿菌數(shù)量變化，有機(jī)碳化合物含量越高，芽孢桿菌數(shù)量越高。

表2 筍殼發(fā)酵過(guò)程中芽孢桿菌種群與生物量的相關(guān)系數(shù)

2.5 基于芽孢桿菌種群與物料生化物質(zhì)含量變化的筍殼發(fā)酵過(guò)程聚類分析

以不同處理和發(fā)酵時(shí)間的筍殼為樣本，芽孢桿菌分布數(shù)量和生化物質(zhì)含量為指標(biāo)，馬氏距離為尺度，用類平均法進(jìn)行系統(tǒng)聚類。結(jié)果表明，根據(jù)芽孢桿菌和生物物質(zhì)含量，可將筍殼發(fā)酵過(guò)程分為兩組(圖3)，第一組為自然發(fā)酵組，特征為有機(jī)碳化合物COD(平均值41.51 mg·L-1)和芽孢桿菌數(shù)量低(平均值1.1×108cfu·g-1)；第二組為接菌發(fā)酵組，特征為有機(jī)碳化合物COD(平均值100.41 mg·L-1)和芽孢桿菌數(shù)量高(平均值3.6×108cfu·g-1)。表明接種發(fā)酵組在微生物作用下能夠分解出較多有機(jī)碳化合物。

圖3 基于筍殼發(fā)酵過(guò)程芽孢桿菌種群與生化物質(zhì)含量變化的聚類分析Fig.3 Cluster analysis on the population and biochemical substance content changes of Bacillus during the fermentation process of bamboo shoot shell

3 討論與結(jié)論

本研究將不同處理、不同發(fā)酵時(shí)間的筍殼發(fā)酵物料配置成10%的水溶液，在25℃浸提1 h后，離心取上清液，稀釋200倍用于測(cè)定總氮(TN)和化學(xué)需氧量(COD)，由此可以比較2組處理中微生物對(duì)有機(jī)物的降解能力的差異。接種發(fā)酵組產(chǎn)生的有機(jī)碳化合物含量(即COD)比自然發(fā)酵組高出2.42倍，總氮(TN)含量增加了41.6%，表明接種乳酸菌后增強(qiáng)了微生物分解有機(jī)碳化合物的能力和氮代謝活性。王赫等研究表明，乳酸菌發(fā)酵飼料粗蛋白、氨基酸、非植酸磷等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量顯著高于未發(fā)酵飼料[12]?；旌先樗峋鷮?duì)筍殼進(jìn)行青貯發(fā)酵，顯著增加發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白等營(yíng)養(yǎng)含量[13]。

在本研究中，筍殼添加乳酸菌發(fā)酵，其物料中的可培養(yǎng)芽孢桿菌數(shù)量顯著高于自然發(fā)酵組。乳酸菌能產(chǎn)生淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶，促進(jìn)各種大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解，從而有利于其他微生物的生長(zhǎng)[12]。筍殼發(fā)酵過(guò)程中是否添加乳酸菌對(duì)芽孢桿菌種群的演替影響不同。例如，發(fā)酵初期暹羅芽孢桿菌均為接菌發(fā)酵組和自然發(fā)酵組的優(yōu)勢(shì)種；發(fā)酵后期暹羅芽孢桿菌仍為接菌發(fā)酵組的優(yōu)勢(shì)種，但不是自然發(fā)酵組的優(yōu)勢(shì)種。關(guān)于暹羅芽孢桿菌研究有較多報(bào)道其對(duì)植物有抑制病菌、促進(jìn)生長(zhǎng)作用[14-16]；還能產(chǎn)生絮凝劑，用于處理釀酒廢水處理，具有高效凈水的功能[17-18]。沙沙等研究表明，暹羅芽孢桿菌具有產(chǎn)纖維素酶功能，酶活力可達(dá)到0.168 6 U·g-1[19]。在本研究中接種發(fā)酵組發(fā)酵過(guò)程暹羅芽孢桿菌均為優(yōu)勢(shì)種群，比自然發(fā)酵組總含量提高了10倍。關(guān)于本研究獲得的暹羅芽孢桿菌的功能及成為優(yōu)勢(shì)種群的機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，筍殼中添加乳酸菌發(fā)酵的物料中的總氮、有機(jī)碳化合物(COD)顯著高于自然發(fā)酵組，可培養(yǎng)芽孢桿菌數(shù)量也顯著高于自然發(fā)酵；而且，接種發(fā)酵組不同發(fā)酵階段的物料中的優(yōu)勢(shì)芽孢桿菌種群均為暹羅芽孢桿菌。