潘志針，陳 崢，劉 波，劉 欣，肖榮鳳，阮傳清，鄭雪芳，史 懷，王階平

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所， 福建 福州 350003)

有機(jī)固體廢棄物是我國(guó)最主要的面源污染物，其來(lái)源主要包括畜禽養(yǎng)殖廢棄物、城市污泥、城市垃圾、農(nóng)作物秸稈等[1]。目前，有機(jī)固體廢棄物的處理方式主要有填埋、焚燒、厭氧消化、堆肥等[2]。堆肥是實(shí)現(xiàn)有機(jī)固體廢棄物無(wú)害化和資源化利用的主要手段，通過(guò)微生物的分解與轉(zhuǎn)化等生理代謝功能，將有機(jī)物轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)、有效態(tài)氮、有效態(tài)磷和其他有機(jī)物等。同時(shí)堆肥過(guò)程中產(chǎn)生的高溫可以有效地殺滅有機(jī)固體廢棄物中的病原菌和寄生蟲(chóng)等有害生物，減少面源污染并實(shí)現(xiàn)資源的有效利用，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)分元素的循環(huán)與平衡[3-5]。

傳統(tǒng)堆肥工藝存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、堆肥效率低等缺點(diǎn)，還會(huì)產(chǎn)生惡臭、酸雨等新的環(huán)境污染問(wèn)題[6]。為實(shí)現(xiàn)有機(jī)固體廢棄物的快速堆肥，并減少臭氣物質(zhì)的排放，國(guó)內(nèi)外研究者在堆肥條件控制、工藝優(yōu)化、堆肥出發(fā)菌種的添加及原料配比等方面做了大量的研究[7-9]。解開(kāi)治等[10]通過(guò)接種微生物菌劑的方式加快了豬糞堆肥進(jìn)程。王建才等[11]通過(guò)添加外源菌劑的方式延長(zhǎng)了堆肥的高溫時(shí)間。麻仲花等[12]通過(guò)調(diào)節(jié)不同堆肥原料的配比，提高了雞糞堆體的溫度，加速堆肥腐熟和抗生素的降解。功能膜覆蓋好氧堆肥由于其對(duì)氣溶膠，氣候和臭氣的綜合防治效果，被廣泛地應(yīng)用于堆肥工藝，在美國(guó)、西班牙、瑞典等眾多國(guó)家被認(rèn)可為封閉反應(yīng)器式系統(tǒng)[13]。覆膜好氧發(fā)酵技術(shù)最早是在20世紀(jì)80年代由德國(guó)的Baden-Baden提出，經(jīng)過(guò)技術(shù)的不斷完善，如今技術(shù)最成熟的公司為德國(guó)的UTV AG公司，核心產(chǎn)品為GORE Cover膜[14]。GORE膜主要成分為膨脹聚四氟乙烯膜(e-PTEF)，它被夾在兩層具有防紫外線和耐腐蝕的聚酯膜中間。GERO膜具有絕緣和增壓作用，能夠幫助系統(tǒng)保持溫度，使堆體中的溫度分布均勻，有利于滅殺病原體。此外，0.2 um孔徑能有效的阻止灰塵、氣溶膠和微生物向外擴(kuò)散。堆肥發(fā)酵過(guò)程中，GERO膜的內(nèi)表面會(huì)形成一層冷凝水膜，大多數(shù)的臭氣物質(zhì)，如氨氣、硫化氫、揮發(fā)性有機(jī)化合物等，都會(huì)溶解于冷凝水膜中，之后又隨著水滴回落到堆體中，重新被微生物分解。因此，覆膜高溫堆肥能有效地減少堆肥過(guò)程中臭氣物質(zhì)的排放及微生物的逸散[13]。但對(duì)于覆膜高溫好氧堆肥過(guò)程中微生物群落組成及變化規(guī)律則鮮有報(bào)道。

本研究選用福建省福州市城市污泥和木屑作為堆肥材料，采用德國(guó)UTV-GORE膜作為覆膜材料，利用高通量測(cè)序的技術(shù)手段，揭示覆膜高溫好氧堆肥的不同堆肥階段微生物組成及其變化規(guī)律，為覆膜高溫好氧堆肥在有機(jī)固體廢棄物無(wú)害化處理及資源化利用等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

研究采用槽式覆膜高溫好氧發(fā)酵工藝(覆膜材料為德國(guó)UTV-GORE膜)研究覆膜高溫好氧堆肥下微生物群落的變化。發(fā)酵物料為福州城市污水處理廠的脫水污泥和木屑樣本等，將其混勻后送入長(zhǎng)40 m、寬8 m、高2.3 m發(fā)酵槽內(nèi)，進(jìn)行覆膜高溫堆肥處理。每個(gè)發(fā)酵槽底部均設(shè)有曝氣管道，采用高壓鼓風(fēng)機(jī)對(duì)堆體進(jìn)行通風(fēng)供氧。堆肥周期為28 d的覆膜高溫堆肥。采樣的時(shí)間點(diǎn)設(shè)置在堆肥的第0(發(fā)酵初始)、3(高溫期)、9(中高溫期)、27 d(中溫期)，分別在發(fā)酵槽的前段，中段和尾段采用5點(diǎn)取樣法進(jìn)行隨機(jī)取樣。取距表層0～20 cm的樣本標(biāo)記為表層堆體(surface layer，簡(jiǎn)稱S)，樣本編號(hào)為S0、S3、S9、S27分別表示第0、3、9、27 d取的表層堆體樣本。取距表層70 cm的樣本標(biāo)記為下層堆體(bottom layer，簡(jiǎn)稱B)，樣本編號(hào)為B0、B3、B9、B27，分別表示第0、3、9、27 d取的下層堆體樣本。將樣本混勻后進(jìn)行微生物群落的分析，每組樣本重復(fù)3次，合計(jì)24個(gè)樣本。

1.2 溫度監(jiān)測(cè)

使用金屬溫度計(jì)，在發(fā)酵槽的5個(gè)固定位置記錄發(fā)酵物料的溫度，取其平均值為當(dāng)日堆體溫度。

1.3 不同堆肥階段樣本DNA提取、Illumina Miseq高通量測(cè)序

采用E.Z.N.A.?soil DNA kit (Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取堆肥樣本微生物群落總DNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000測(cè)定DNA的濃度及純度。使用通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對(duì)16S rRNA基因的V3～V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，基于Illumina Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序分析(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。使用fastp[16](https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.19.6)軟件對(duì)雙端原始測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，使用FLASH[17](http://www.cbcb.umd.edu/software/flash，version 1.2.11)軟件進(jìn)行拼接。使用UPARSE軟件[18](http://drive5.com/uparse/，version 7.1)，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier[19](http://rdp.cme.msu.edu/，version 2.2) 對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋。通過(guò)預(yù)測(cè)的16S拷貝數(shù)對(duì)OTU進(jìn)行歸一化，利用BugBase預(yù)測(cè)微生物致病性(Pathogeic)等表型進(jìn)行預(yù)測(cè)。采用FAPROTAX對(duì)微生物的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用mothur軟件計(jì)算Alpha多樣性的Chao、Shannon指數(shù)等，并采用Wilxocon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行Alpha多樣性的組間差異分析，采用fdr方法對(duì)p值進(jìn)行多重校正，使用bootstrap計(jì)算置信區(qū)間，使用雙尾檢驗(yàn)，置信度為0.95。用LEfSe分析(Linear discriminant analysis Effect Size)(LDA>4)確定不同堆肥階段從門(mén)到屬水平豐度顯著差異的細(xì)菌類群。利用R語(yǔ)言vegan包進(jìn)行ANOSIM分析，R語(yǔ)言(version3.3.1)mixOmics包中plsda分析，繪制偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)圖。利用R語(yǔ)言繪制物種Venn圖，群落柱形圖和群落heatmap圖等[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 覆膜高溫好氧堆肥過(guò)程中的溫度變化

由圖1可知，與傳統(tǒng)堆肥工藝相比，覆膜高溫好氧堆肥工藝的升溫期很短，能迅速達(dá)到65℃以上并維持7 d，在第3 d達(dá)到了最高溫(74.64±2.99)℃。在第9 d的時(shí)候溫度降至65℃以下，并保持55℃以上的溫度維持7 d。在第17 d時(shí)堆肥溫度降至50℃以下，并保持40℃以上的溫度維持12 d。整個(gè)覆膜高溫好氧堆肥的周期為28 d，之后結(jié)束覆膜堆肥，對(duì)堆體進(jìn)行翻堆后轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無(wú)覆膜的發(fā)酵槽進(jìn)行14 d陳化處理。熊建軍等[21]研究普通槽式好氧堆肥，在第3 d的堆體溫度才達(dá)到56℃以上，第5 d的時(shí)候達(dá)到最高溫71℃，第3～10 d的堆體溫度維持在55℃以上，第11 d堆體溫度降至48℃以下。因此，覆膜高溫好氧發(fā)酵與普通的好氧發(fā)酵相比，能更迅速地進(jìn)入高溫期，發(fā)酵溫度遠(yuǎn)高于普通好氧發(fā)酵，55℃以上的高溫時(shí)間更是達(dá)到了16 d，遠(yuǎn)高于普通好氧堆肥的8 d。

圖1 覆膜高溫好氧堆肥過(guò)程的溫度變化Fig.1 Temperature changes during the film-covered high temperature aerobic composting process

2.2 不同堆肥階段微生物豐度及多樣性指數(shù)

通過(guò)對(duì)Illumina MiSeq的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和拼接，從24個(gè)樣本獲得1 143 180條高質(zhì)量序列，每個(gè)樣本的有效序列數(shù)目的范圍為32 796～67 932條，每個(gè)樣本的平均序列長(zhǎng)度范圍為410～415 bp。按最小序列數(shù)對(duì)所有樣本進(jìn)行抽平處理，在相同的測(cè)序深度下進(jìn)行OTUs聚類分析，這些序列共聚成4 559種OTUs。如表1所示為堆體細(xì)菌多樣性和豐度的表征，序列覆蓋度都達(dá)到97%以上，覆蓋度好。sobs指數(shù)和chao指數(shù)表征細(xì)菌的豐度，指數(shù)越高細(xì)菌的豐度越高。同一層發(fā)酵樣本隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，細(xì)菌的豐度和多樣性都呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。下層發(fā)酵樣本中細(xì)菌的多樣性和豐富度要高于表層堆體。

表1 不同堆肥階段細(xì)菌多樣性與豐度表征

2.3 不同堆肥階段微生物群落的差異

采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OUT代表的序列進(jìn)行分類學(xué)分析，通過(guò)對(duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)分析，不同堆肥時(shí)期的24個(gè)樣本共鑒定到49個(gè)門(mén)、154個(gè)綱、356個(gè)目、571個(gè)科、1 081個(gè)屬和2 048個(gè)種的微生物信息。由圖2可知，8個(gè)組所共有細(xì)菌屬為359個(gè)，占屬總數(shù)的33%，每個(gè)組所獨(dú)有的微生物屬較少。下列的柱狀圖所示為不同堆肥階段細(xì)菌屬水平變化，呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，與α多樣性的結(jié)果一致。

圖2 不同堆肥階段樣本的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of the samples at different composting stages

采用經(jīng)典的偏最小二乘回歸模型(PLS-DA)，能有效的對(duì)組間觀察值進(jìn)行區(qū)分，是一種有監(jiān)督的分組判別的分析方法。由圖3可知，分類水平選用屬水平，表層堆體和下層堆體的細(xì)菌群落差異較小，無(wú)顯著性差異。發(fā)酵的初始樣本(第0 d)聚成一類，發(fā)酵高溫期的樣本聚成一類(第3 d)，發(fā)酵中高溫期和中溫期的樣本(第9 d和第27 d)聚成一類。彼此的距離大，說(shuō)明覆膜高溫好氧堆肥高溫期的細(xì)菌菌群與其他堆肥階段的菌群存在著顯著性差異。

2.4 不同堆肥階段細(xì)菌群落在門(mén)水平組成及變化規(guī)律

由圖4可知，覆膜好氧堆肥的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)由綠彎菌門(mén)Chloroflexi、變形菌門(mén)Proteobacteria、放線菌門(mén)Actinobacteriota、厚壁菌門(mén)Firmicutes、芽單胞菌門(mén)Gemmatimonadota、酸桿菌門(mén)Acidobacteriota、擬桿菌門(mén)Bacteroidota、髕骨細(xì)菌門(mén)Patescibacteria、粘球菌門(mén)Myxococcota、糞熱桿菌門(mén)Coprothermobacterota、浮霉菌門(mén)Planctomycetota和硝化菌門(mén)Nitrospirota組成(相對(duì)豐度>2%)。表層堆肥樣本和下層堆肥樣本的細(xì)菌組成差異較小。綠彎菌門(mén)在整個(gè)發(fā)酵堆肥過(guò)程中為最主要的優(yōu)勢(shì)門(mén)。在發(fā)酵初期和最高溫期的相對(duì)豐度為20%～33%，在中高溫期和中溫期大量擴(kuò)增，在第27 d的相對(duì)豐度達(dá)到了最高(49%～51%)。變形菌門(mén)在整個(gè)堆肥過(guò)程中豐度僅次于綠彎菌門(mén)，是第二大優(yōu)勢(shì)門(mén)。變形菌門(mén)包含著大量病原菌，如大腸桿菌和沙門(mén)氏菌等，在發(fā)酵的初始樣本中豐度高，相對(duì)豐度為19%，經(jīng)過(guò)27 d的高溫堆肥后相對(duì)豐度降至6%以下。放線菌門(mén)的豐度在高溫期較高，相對(duì)豐度達(dá)到了17%～24%，厚壁菌門(mén)在高溫期的豐度較低，相對(duì)豐度只有4%。芽單胞桿菌門(mén)在發(fā)酵的初始樣本中豐度較低(相對(duì)豐度為0.8%～1%)，隨著堆肥時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸增加，在27 d時(shí)達(dá)到了最高(相對(duì)豐度為7%～9%)。酸桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在堆肥初始的樣本中豐度較高，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，相對(duì)豐度逐漸降低，在第27 d時(shí)達(dá)到了最低。

圖3 不同堆肥階段微生物群落PLS-DA圖Fig.3 PLS-DA diagram of the microbial communities at different composting stages

圖4 不同堆肥階段細(xì)菌在門(mén)水平的組成及相對(duì)豐度Fig.4 Composition and relative abundance of the bacteria at phylum level in different composting stages

為了更好地比較堆肥初始樣本經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫好氧堆肥后的微生物群落的變化，比較了第0 d和第27 d 堆肥樣本的細(xì)菌群落在門(mén)水平的變化。由于表層堆體的微生物組成與下層堆體的較為類似，合并表層和下層堆體。經(jīng)過(guò)27 d堆肥后細(xì)菌門(mén)水平的變化見(jiàn)圖5。經(jīng)過(guò)27 d的堆肥，綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、粘球菌門(mén)相對(duì)豐度極顯著提高(P<0.01)，變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、髕骨細(xì)菌門(mén)和硝化菌門(mén)相對(duì)豐度極顯著的降低(P<0.01)，酸桿菌門(mén)和浮霉菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。

注：P值用*、**標(biāo)識(shí)，*表示0.01

2.5 不同堆肥階段細(xì)菌群落在屬水平的組成及變化規(guī)律

由圖6可知，表層堆體和下層堆體的微生物群落結(jié)構(gòu)較為類似，鏈霉菌屬Streptomyces、水恒桿菌屬M(fèi)izugakiibacter和馬杜拉放線菌屬Actinomadura在高溫期豐度最高，在發(fā)酵的初始樣本及中高溫和中溫期的豐度則較低。鏈霉菌屬等能較好地適應(yīng)高溫，在高溫期豐度最高，參與了纖維素分解等重要過(guò)程，這與馮紅梅等[22]報(bào)道的相一致。Kouleothrix在堆肥初始樣本中豐度較高，經(jīng)過(guò)高溫堆肥后豐度逐漸降低?？的嗡故蠗U菌屬conexibacter，IMCC26207和芽胞桿菌屬Bacillus隨著堆肥時(shí)間的增加，豐度逐漸下降，在27 d時(shí)豐度有顯著的降低。特呂珀菌屬Truepera、厭氧繩菌屬Anaerolinea、小單孢菌屬M(fèi)icromonospora、熱黃微菌屬Thermoflavimicrobium、球形桿菌屬Sphaerobacter、糞熱桿菌屬Coprothermobacter和Lutispora等在堆肥的初期豐度較低，隨著堆肥時(shí)間的增加，豐度逐漸增加，在第27 d時(shí)豐度有極顯著的提高。

圖6 不同堆肥階段細(xì)菌屬水平群落熱圖Fig.6 Heat map of the bacteria at genus level at different composting stages

圖7 不同堆肥階段LEfSe圖Fig.7 LEfSe diagram at different composting stages

2.6 不同堆肥階段細(xì)菌群落LEfSe分析

采用LEfSe分析確定組間具有顯著性差異的物種，先利用非參數(shù)Kruskal-Walllis(KW)sum-rank test檢測(cè)不同組間的物種豐度差異，獲得顯著性差異物種。然后利用Wilcoxon rank-sum test檢驗(yàn)上一步的差異物種在不同組間子分組中的差異一致性，最后運(yùn)用LDA線性判斷分析這些差異物種對(duì)組間區(qū)別的影響大小。本研究從門(mén)到屬水平對(duì)覆膜高溫好氧堆肥過(guò)程中微生物的變化進(jìn)行LEfSe分析(圖7)，篩選不同發(fā)酵時(shí)期差異指示物種，LDA的閾值設(shè)置為4。初始表層堆體樣本(S0)中的差異指示物種為伯克氏菌目Burkholderiales，芽球菌綱Blastocatellia，髕骨細(xì)菌門(mén)，Blastocatellales目，鏈狀芽生菌科Blastocatellaceae。差異指示物種在S3中富集的最多的微生物分別為變形菌門(mén)，γ變形菌綱Gammaproteobacteria，黃單胞菌目Xanthomonadales，Rhodanobacteraceae，擬桿菌門(mén)，α-變形菌綱Alphaproteobacteria，鏈孢囊菌目Streptosporangiales，擬桿菌綱Bacteroidia，芽單胞菌(從綱到屬)。S9中的差異指示物種為芽單胞菌門(mén)和S0134_terrestrial_group。S27中的差異指示物種為SBR1031。B0中的差異指示物種為根瘤菌目Rhizobiales，酸微菌綱Acidimicrobiia，微絲藻菌目Microtrichales，Kouleothrix，暖繩菌(從目到科)。B27中的差異指示物種綠彎菌門(mén)，球形桿菌屬Sphaerobacter和Roseiflexaceae。

2.7 堆肥前后微生物群落BugBase和FAPROTAX功能預(yù)測(cè)

通過(guò)BugBase將預(yù)測(cè)的16S拷貝數(shù)對(duì)OUT進(jìn)行歸一化處理，進(jìn)而預(yù)測(cè)致病性(pathogenic)等微生物表型分析(圖8)。如圖8a所示，對(duì)致病性表型貢獻(xiàn)比較大的細(xì)菌門(mén)主要有：變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、硝化菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。它們都隨著堆肥時(shí)間的增加均有顯著的降低。圖8b所示為致病性表型在不同堆肥階段的相對(duì)豐度。在發(fā)酵初始的樣本中，潛在的致病性較大(致病性參數(shù)大于11%)，經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥之后，致病性具有極顯著的下降，致病性參數(shù)低于5%。綜上，經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫好氧堆肥能顯著降低堆肥樣本中的潛在致病性，能較好地實(shí)現(xiàn)無(wú)害化處理。

此外，通過(guò)FAPROTAX對(duì)不同堆肥階段微生物特性進(jìn)行了預(yù)測(cè)(圖9)，結(jié)果顯示動(dòng)物寄生蟲(chóng)，人類致病菌，細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)等微生物特性經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥，均具有顯著的降低(P<0.05)。植物病原菌經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥則體現(xiàn)出極顯著的降低(P<0.01)。

注：a為物種-表型貢獻(xiàn)圖；b為致病性組間差異檢驗(yàn)圖8 堆肥前后微生物群落Bugbase致病性表型預(yù)測(cè)Fig.8 Phenotypic prediction of Bugbase pathogenicity of the microbial communities before and after composting

注：P值用*、**標(biāo)識(shí)，*表示0.01

為了進(jìn)一步研究覆膜高溫好氧堆肥前后堆肥樣本的潛在致病菌的留存情況，分別比較了第0和第27 d堆肥樣本中微生物群落的差異，通過(guò)與virulence factor database(VFDB)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)以及已報(bào)道的140種潛在致病菌的比對(duì)[23-24]。堆肥的初始堆肥樣本中有40種潛在病原菌被比對(duì)到。其中分枝桿菌屬(Mycobacterium)、真細(xì)菌屬(Eubacterium)、戈登氏菌屬(Gordonia)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、梭菌屬(Clostridium)和Eggerthella等7個(gè)細(xì)菌屬經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥后具有顯著下降(P<0.05)(圖10)。

圖10 堆肥前后樣本中潛在病原菌豐度Fig.10 Abundance of the potential pathogenic bacteria in the samples before and after composting

綜上所述，通過(guò)對(duì)堆肥前后微生物群落進(jìn)行BugBase和FAPROTAX功能預(yù)測(cè)及潛在病原菌庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)覆膜高溫堆肥能很好地降低有害病原菌的豐度，達(dá)到無(wú)害化的目的。

3 討論與結(jié)論

堆肥溫度是影響堆肥效率及資源化利用最關(guān)鍵的因子，也是堆肥過(guò)程的核心參數(shù)。覆膜高溫好氧堆肥的功能膜材料能較好地保持堆體溫度，這極大地縮短了升溫期，延長(zhǎng)了高溫的保持時(shí)間，縮短了堆肥的周期。覆膜高溫堆肥在第3 d的時(shí)候就達(dá)到堆肥最高溫(74.64±2.99)℃，保持55℃以上的時(shí)間長(zhǎng)達(dá)16 d，遠(yuǎn)高于普通堆肥的保持時(shí)間[21,25]。此外，覆膜高溫堆肥能通過(guò)控制通氣及水蒸氣外排的方式，調(diào)節(jié)堆體溫度，堆肥溫度總體處于最佳溫度40～65℃[26]。

堆肥的實(shí)質(zhì)是微生物分解和轉(zhuǎn)化有機(jī)物的代謝過(guò)程，細(xì)菌作為此代謝過(guò)程的主要參與者，其群落的組成及豐度的演變是影響堆肥進(jìn)程的關(guān)鍵因素。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，研究覆膜高溫好氧堆肥不同階段的細(xì)菌多樣性，共鑒定到49個(gè)門(mén)、154個(gè)綱、356個(gè)目、571個(gè)科、1 081個(gè)屬和2 048個(gè)種的細(xì)菌。表層堆體和下層堆體的群落結(jié)構(gòu)較為類型，無(wú)顯著性差異。堆肥高溫期(第3 d)的群落結(jié)構(gòu)明顯區(qū)別于堆肥初始樣本(第0 d)和中高溫期及中溫期(第9 d和第27 d)的群落結(jié)構(gòu)。堆肥的初始樣本中，綠彎菌門(mén)、變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、酸桿菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是主要的優(yōu)勢(shì)菌，這與鞠峰等[27]等報(bào)道的城市污泥的主要優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相一致。這說(shuō)明堆肥樣本中城市污泥的群落組成，決定了堆肥初始狀態(tài)的群落組成。綠彎菌門(mén)在整個(gè)堆肥過(guò)程中均為第一大菌門(mén)，在高溫期后豐度有顯著增加，在第27 d的時(shí)候，相對(duì)豐度達(dá)到了50%。綠彎菌門(mén)是一類深度分支的細(xì)菌類群，廣泛分布在生物圈各種生境中，如土壤、海洋、海底熱液區(qū)，陸地?zé)崛?、地下水、活性污泥、堆肥等生境中，在深水湖泊，堿性熱泉，高山凍土等許多生境中均為優(yōu)勢(shì)菌群。此外參與了地球碳、氮、硫等元素循環(huán)，如CO2的固定，纖維素等大分子的降解，NO2-的氧化，吸收利用H2S氣體等[28]。綠彎菌門(mén)對(duì)高溫具有較好的耐受性，可能參與了纖維素的分解及臭氣物質(zhì)的吸收等代謝過(guò)程。鏈霉菌屬、水恒桿菌屬和馬杜拉放線菌屬在高溫期大量擴(kuò)增，相對(duì)豐度最高，隨后則逐漸降低。高溫期在表層堆體的指示物種為變形菌門(mén)，擬桿菌門(mén)，芽單胞菌和黃單胞菌目等。

通過(guò)BugBase預(yù)測(cè)微生物的致病性，發(fā)現(xiàn)對(duì)致病性表型貢獻(xiàn)比較大的細(xì)菌門(mén)主要有：變形菌門(mén)，酸桿菌門(mén)，硝化菌門(mén)，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。這些菌門(mén)在堆肥的初始樣本中顯著富集，如變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)在S0樣本中的相對(duì)豐度分別為20%和14%。在經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥之后，這些菌門(mén)都有顯著的下降。其中變形菌門(mén)，擬桿菌門(mén)，髕骨細(xì)菌門(mén)和硝化菌門(mén)經(jīng)過(guò)27 d的堆肥，相對(duì)豐度極顯著降低(P<0.01)，酸桿菌門(mén)和浮霉菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著降低(P<0.05)。致病性參數(shù)從S0的13.21%降至S27的5%，從B0的11.64%降至B27的5.13%。通過(guò)FAPROTAX對(duì)不同堆肥階段群落特征進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥后，堆肥初始樣本中的動(dòng)物寄生蟲(chóng)、人類致病菌、細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)(intracellular parasite)等顯著的下降(P<0.05)，植物的病原菌則有極顯著的下降(P<0.01)。通過(guò)與virulence factor database (VFDB)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)以及已報(bào)道的140種潛在致病菌的比對(duì)，發(fā)現(xiàn)堆肥初始樣本中有40種潛在病原菌被比對(duì)到。其中分枝桿菌屬，金黃桿菌屬和梭菌屬等7個(gè)細(xì)菌屬經(jīng)過(guò)27 d的覆膜高溫堆肥后具有顯著下降(P<0.05)。綜上所述，堆肥的初始樣本城市污泥中含有較多的病原微生物，具有較高的致病性，經(jīng)過(guò)27 d覆膜高溫堆肥能有效地降低城市污泥中的有害微生物的含量。

本研究采用Illumina Miseq高通量測(cè)序的技術(shù)，解析了覆膜高溫好氧堆肥不同階段的微生物組成及變化的規(guī)律，嘗試闡明不同堆肥階段的標(biāo)志微生物，為進(jìn)一步優(yōu)化覆膜高溫好氧堆肥工藝奠定理論基礎(chǔ)。此外，通過(guò)BugBase和FAPROTAX功能預(yù)測(cè)及潛在病原菌庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)覆膜高溫好氧堆肥能有效地降低堆肥樣本中有害微生物的豐度，這為闡釋覆膜高溫好氧堆肥無(wú)害化的機(jī)制提供理論支持。