王金鳳，王 楓，趙桂芝，于興娟，祝建材

(山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，山東 煙臺(tái) 264199)

過(guò)敏性鼻炎又稱(chēng)變應(yīng)性鼻炎，是特應(yīng)性機(jī)體接觸變應(yīng)原后產(chǎn)生的由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，多種炎細(xì)胞浸潤(rùn)是其主要病理特征[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素等對(duì)癥處理，短期療效好，但不良反應(yīng)大，易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為過(guò)敏性鼻炎屬“鼻鼽”“鼻嚏”范疇，其是一種以突然和反復(fù)發(fā)作的鼻癢、噴嚏、流清涕為主要特征的鼻病，主要因臟腑功能虛損在先，繼而感受風(fēng)寒而引發(fā)，是正虛與邪侵共同作用的結(jié)果，目前公認(rèn)的證型有肺氣虛寒證、脾氣虛弱證、腎陽(yáng)不足證和肺經(jīng)伏熱證4種，其中肺氣虛寒證所占比例最高[3-4]。小青龍湯是治療鼻鼽肺氣虛寒型的基本方[5]，既往對(duì)于其作用機(jī)制的研究主要集中在平衡Th1/Th2、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞的活化和成熟，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫功能方面，對(duì)其抗炎機(jī)制研究較少[6-7]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀(guān)察小青龍湯對(duì)過(guò)敏性鼻炎大鼠炎癥介質(zhì)P物質(zhì)(SP)、膜聯(lián)蛋白1(Annexin1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)的影響，進(jìn)一步探討了小青龍湯治療過(guò)敏性鼻炎的作用機(jī)制，旨在為其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性SD大鼠48只，5～6周齡，體重160～180 g，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供，合格證編號(hào)：370726211100170223，許可證號(hào)：SCXK(魯)20190003。所有動(dòng)物均在山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物觀(guān)察室內(nèi)飼養(yǎng)、造模、取材，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度18～20 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，光照時(shí)間固定，24 h晝夜循環(huán)光照，所有動(dòng)物自由飲水飲食。本實(shí)驗(yàn)方案符合山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)定。

1.2儀器與設(shè)備 KD-BM Ⅲ型電腦生物組織包埋機(jī)、KD-BL Ⅲ型包埋機(jī)冷凍臺(tái)、KD-2258輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、KD-TH Ⅰ型電腦生物組織攤烤烘片機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；DP-72光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；MK3酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)。

1.3藥物與試劑 小青龍湯(由麻黃9 g、芍藥9 g、細(xì)辛3 g、干姜6 g、炙甘草6 g、桂枝9 g、半夏9 g、五味子6 g組成)飲片購(gòu)自山東中醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定均為真品，飲片加入蒸餾水500 mL浸泡1 h，煮沸30 min，濾過(guò)，藥渣加入蒸餾水300 mL，繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，兩液混合后用紗布過(guò)濾，水浴濃縮至60 mL，即為小青龍湯水煎劑，生藥含量為1 g/mL；蒼耳子鼻炎膠囊(四川森科制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20064301，規(guī)格：0.4 g/粒，批號(hào)：201105)；卵白蛋白、氫氧化鋁粉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：SLCH2414，MKCM1237)；大鼠白細(xì)胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ) ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：1281728416，961743416)；大鼠IgE ELISA試劑盒(Solarbio，批號(hào)：20210416)；兔抗大鼠VCAM-1單克隆抗體、兔抗大鼠Annexin1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：17274289，9L117)；兔抗大鼠SP多克隆抗體(Affinity，批號(hào)：53q1907)；即用型SABC-POD試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：16B07A)。

1.4分組、模型制備與干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、蒼耳子鼻炎膠囊組和小青龍湯高、中、低劑量組，每組8只。除正常組大鼠外，其余組大鼠參照文獻(xiàn)[8-9]方法建立過(guò)敏性鼻炎模型?；A(chǔ)致敏：每只大鼠于腹腔內(nèi)注射由卵白蛋白0.3 mg、氫氧化鋁30 mg和生理鹽水1 mL制成的混懸液，隔天1次，共7次；滴鼻激發(fā)：配制5%卵白蛋白生理鹽水液，從基礎(chǔ)致敏結(jié)束后的第2天(正式實(shí)驗(yàn)第15天)開(kāi)始滴鼻，每側(cè)鼻孔50 μL，連續(xù)7 d。于末次滴鼻30 min內(nèi)觀(guān)察大鼠撓鼻、噴嚏、流涕情況，通過(guò)疊加量化計(jì)分法[10]進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，積分≥5分即為造模成功，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。建模成功后，隔天給予大鼠卵白蛋白1 g/L滴鼻以維持對(duì)鼻黏膜的刺激?；A(chǔ)致敏后各組開(kāi)始灌胃干預(yù)(給藥量根據(jù)人的臨床劑量按照體重折算[11])：蒼耳子鼻炎膠囊組給予蒼耳子鼻炎膠囊溶液0.28 g/kg(相當(dāng)于人臨床等效劑量的7倍)灌胃，小青龍湯高、中、低劑量組分別給予小青龍湯14 g/kg、7 g/kg、3.5 g/kg(相當(dāng)于人臨床等效劑量的14，7，3.5倍)灌胃，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，均每日1次，連續(xù)14 d。

表1 過(guò)敏性鼻炎大鼠行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.5觀(guān)察指標(biāo)與方法

1.5.1大鼠行為學(xué)評(píng)分 于末次灌胃后30 min內(nèi)觀(guān)察各組大鼠撓鼻、噴嚏、流涕情況，進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。

1.5.2血清IgE、IL-4、IFN-γ水平 大鼠末次灌胃后禁食不禁水16 h，10%水合氯醛(0.003 mL/g)麻醉后腹主動(dòng)脈取血5 mL,置于不含抗凝劑試管中，室溫下放置20 min，3 000 r/min離心20 min，分離血清,按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)采用雙抗體夾心法測(cè)定血清中IgE、IL-4、IFN-γ水平。

1.5.3鼻黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn) 大鼠取血后去除面部皮毛，掀開(kāi)鼻骨，打開(kāi)鼻腔，用鑷子夾取鼻頭分離鼻中隔黏膜，經(jīng)4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，然后浸蠟包埋，切片。取部分切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片，最后進(jìn)行顯微鏡觀(guān)察。

1.5.4鼻黏膜組織中SP、Annexin1、VCAM-1表達(dá)情況 采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法測(cè)定，按SABC試劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格操作。具體步驟：鼻黏膜切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、3%過(guò)氧化氫滅活、微波修復(fù)、5%BSA封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(兔抗大鼠SP、Annexin1多克隆抗體、兔抗大鼠VCAM-1單克隆抗體稀釋濃度分別是1∶100，1∶200，1∶80，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照)，二抗37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min后，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡下觀(guān)察，組織上出現(xiàn)棕黃色即為陽(yáng)性。每張切片取3個(gè)400倍不同視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，記錄平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為學(xué)評(píng)分比較 正常組、模型組、蒼耳子鼻炎膠囊組及小青龍湯高、中、低劑量組大鼠行為學(xué)評(píng)分分別為(0.75±0.46)分、(6.13±0.83)分、(1.78±0.83)分、(1.65±0.89)分、(2.38±0.5)分、(3.00±0.76)分，模型組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯高于正常組(P<0.05)，小青龍湯各組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠行為學(xué)評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組均明顯低于小青龍湯中、低劑量組(P均<0.05)，小青龍湯高劑量組與蒼耳子鼻炎膠囊組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組大鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清IgE、IL-4水平均明顯升高(P均<0.05)，血清IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，小青龍湯各組和蒼耳子鼻炎膠囊組血清IgE、IL-4水平均明顯降低(P均<0.05)，血清IFN-γ水平均明顯升高(P均<0.05)；與小青龍湯中、低劑量組比較，小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組血清IgE、IL-4水平均更低(P均<0.05)，血清IFN-γ水平均更高(P均<0.05)，小青龍湯高劑量組與蒼耳子鼻炎膠囊組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正常組和過(guò)敏性鼻炎各組大鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較

2.3各組大鼠鼻黏膜組織病理學(xué)表現(xiàn) 正常組大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，纖毛完整，可見(jiàn)少量杯狀細(xì)胞(箭頭所示)；模型組大鼠鼻黏膜上皮不連續(xù)，纖毛倒伏、脫落，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞為主的大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，小青龍湯各組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞的形態(tài)和纖毛的完整性不同程度恢復(fù)正常,嗜酸性細(xì)胞數(shù)量不同程度減少。見(jiàn)圖1。

圖1 正常組和過(guò)敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠鼻黏膜組織中SP、Annexin1、VCAM-1表達(dá)情況 與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均明顯升高(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，小青龍湯高、中劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均明顯降低(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值均明顯升高(P均<0.05)；小青龍湯低劑量組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值無(wú)明顯變化(P均>0.05)，Annexin1平均光密度值明顯升高(P<0.05)。與小青龍湯中、低劑量組比較，小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均更低(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值均更高(P均<0.05)，小青龍湯高劑量組與蒼耳子鼻炎膠囊組各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)圖2～4及表3。

表3 正常組和過(guò)敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中SP、Annexin1、VCAM-1平均光密度值比較

圖2 正常組和過(guò)敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中SP表達(dá)情況 (IHC，×400)

3 討 論

過(guò)敏性鼻炎是臨床最常見(jiàn)的過(guò)敏性疾病之一，其是一種由變應(yīng)原激發(fā)、IgE介導(dǎo)、肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞共同參與的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與環(huán)境、免疫調(diào)控失衡和炎癥有關(guān)。IgE在過(guò)敏性鼻炎發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色，總IgE水平增高可用于判斷患者是否為特應(yīng)性體質(zhì)，也是過(guò)敏性鼻炎的主要診斷指標(biāo)和治療靶標(biāo)[12]。Th1/Th2失衡是過(guò)敏性鼻炎發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)[13]。IFN-γ、IL-4分別是Th1和Th2細(xì)胞的代表因子，在T細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IL-4可促進(jìn)Th0細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)h2細(xì)胞，活化后的Th2細(xì)胞可產(chǎn)生更多的IL-4，進(jìn)而誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE，促進(jìn)過(guò)敏性鼻炎發(fā)生；IFN-γ由Th1產(chǎn)生，是IL-4的拮抗劑，在過(guò)敏性鼻炎中起負(fù)調(diào)節(jié)作用[14]。

圖3 正常組和過(guò)敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中Annexin1表達(dá)情況(IHC，×400)

圖4 正常組和過(guò)敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中VCAM-1表達(dá)情況(IHC，×400)

目前研究認(rèn)為，炎癥介質(zhì)SP、Annexin1、VCAM-1表達(dá)異常與過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病及相關(guān)病理學(xué)改變有關(guān)。SP是由分布于肥大細(xì)胞周?chē)碾哪苌窠?jīng)纖維所釋放的一種神經(jīng)肽，其可導(dǎo)致血管通透性增加、黏膜水腫、血漿外溢，肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，引起炎癥反應(yīng)，在過(guò)敏性鼻炎發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用[15-16]。Annexin1是最早發(fā)現(xiàn)的鈣依賴(lài)的膜磷脂結(jié)合蛋白超家族成員，能刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生抗炎因子IL-10，抑制磷脂酶活性，進(jìn)而抑制炎癥因子合成[17]；可干擾粒細(xì)胞黏附、遷移和聚集，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬作用，抑制炎性介質(zhì)的合成和釋放，具有很強(qiáng)的抗炎作用[18]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族成員，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)，能選擇性的將嗜酸性粒細(xì)胞黏附到血管內(nèi)皮細(xì)胞上，從而使嗜酸性粒細(xì)胞遷移至炎癥區(qū)域，誘發(fā)超敏反應(yīng)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)敏性鼻炎患者VCAM-1水平較健康人顯著升高，表明其參與了過(guò)敏性鼻炎的病理過(guò)程[20]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠經(jīng)卵白蛋白腹腔注射致敏、雙側(cè)鼻腔滴鼻激發(fā)后出現(xiàn)撓鼻、噴嚏、流涕等過(guò)敏性鼻炎典型癥狀，病理學(xué)觀(guān)察可見(jiàn)鼻黏膜上皮不連續(xù)，纖毛倒伏、脫落，杯狀細(xì)胞數(shù)量明顯增多，并見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞為主的大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；血清IgE、IL-4水平明顯升高，血清IFN-γ水平明顯降低；鼻黏膜組織中SP、VCAM-1表達(dá)明顯升高，Annexin1表達(dá)明顯降低。表明過(guò)敏性鼻炎大鼠存在Th1/Th2細(xì)胞因子失衡，炎癥介質(zhì)SP、VCAM-1、Annexin1表達(dá)異常，與過(guò)敏性鼻炎患者臨床特征相似[21]，提示模型復(fù)制成功。

小青龍湯源自漢代張仲景的《傷寒雜病論·辨太陽(yáng)病脈證并治》篇之兩條，一條為“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發(fā)熱而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利、少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之”，另一條為“傷寒，心下有水氣，咳而微喘，發(fā)熱不渴。服湯已渴者，此寒去欲解也。小青龍湯主之”。小青龍湯是治療“外寒內(nèi)飲證”的代表方，被臨床廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如過(guò)敏性哮喘、慢性阻塞性肺疾病、過(guò)敏性鼻炎等[22]。方中麻黃、桂枝發(fā)汗散寒以解表邪，且麻黃兼能宣發(fā)肺氣而平喘咳，桂枝溫陽(yáng)以利內(nèi)飲；干姜、細(xì)辛溫肺化飲，兼助麻、桂解表；五味子酸斂護(hù)肺；芍藥酸斂合營(yíng)；半夏燥濕化痰，和胃降逆；炙甘草益氣和中；諸藥合用，共奏解表散寒、溫肺化飲之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明小青龍湯具有抗過(guò)敏作用，其抗過(guò)敏的物質(zhì)基礎(chǔ)是麻黃素和兒茶素[23]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析顯示麻黃、甘草的共有活性成分槲皮素，麻黃、白芍、細(xì)辛、甘草共有活性成分山柰酚可作用于炎性因子，參與調(diào)節(jié)免疫功能[24]。蒼耳子鼻炎膠囊的主要成分包括蒼耳子浸膏粉、石膏浸膏粉、白芷浸膏粉、辛夷揮發(fā)油等，是臨床治療過(guò)敏性鼻炎的常用中成藥[25]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，小青龍湯高、中劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠行為學(xué)評(píng)分明顯降低，病理學(xué)觀(guān)察見(jiàn)鼻黏膜上皮細(xì)胞的形態(tài)和纖毛的完整性不同程度恢復(fù)正常，嗜酸性細(xì)胞數(shù)量減少，血清IgE、IL-4水平及鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均明顯降低，血清IFN-γ水平及鼻黏膜組織中Annexin1平均光密度值均明顯升高，小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組各指標(biāo)改善更明顯且2組間各指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，小青龍湯低劑量組SP、VCAM-1改善不明顯。說(shuō)明小青龍湯可減輕過(guò)敏性鼻炎癥狀，影響過(guò)敏性鼻炎大鼠炎癥介質(zhì)表達(dá)，調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子產(chǎn)生，以中、高劑量療效為佳，且呈劑量依賴(lài)性，高劑量小青龍湯與蒼耳子鼻炎膠囊藥效相當(dāng)。

綜上所述，小青龍湯可明顯改善過(guò)敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜炎性癥狀，其作用機(jī)制可能與抑制炎癥介質(zhì)SP、VCAM-1表達(dá)，上調(diào)Annexin1表達(dá)和調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子失衡有關(guān)，為經(jīng)方臨床推廣治療過(guò)敏性鼻炎提供了依據(jù)，但其具體的作用機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。