馬宇軒 郄夢潔 趙姍姍 胡翔宇 趙 燕 郭 軍,*

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所/農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081)

我國的雙峰駝品種以新疆雙峰駝、內(nèi)蒙古阿拉善雙峰駝及內(nèi)蒙古蘇尼特雙峰駝為主[1]。自1996年起，我國的雙峰駝數(shù)量逐年遞減，直到2010年數(shù)量才有所回升。截至2019年年底，我國有40.5萬頭雙峰駝，其中新疆雙峰駝18.5萬頭，占全國雙峰駝總數(shù)的45.7%，內(nèi)蒙古雙峰駝17.3萬頭，占全國雙峰駝總數(shù)的42.7%。與2018年相比，2019年內(nèi)蒙古雙峰駝的出欄率增長了2.2%，商品率增長了4.25%[2]，內(nèi)蒙古雙峰駝產(chǎn)業(yè)正在逐年穩(wěn)步發(fā)展中。

駝乳被譽為“沙漠白金”，是優(yōu)質(zhì)的營養(yǎng)食品，比牛乳有更高的藥用價值[3-6]。但因駝乳的產(chǎn)量低及地域性強，供不應求，且價格較牛奶昂貴，易被摻假冒充[7]。目前，國外學者主要針對駝乳中的益生菌、功能性物質(zhì)及功能機制等方面進行了研究，且大部分為單峰駝乳[8]。此外，關于駝乳的理化性質(zhì)[9-10]、脂肪酸[11-12]、礦物元素[13-14]、蛋白質(zhì)[15-17]、氨基酸[18]及代謝組學[19]等方面的研究也在陸續(xù)開展。國內(nèi)關于雙峰駝乳的相關研究較多，但起步較晚，駝乳產(chǎn)品開發(fā)及標準研究等方面尚有不足，研究成果大部分集中在雙峰駝乳的一般成分、基本理化性質(zhì)[20-22]以及乳中的益生菌[23-24]等方面。關于雙峰駝乳溯源技術的研究尚未系統(tǒng)全面地開展，尤其是脂肪酸技術方面，目前主要應用脂肪酸技術進行物種鑒別和含量檢測研究，研究樣本量較小且缺乏較為系統(tǒng)的相關數(shù)據(jù)[22,25]。而利用脂肪酸技術進行雙峰駝乳產(chǎn)地溯源的研究較少。因此，本研究通過測定不同牧場及飼養(yǎng)方式下雙峰駝乳33種脂肪酸含量，結(jié)合化學計量學方法對阿拉善5個牧場139份雙峰駝乳樣品進行分析，開展阿拉善雙峰駝乳近距離產(chǎn)地及飼養(yǎng)方式溯源研究。參照國標對駝乳樣品的脂肪酸含量進行檢測，利用脂肪酸指紋特征建立判別模型，并對模型進行驗證，計算各脂肪酸的重要性，選擇判別模型的關鍵重要性因子(variable importance,VIP)，以期為阿拉善雙峰駝乳的系統(tǒng)營養(yǎng)評價提供依據(jù)，為雙峰駝乳近距離的產(chǎn)地溯源及真實性鑒別提供技術支持，為乳業(yè)安全相關研究提供思路。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年4月從內(nèi)蒙古自治區(qū)阿拉善左旗5個牧場人工收集雙峰駝乳樣品共計139份，并在-20℃下冷凍。駝乳樣品詳細信息如表1所示，采樣點位置圖見圖1。

表1 駝乳樣品地理信息表Table 1 Region information of camel milk samples

圖1 雙峰駝乳采樣點位置圖Fig.1 Map of Bactrian camel milk sampling sites

1.2 儀器及試劑

XS204型電子分析天平，瑞士METTLERTOLEDO公司；XMTD-204型HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇科析儀器有限公司；SCIENTZ-48高通量組織研磨器，寧波新芝生物科技股份有限公司；H1850臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；7890A 氣相色譜儀-FID檢測器、色譜柱DB-23(60 m × 0.25 mm，0.25 μm)，美國Agilent公司；具塞試管，北京萊伯沃德科技有限公司；培養(yǎng)皿，北京LABSELECT公司。

氯乙酰(分析純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碳酸鉀(分析純)，上海麥克林生化科技有限公司；水(蒸餾水)，香港屈臣氏集團有限公司；甲醇(色譜純)、正己烷(色譜純)，日本德山藥品工業(yè)株式會社；脂肪酸甲酯混合標準品(純度均大于99%)、內(nèi)標十一烷酸甲酯(純度均大于99%)，德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司。

1.3 樣品制備及甲酯化

參照《GB 5009.168-2016食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》[26]，取15 g駝乳樣品(鮮重)在 -20℃預凍，然后將其冷凍干燥26 h并研磨成細粉。稱取0.2 g凍干粉置于15 mL具塞試管中，加入1 mL十一烷酸甲酯標準溶液(1 mg·mL-1)，再分別加入 4 mL 正己烷和 6 mL乙酰氯甲醇溶液(v∶v，乙酰氯∶甲醇= 1∶10)，蓋緊塞子，旋緊螺旋蓋，振蕩混合后置于80℃水浴鍋中水浴2 h，取出冷卻至室溫。將樣液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，分別用3 mL 7%碳酸鉀水溶液清洗具塞試管3次，合并碳酸鉀溶液，5 000 r·min-1離心5 min，取上清液進行脂肪酸測定。正乙烷作為溶劑與混合脂肪酸甲酯標準品混合，配制成適當濃度，用于脂肪酸的定性分析。

圖2 雙峰駝乳脂肪酸氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatography of fatty acids in bactrian camel milk

1.4 氣相色譜條件

色譜柱：DB-23毛細管柱(60 m × 0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫條件：初始100℃，保持2 min，以25℃·min-1升至175℃，以1.5℃·min-1升至230℃，保持1 min；載氣：氮氣；流速：1 mL·min-1；分流比：1∶30；進樣口溫度：260℃；檢測器：FID檢測器；檢測器溫度：280℃；進樣量：1 μL。通過對照標準品保留時間對樣品中脂肪酸進行定性，內(nèi)標法定量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析及Duncan多重比較，分析不同牧場樣品中脂肪酸組成的差異，用獨立樣本t檢驗對不同飼養(yǎng)方式的駝乳脂肪酸數(shù)據(jù)進行檢驗，使用線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA)評價脂肪酸數(shù)據(jù)對不同樣品來源的判別效果。利用SIMCA 14.1軟件對不同來源的駝乳樣品進行正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least-squares discriminant analysis,OPLS-DA)，觀察不同牧場及飼養(yǎng)方式下脂肪酸指紋的聚類特性，并通過計算各脂肪酸的重要性來確定影響溯源的關鍵因子。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同牧場駝乳脂肪酸特征分析

通過氣相色譜技術對近距離的不同牧場的駝乳脂肪酸含量進行檢測，樣品的氣相色譜圖見圖2，方差分析結(jié)果見表2。所有雙峰駝乳樣品共測得33種脂肪酸。整體上，雙峰駝乳的飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)、多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)及總脂肪酸(total fatty acids，TFA)含量分別為185.80～205.60、99.64～118.79、13.71～18.81及300.99～334.22 mg·g-1；SFA/TFA、MUFA/TFA及PUFA/TFA分別為58%～63%、32%～37%及4%～6%；MUFA/SFA及PUFA/SFA分別為50%～64%及7%～9%，飽和脂肪酸含量/不飽和脂肪酸含量(unsaturated fatty acid，UFA)平均為1.6。

5個牧場駝乳中脂肪酸含量由高到低依次為棕櫚酸、油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸，分別約占總脂肪酸含量的27%、25%、17%、12%，棕櫚酸含量在牧場二中最高，在牧場五中最低；油酸含量在牧場三中最高，在牧場二中最低；硬脂酸含量在牧場五中最高，在牧場二中最低；肉豆蔻酸含量在牧場二中最高，在牧場五中最低。5個牧場駝乳樣品SFA中含量最高的是棕櫚酸，MUFA中含量最高的是油酸，PUFA中含量最高的是亞油酸，分別約占總脂肪酸含量的26%～30%、23%～28%及2%～3%。從營養(yǎng)學角度出發(fā)，5個牧場駝乳的n-3系列脂肪酸占總脂肪酸的0.67%～0.98%，其中牧場二駝乳的n-3系列脂肪酸占比最高，為0.98%。5個牧場駝乳的n-6系列脂肪酸占總脂肪酸的3.4%～4.6%，其中牧場一駝乳的n-6系列脂肪酸占比最高，為4.6%。

表2 不同牧場駝乳脂肪酸含量比較Table 2 Comparison of fatty acid content of camel milk in different pastures /(mg·g-1)

2.2 不同飼養(yǎng)方式下駝乳脂肪酸含量比較

對不同飼養(yǎng)方式下雙峰駝乳脂肪酸含量進行統(tǒng)計分析，獨立t檢驗結(jié)果見表3，在測得的33種脂肪酸中，有20種脂肪酸含量存在顯著或極顯著差異。草飼與谷飼方式下駝乳的SFA、PUFA、MUFA及TFA差異均不顯著(P>0.05)，SFA/TFA、MUFA/TFA及PUFA/TFA分別為61.72%和60.84%、33.01%和34.18%、5.28%和4.99%。兩種飼養(yǎng)方式下的雙峰駝乳脂肪酸含量由高到低均為棕櫚酸、油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸，除硬脂酸差異極顯著外(P<0.01)，其他3種脂肪酸含量均差異顯著(P<0.05)。草飼與谷飼方式下雙峰駝乳SFA中含量最高的脂肪酸均為棕櫚酸，分別占總脂肪酸含量的28.74%及26.10%；MUFA中含量最高的脂肪酸均為油酸，分別占總脂肪酸含量的23.42%及26.02%；PUFA中含量最高的脂肪酸均為亞油酸，分別約占總脂肪酸含量的2.75%及2.60%。從營養(yǎng)學角度出發(fā)，草飼與谷飼方式下駝乳的n-3系列脂肪酸分別占總脂肪酸的0.92%及0.75%，n-6系列脂肪酸分別占總脂肪酸的4.1%及3.9%。

2.3 不同牧場駝乳的化學計量學分析

通過OPLS-DA判別不同牧場的雙峰駝乳樣品，結(jié)果如圖3所示。5個牧場的駝乳樣品分別聚類且彼此分離，牧場一與牧場二在第一、第四象限分別聚類，牧場三及牧場四在第二象限分別聚類，牧場五在第三象限聚類，說明通過測定脂肪酸含量可以區(qū)分5個牧場的駝乳樣品，且將草飼方式下牧場一及牧場二的駝乳樣品與谷飼方式下牧場三、牧場四及牧場五的駝乳樣品明顯區(qū)分。對5個牧場的駝乳樣品進行分類及驗證，結(jié)果見表4?？傮w正確分類和交叉驗證的準確率分別為93.5%和82.7%，說明通過測定脂肪酸含量可以對5個牧場駝乳樣品進行判別。用SIMCA 14.1軟件對5個牧場駝乳樣品的脂肪酸含量進行分析，獲得分類脂肪酸的關鍵重要性因子(圖4)。結(jié)果表明，駝乳中硬脂酸、棕櫚油酸、木焦油酸、豆蔻油酸、 EPA等15種脂肪酸是具有較高貢獻的關鍵重要性因子(>1)，可以通過測定這15種脂肪酸識別5個牧場駝乳的來源。牧場一與牧場二的駝乳樣品在OPLS-DA圖中聚類距離較近，對這兩個牧場駝乳的脂肪酸含量進行分析，得到分類脂肪酸的關鍵重要性因子(圖5)，結(jié)果表明硬脂酸(37.39～58.33 mg·g-1)、花生酸(1.66～2.33 mg·g-1)、 反亞油酸(2.25～2.89 mg·g-1)等11種脂肪酸是具有較高貢獻的關鍵重要性因子，可以通過測定這11種脂肪酸識別牧場一與牧場二的駝乳樣品。同樣對牧場三及牧場四駝乳的脂肪酸含量進行分析，得到分類脂肪酸的關鍵重要性因子(圖6)，結(jié)果表明花生二烯酸(0.60～0.78 mg·g-1)、二十二碳二烯酸(0.23～0.30 mg·g-1)、 十七碳烯酸(1.96～2.44 mg·g-1)等10種脂肪酸是具有較高貢獻的關鍵重要性因子，可以通過測定這10種脂肪酸識別牧場三與牧場四的駝乳樣品。

表3 不同飼養(yǎng)方式下的駝乳脂肪酸含量Table 3 Fatty acid content of camel milk in different feeding methods /(mg·g-1)

圖3 5個牧場駝乳樣品的OPLS-DA圖Fig.3 OPLS-DA of camel milk from five pastures

圖4 5個牧場駝乳樣品分類脂肪酸的重要性因子Fig.4 The importance factors of fatty acids classification in camel milk from five pastures

2.4 不同飼養(yǎng)方式下駝乳的化學計量學分析

根據(jù)測得的脂肪酸含量數(shù)據(jù)對不同飼養(yǎng)方式下的駝乳樣品進行正交偏最小二乘法分析，結(jié)果見圖7。兩種飼養(yǎng)方式下的駝乳樣品分別聚類且彼此有明顯的分離趨勢，說明可通過脂肪酸含量對兩種飼養(yǎng)方式下的駝乳進行區(qū)分。對不同飼養(yǎng)方式下的駝乳樣品進行分類及驗證，結(jié)果見表5?？傮w正確分類和交叉驗證的準確率分別為98.6%和95.0%，說明利用脂肪酸含量數(shù)據(jù)可以對不同飼養(yǎng)方式下的駝乳樣品進行判別。對不同飼養(yǎng)方式下的駝乳樣品進行分析，獲得分類脂肪酸的關鍵重要性因子，如圖8所示。結(jié)果表明駝乳中EPA、二十碳烯酸、十五烷酸、木焦油酸、硬脂酸、棕櫚油酸、十三烷酸、十五碳烯酸、十七碳烯酸、花生酸、二十一烷酸、豆蔻油酸及肉豆蔻酸13種脂肪酸是貢獻率較高的關鍵重要性因子(>1)，可以通過這13種脂肪酸對不同飼養(yǎng)方式下的駝乳進行判別。

圖5 牧場一與牧場二駝乳樣品分類脂肪酸的重要性因子Fig.5 Important factors of fatty acids for classification of camel milk from pasture 1 and pasture 2

表4 不同牧場駝乳分類和正確分類的觀察結(jié)果Table 4 Classification and correct verification results of camel milk from five pastures

圖6 牧場三與牧場四駝乳樣品分類脂肪酸的重要性因子Fig.6 Important factors of fatty acids for classification of camel milk from pasture 3 and pasture 4

圖7 不同飼養(yǎng)方式下駝乳樣品的OPLS-DA圖Fig.7 OPLS-DA of camel milk in different feeding methods

3 討論

整體而言，本研究測得的雙峰駝乳中SFA/TFA、MUFA/TFA、PUFA/TFA、MUFA/SFA、PUFA/SFA及SFA/UFA結(jié)果與伊日貴[25]及李磊等[27]的研究結(jié)果一致，且與前人[22,25]相比測出的脂肪酸種類較多。本研究測得的阿拉善駝乳SFA/UFA 為1.6，與伊日貴[25]測得的新疆駝乳相比低0.4，與呼倫貝爾駝乳相比低0.3。而SFA/UFA值越低，營養(yǎng)價值越高[28]，說明阿拉善駝乳的營養(yǎng)價值比新疆駝乳及呼倫貝爾駝乳的營養(yǎng)價值高。

雙峰駝乳中脂肪酸含量由高到低依次為棕櫚酸、油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸，測得的結(jié)果與郭珍琪[22]及伊日貴[25]的研究結(jié)果一致，其中雙峰駝乳的棕櫚酸、油酸、硬脂酸含量占總脂肪酸含量的27%、25%及17%，棕櫚酸含量占比與呼倫貝爾駝乳及新疆駝乳相比較低，油酸含量占比較高，硬脂酸含量占比高于呼倫貝爾駝乳，低于新疆駝乳[25]。在測得的33種脂肪酸中，有26種脂肪酸含量在5個牧場駝乳樣品中存在不同情況的差異性，說明采用傳統(tǒng)統(tǒng)計學分析可以對5個牧場進行區(qū)分。除此之外，牧場一與牧場二的棕櫚酸含量高于其他牧場，油酸及硬脂酸含量低于其他牧場。牧場一與牧場二的駱駝以梭梭為食，牧場三、牧場四及牧場五的駱駝以玉米為食，說明駝乳脂肪酸含量與駱駝的飼養(yǎng)方式可能具有一定關聯(lián)性[29-30]，飼料能夠影響乳中的營養(yǎng)成分[22,31]。

表5 不同飼養(yǎng)方式下駝乳分類和正確分類的觀察結(jié)果Table 5 Classification and correct verification results of camel milk in different feeding methods

草飼雙峰駝乳的SFA及PUFA含量比谷飼雙峰駝乳高，但MUFA含量比谷飼雙峰駝乳低，與Bernardini等[32]、白薩如拉[33]、丹妮[34]及張振華[35]的研究結(jié)果相似。2種飼養(yǎng)方式下的駝乳脂肪酸含量由高到低為棕櫚酸、油酸、硬脂酸、肉豆蔻酸，這4種脂肪酸含量在2種飼養(yǎng)方式下存在顯著或極顯著差異，與前人研究結(jié)果相似[36]。從營養(yǎng)角度出發(fā)，草飼方式下駝乳SFA∶MUFA∶PUFA為12∶6∶1，谷飼方式下駝乳SFA∶MUFA∶PUFA為12∶7∶1，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)建議居民膳食S∶M∶P比例應盡量接近1∶1∶1[25]，可見草飼方式下的駝乳更符合居民營養(yǎng)需求[37-38]。

與郭珍琪[22]及伊日貴[25]的研究不同，本研究利用脂肪酸數(shù)據(jù)建立判別模型，通過OPLS-OA分析及線性判別分析對不同牧場及飼養(yǎng)方式的雙峰駝乳樣品進行判別，結(jié)果表明通過測定脂肪酸含量可以區(qū)分5個牧場及2種飼養(yǎng)方式的駝乳樣品，交叉驗證效果良好，并獲得可以識別5個牧場雙峰駝乳來源的15個關鍵重要性因子(硬脂酸、棕櫚油酸、木焦油酸、豆蔻油酸、二十碳五烯酸、二十二碳二烯酸、十七烷酸、亞油酸、花生酸、γ-亞麻酸、花生二烯酸、十五烷酸、反亞油酸、二十碳烯酸、二十一烷酸)，以及識別2種飼養(yǎng)方式下雙峰駝乳來源的13個關鍵重要性因子(二十碳五烯酸、二十碳烯酸、十五烷酸、木焦油酸、硬脂酸、棕櫚油酸、十三烷酸、十五碳烯酸、十七碳烯酸、花生酸、二十一烷酸、豆蔻油酸及肉豆蔻酸)。綜上，利用脂肪酸數(shù)據(jù)結(jié)合化學計量學分析可以有效地對較近距離產(chǎn)地的駝乳進行產(chǎn)地溯源判別[22,29]，不同飼養(yǎng)方式下的駝乳進行判別[32,39]。

4 結(jié)論

本研究通過氣相色譜法對不同牧場來源和不同飼養(yǎng)方式下的雙峰駝乳脂肪酸特征及溯源進行研究，共測得阿拉善駝乳中33種脂肪酸含量，且草飼駝乳比谷飼駝乳更符合居民營養(yǎng)需求，彌補了駝乳中個別脂肪酸含量測定的空白并提供了駝乳相關營養(yǎng)數(shù)據(jù)。在前人僅檢測駝乳含量的基礎上，本研究還建立了駝乳不同牧場來源及不同飼養(yǎng)方式溯源模型，獲得了良好的交叉驗證結(jié)果，并分別得到了判別不同牧場和飼養(yǎng)方式來源的15、13個關鍵重要性因子。綜上，利用脂肪酸特征結(jié)合化學計量學分析建立判別模型，對雙峰駝乳進行較近距離的產(chǎn)地溯源及飼養(yǎng)方式鑒別是可行的。