黃茹妍，張鵬飛，羅湘蓉，吳仰聰，潘 玲

(1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530000；2. 柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545000；3. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530000)

特發(fā)性肺纖維化是一種局限于肺部的慢性進(jìn)行性纖維化間質(zhì)性肺炎，是一種原因不明且不可逆的嚴(yán)重肺部疾病，患者預(yù)后較差，生存率低于許多常見(jiàn)類(lèi)型的癌癥[1-2]。目前臨床指南推薦用藥吡非尼酮和尼達(dá)尼布有一定延緩肺纖維化進(jìn)展的作用[3-6]，但患者的肺功能仍會(huì)持續(xù)下降，最終發(fā)展到終末期呼吸衰竭、甚至死亡。因此，亟待尋找新的能有效減緩或治愈肺纖維化的方法。Kang等[7]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，核轉(zhuǎn)錄因子κB (NF-κB )信號(hào)通路激活可加速由博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進(jìn)程，吡非尼酮干預(yù)可抑制NF-κB蛋白表達(dá)，提示調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路可能會(huì)延緩或改善肺纖維化。Xiao等[8]研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路而逆轉(zhuǎn)了由脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化進(jìn)程。黃輝等[9]綜述了Th1/Th2 細(xì)胞平衡與多種器官纖維化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2分泌狀態(tài)可對(duì)多種器官的纖維化過(guò)程起到抑制或促進(jìn)作用。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物有改善或延緩肺纖維化進(jìn)展的作用[10-13]，但其防治效果有待大樣本研究證實(shí)，且其作用機(jī)制尚不明確。受上述研究啟發(fā)，本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)觀察銀杏葉提取物對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的標(biāo)志性代表因子干擾素-γ(IFN-γ)/白細(xì)胞介素-4(IL-4)和NF-κB p65表達(dá)的影響，探討銀杏葉提取物能否發(fā)揮抑制肺纖維化的作用及其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 72只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重180～200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002。購(gòu)回后飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(溫度22～25 ℃，濕度60%～70%)，通風(fēng)良好，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，可自由飲水及進(jìn)食，適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)學(xué)校倫理審核。

1.2主要試劑及儀器 NF-κB p65免疫組化試劑盒(武漢拜意爾生物有限公司)，博來(lái)霉素(索萊寶生物科技有限公司)，吡非尼酮(北京康蒂尼藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20133376，規(guī)格：100 mg/粒)，金納多銀杏葉提取物片(德國(guó)威瑪舒培博士藥廠，注冊(cè)證號(hào)H20140768，規(guī)格：40 mg/片)；顯微鏡(BX51T-PHD-J11型，日本奧林巴斯)，石蠟切片機(jī)(RM2015型，德國(guó)萊卡)，離心機(jī)(5430/5430R型，德國(guó)Eppendorf公司)，低溫冰箱(MDF-382E型，日本三洋)，恒溫水浴箱(DSHZ-300型，江蘇太倉(cāng)醫(yī)用儀器廠)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將72只大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組，每組12只。正常組大鼠氣管內(nèi)注射生理鹽水(1 mL/kg)，其余組大鼠氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素溶液(5 mg/kg)制備肺纖維化模型。造模24 h后可正常飲水進(jìn)食，常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)6 d。于第8天開(kāi)始，正常組、模型組每日予1 mL生理鹽水灌胃；吡非尼酮組每日予50 mg/kg吡非尼酮溶液灌胃，銀杏葉提取物高、中、低劑量組每日分別予100 mg/kg、50 mg/kg、25mg/kg的銀杏葉片混懸液灌胃，給藥體積均為10 mL/kg。各組均連續(xù)灌胃21 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1肺組織病理形態(tài) 實(shí)驗(yàn)第29天處死各組大鼠，取肺組織，采用4%多聚甲醛固定。取右肺葉行HE染色和Masson染色(嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)執(zhí)行)，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理組織學(xué)觀察并攝片。根據(jù)Szapiel等[14]的方法，用HE染色切片評(píng)估肺組織炎癥情況，用Masson染色切片評(píng)估肺纖維化程度。0級(jí)(1分)：無(wú)肺泡炎、無(wú)纖維化改變；1級(jí)(2分)：輕度肺泡炎及纖維化，肺泡結(jié)構(gòu)良好，單核細(xì)胞浸潤(rùn)使肺泡間隔增寬，炎癥及纖維化改變呈局灶性，病變范圍不到全肺的20%；2級(jí)(3分)：中度肺泡炎及纖維化，存在較廣泛的肺組織炎癥及纖維化改變，改變區(qū)域大部分從胸膜向內(nèi)延伸但仍主要以胸膜為主，病變面積占全肺的20%～50%；3級(jí)(4分)：重度肺泡炎及纖維化，病變面積超過(guò)全肺的50%，可見(jiàn)大小不等的囊氣腔，間質(zhì)和(或)肺泡內(nèi)可見(jiàn)一些出血區(qū)域，可見(jiàn)廣泛的肺實(shí)質(zhì)紊亂。

1.4.2肺組織中IFN-γ及IL-4表達(dá)情況 取左上肺組織約50 mg，制備單細(xì)胞懸液。在含細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑，加入20 μL PE/Cy5標(biāo)記anti-CD4進(jìn)行細(xì)胞表面染色，混勻，室溫暗處孵育15 min，500 r/min離心5 min，棄上清。隨后進(jìn)行固定和破膜，加入0.5 mL的固定劑室溫暗處孵15 min，加入PBS，500 r/min離心5 min，棄上清；加入1mL破膜劑室溫暗處孵10 min，加PBS洗液，500 r/min離心5 min，棄上清。最后進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色，加入熒光素標(biāo)記抗體IFN-γ-PE、IL-4-PE, 混勻，室溫暗處孵育30 min。加洗液，500 r/min離心5 min，棄上清，加入0.5 mL PBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.3肺組織中NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)情況 取4%多聚甲醛固定的右肺葉，行石蠟切片脫蠟水化,PBS液浸泡,一抗孵育過(guò)夜,PBS沖洗,標(biāo)記二抗,緩沖液沖洗后DAB顯色,自來(lái)水充分沖洗,復(fù)染,脫水,透明干燥,封片。鏡下觀察肺組織切片，并采用Image J軟件對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析,并計(jì)算積分光密度值(IOD)，IOD越大表示陽(yáng)性反應(yīng)越強(qiáng)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織 HE染色和Masson染色病理表現(xiàn) 正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡內(nèi)無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)病理改變及藍(lán)色膠原沉積；模型組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡萎縮或消失，肺泡間隔明顯增寬，肺泡內(nèi)可見(jiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和藍(lán)色膠原纖維沉積，呈彌漫性纖維化改變；吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組大鼠的肺泡結(jié)構(gòu)破壞程度、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維化改變程度均較模型組輕，但銀杏葉提取物各組病理改變較吡非尼酮組明顯。見(jiàn)圖1及圖2。

圖1 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織HE染色情況(×200)

圖2 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織Masson染色情況(×200)

2.2各組大鼠肺組織炎癥及纖維化評(píng)分比較 模型組大鼠肺組織炎癥及纖維化評(píng)分均明顯高于正常組(P均<0.05)；吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組大鼠肺組織炎癥及纖維化評(píng)分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且吡非尼酮組均明顯低于銀杏葉提取物各組(P均<0.05)，銀杏葉提取物高劑量組均明顯低于銀杏葉提取物中、低劑量組(P均<0.05)，銀杏葉提取物中、低劑量組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織炎癥及纖維化程度評(píng)分比較分)

2.3各組大鼠肺組織中IFN-γ和IL-4表達(dá)率比較 與正常組比較，模型組大鼠肺組織中IFN-γ表達(dá)率明顯降低(P<0.05)，IL-4表達(dá)率明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組大鼠肺組織中IFN-γ表達(dá)率均明顯升高(P均<0.05)，IL-4表達(dá)率均明顯降低(P均<0.05)；與吡非尼酮組比較，銀杏葉提取物各組大鼠肺組織中IFN-γ和IL-4表達(dá)率均更高(P均<0.05)，銀杏葉提取物各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 正常組和肺纖維化各組大鼠肺組織中IFN-γ和IL-4表達(dá)率比較

2.4各組大鼠肺組織中NF-κB p65表達(dá)情況正常組、模型組、吡非尼酮組及銀杏葉提取物高、中、低劑量組大鼠肺組織中NF-κB p65表達(dá)IOD值分別為5.28±1.55，26.21±4.54，11.07±1.41，13.60±2.30，13.62±2.12，12.79±1.62，模型組明顯高于正常組(P<0.05)，吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組均明顯低于模型組(P均<0.05)，吡非尼酮組和銀杏葉提取物各組間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討 論

肺纖維化是肺泡上皮的持續(xù)損傷和病理?yè)p傷后的異常修復(fù)，而后繼續(xù)發(fā)展造成的膠原纖維過(guò)度沉積和肺組織瘢痕性變化的肺部疾病，其特征之一就是連續(xù)的急性肺損傷。目前炎癥也被認(rèn)為是導(dǎo)致纖維化的因素之一[15]，因此通過(guò)抗炎療法有望延緩或改善肺纖維化。Yao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物干預(yù)可明顯下調(diào)脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)表達(dá)水平。Tao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物主要成分黃酮苷可通過(guò)抑制白細(xì)胞彈性蛋白酶的活性而發(fā)揮抗炎作用。本研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物可在一定程度上減輕或改善大鼠肺組織及肺血管周?chē)装Y，抑制支氣管、肺血管結(jié)構(gòu)重塑，有一定延緩肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展的作用[18-20]。本實(shí)驗(yàn)中，HE和Masson染色證實(shí)銀杏葉提取物可改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺組織炎癥及纖維化，且高濃度的改善效果優(yōu)于低濃度，但與吡非尼酮相比存在療效差異。因此筆者認(rèn)為，銀杏葉提取物有改善肺組織炎癥及纖維化的作用，且治療劑量的選擇對(duì)于治療效果而言有著重要意義，但這需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)證實(shí)。

在正常情況下，Th1、Th2細(xì)胞因子處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦受到刺激則容易失衡而引起機(jī)體相應(yīng)變化，有研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)調(diào)節(jié)Th1、Th2細(xì)胞因子之間的平衡可影響肺纖維化的進(jìn)展[21]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與器官纖維化的病理生理發(fā)生過(guò)程關(guān)系密切[22]，其中TGF-β是誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生的重要因子之一。作為T(mén)h1生物標(biāo)志物之一的IFN-γ是一種有效的TGF-β抑制劑，因此IFN-γ療法有望成為一種新的治療手段。Fusiak等[23]發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化患者經(jīng)IFN-γ吸入治療后，患者肺功能沒(méi)有經(jīng)歷持續(xù)下降的情況，且處于一個(gè)疾病穩(wěn)定的狀態(tài)。 Wang等[24]研究中發(fā)現(xiàn)吸入IFN-γ 可以改變下呼吸道黏膜的多種免疫和組織修復(fù)途徑，這與下呼吸道微生物群的分類(lèi)組成與多種免疫途徑顯著相關(guān)，這些途徑可能在特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化的肺實(shí)質(zhì)損傷/修復(fù)過(guò)程中起作用。IL-4是Th2細(xì)胞的標(biāo)志性代表因子，Th2細(xì)胞作為T(mén)h1細(xì)胞的公認(rèn)對(duì)手，可以改變與Th1相關(guān)的IFN-γ表達(dá)水平。李娟等[25]研究發(fā)現(xiàn)，隨著矽肺大鼠肺纖維化的進(jìn)展，IFN-γ表達(dá)減弱,IL-4表達(dá)增強(qiáng)。Xiong等[26]研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)可通過(guò)促進(jìn)纖維細(xì)胞積累，減弱Th17反應(yīng)和調(diào)節(jié)肺組織中的Th1/Th2細(xì)胞因子平衡而參與輻射誘導(dǎo)的肺纖維化，Treg耗竭可破壞Th1/Th2的平衡，增強(qiáng)Th1細(xì)胞因子的優(yōu)勢(shì)(如促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生)，減少Th2細(xì)胞因子(如IL-4)的產(chǎn)生，通過(guò)治療性調(diào)節(jié)Treg可減慢輻射誘發(fā)的肺纖維化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)以細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的IFN-γ代表Th1型細(xì)胞,IL-4代表Th2型細(xì)胞, 結(jié)果顯示模型組IFN-γ表達(dá)率降低而IL-4表達(dá)率升高，吡非尼酮組及銀杏葉提取物各組IFN-γ表達(dá)率較模型組高而IL-4表達(dá)率較模型組低，這與既往研究結(jié)果一致。Th1/Th2作為不同的Th細(xì)胞亞群，除了標(biāo)志性代表因子IFN-γ/IL-4之外，尚分泌不同的細(xì)胞因子，因此僅觀察IFN-γ/IL-4的表達(dá)變化尚不能完全反映Th1/Th2細(xì)胞的平衡改變對(duì)肺纖維化的影響，但這為臨床提供了一條銀杏葉提取物通過(guò)調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞因子平衡而改善肺纖維化的治療思路。

NF-κB 是調(diào)控炎癥和免疫反應(yīng)的主要核轉(zhuǎn)錄因子之一，其中起主要調(diào)控作用的是由P50和P65亞基組成的異源二聚體[27]。NF-κB被誘導(dǎo)激活時(shí)，可促進(jìn)多種炎癥因子的大量釋放，刺激成纖維細(xì)胞的增生和膠原纖維的沉積，從而促進(jìn)器官纖維化的發(fā)生發(fā)展[28]。彭艷芳等[29]和劉衛(wèi)東等[30]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路可改善博來(lái)霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化。盧林明等[31]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白楊素能通過(guò)影響NF-κB信號(hào)通路而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程，進(jìn)而產(chǎn)生抗纖維化作用，其機(jī)制可能與抑制NF-κB p65的磷酸化和其核轉(zhuǎn)移有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB p65的陽(yáng)性顆粒呈優(yōu)勢(shì)表達(dá)，而吡非尼酮組及銀杏葉提取物各組陽(yáng)性顆粒表達(dá)低于模型組。提示銀杏葉提取物有可能通過(guò)阻斷NF-κB p65信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制炎癥因子的釋放，從而延緩肺纖維化的進(jìn)展。

綜上所述，推測(cè)銀杏葉提取物一方面通過(guò)對(duì)Th1/Th2標(biāo)志性代表細(xì)胞因子IFN-γ/IL-4的平衡調(diào)節(jié)，抑制成纖維細(xì)胞的積累而起到減輕纖維化的作用；另一方面通過(guò)抑制NF-κB p65通路的激活而減輕炎癥反應(yīng)，從而改善纖維化。但該實(shí)驗(yàn)存在實(shí)驗(yàn)樣本量較少、未動(dòng)態(tài)觀察各指標(biāo)變化情況、未觀察檢測(cè)指標(biāo)上下游信號(hào)通路的相關(guān)分子變化等不足，仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。