陳吉裕

（重慶三峽職業(yè)學(xué)院，重慶萬州 404155）

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

見血青采自四川省達(dá)州市宣漢縣（E107.72°，N31.35°），將整個(gè)植株連根帶土挖取，用苔蘚包裹根際土壤，置于紙箱中帶回，并用泥炭土∶蛭石=1∶1 混合均勻帶土栽培保存。經(jīng)重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校重慶三峽中藥研究所副所長(zhǎng)付紹智副教授鑒定為蘭科（Orchidaceae）羊耳蒜屬（）植物脈羊耳蘭的鮮株。

1.2 外植體消毒

選用生長(zhǎng)旺盛、長(zhǎng)勢(shì)基本一致的見血青新鮮植株，自來水沖洗10～15min，去掉根、葉片及莖表面殘留老葉等，用洗潔精溶液輕輕刷洗莖稈表面，再用自來水沖洗干凈，用吸水紙吸干。在超凈工作臺(tái)上，將外植體放入滅菌瓶，加入75%酒精，淹沒材料即可，搖晃10s，去掉酒精。以正交試驗(yàn)L9（34）為消毒處理，共9 個(gè)處理，即用0.1%HgCl2、農(nóng)用鏈霉素2000 倍液、甲基硫菌靈800 倍液、新潔爾滅10 倍液，按表1 具體消毒方法進(jìn)行，消毒液用量為材料的2 倍，各加1 滴吐溫-80，蓋上瓶蓋搖晃相應(yīng)時(shí)間，使之充分接觸。打開瓶蓋，去掉消毒液，搖晃2min，棄去液體，重復(fù)清洗5～6 次，用無菌紙吸干。將消毒后莖段接種至腋芽誘導(dǎo)初始培養(yǎng)基（1/2MS 培養(yǎng)基）中，每個(gè)消毒處理接種10 瓶，每個(gè)處理重復(fù)4 次且接種約15 株植株的莖，接種后放入25℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，每天光照16h，光照強(qiáng)度為3000Lx。培養(yǎng)15d 后統(tǒng)計(jì)外植體污染率和褐變率。

1.3 腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)

以植物激素6-BA、花寶1 號(hào)、馬鈴薯泥、香蕉泥為試驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L16（45）（見表2），共16 個(gè)處理配制腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，添加30g/L，瓊脂7g/L，pH 值均為5.8，121℃滅菌20min，自然冷卻，備用。

表2 培養(yǎng)基不同成分配比對(duì)莖段腋芽誘導(dǎo)的影響

將以1.2 中篩選出的消毒方法消毒后的莖切割成1～2cm 長(zhǎng)莖段，要求每個(gè)莖段至少帶1 個(gè)節(jié)。將莖段接種至腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接種1 個(gè)莖段，每個(gè)莖段插入培養(yǎng)基2～3mm。每個(gè)培養(yǎng)基處理接種10 瓶，每個(gè)處理重復(fù)5 次，接種后放入25℃培養(yǎng)室培養(yǎng)，每天光照16h，光照強(qiáng)度為3000Lx。培養(yǎng)30d 后統(tǒng)計(jì)腋芽誘導(dǎo)率、死亡率。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用PDS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V9.01 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

污染率（%）=（污染的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100

褐變率（%）=（褐變的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100

誘導(dǎo)率（%）=（腋芽萌發(fā)的外植體數(shù)／接種外植體數(shù)）×100

發(fā)芽率（%）=（芽數(shù)／接種莖段總數(shù)）×100

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)莖段消毒效果的影響

以0.1%HgCl2、新潔爾滅10 倍液和農(nóng)用鏈霉素2000 倍液為消毒劑，通過正交試驗(yàn)，由表1 可知，當(dāng)使用0.1%HgCl2消毒處理9min，再用新潔爾滅10 倍液消毒處理15 min，最后再使用農(nóng)用鏈霉素2000 倍液處理20 min 時(shí)，消毒效果最好，污染率僅為8.33%，褐變率也相應(yīng)最低為30%。從污染率而言，0.1%HgCl2對(duì)其影響最大，其次為新潔爾滅10 倍液，農(nóng)用鏈霉素2000倍液影響最??；從褐變率而言，0.1%HgCl2對(duì)其影響最大，2000 倍農(nóng)用鏈霉素和新潔爾滅10 倍液影響均很小，不明顯。因此，0.1%HgCl2對(duì)見血青莖段消毒效果影響最大，但由于HgCl2的毒害作用，隨著其消毒處理時(shí)間的增加，褐變率也隨之增加。

表1 不同消毒處理對(duì)莖段消毒效果比較

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)腋芽誘導(dǎo)的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

由最佳消毒方式消毒后，將至少帶1 個(gè)節(jié)的莖段接種至不同物質(zhì)配比的培養(yǎng)基中。由表2 可知，當(dāng)6-BA 添加量為2.0mg/L、花寶1 號(hào)添加量為1.5mg/L、馬鈴薯泥添加量為10g/L、香蕉泥添加量為5g/L 時(shí)，見血青莖段腋芽誘導(dǎo)率最高為96%，發(fā)芽率也最高為138.00%。發(fā)芽率高于100%的原因是部分莖段每節(jié)萌發(fā)1 個(gè)側(cè)芽（圖1A），而部分莖段節(jié)可萌發(fā)2～3 個(gè)側(cè)芽（圖1B 和C），特別是頂端和底端，節(jié)間短，常見萌發(fā)2～3 個(gè)側(cè)芽。在見血青莖段側(cè)芽誘導(dǎo)率上，6-BA＞香蕉泥＞馬鈴薯泥＞花寶1 號(hào)；在莖段側(cè)芽發(fā)芽率上，6-BA＞香蕉泥＞花寶1 號(hào)＞馬鈴薯泥?？傮w而言，6-BA 和香蕉泥對(duì)莖段側(cè)芽萌發(fā)的影響較大，其中6-BA 影響最大。

圖1 莖段側(cè)芽誘導(dǎo)結(jié)果

適宜見血青莖段的消毒方法為：0.1%HgCl29min+新潔爾滅10 倍液15min+農(nóng)用鏈霉素2000 倍液20min，污染率為8.33%，褐變率為30%；促進(jìn)莖段腋芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為：MS+2.0mg/L6-BA+1.5g/L 花寶1 號(hào)+10.0g/L 馬鈴薯泥+5.0g/L 香蕉泥，腋芽誘導(dǎo)率為96%，發(fā)芽率為138.00%。

3.2 討論

莖段是見血青組培快繁常選用的外植體[1-2]，誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)是見血青莖段增殖擴(kuò)繁的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。影響腋芽萌發(fā)的主要因素包括取材時(shí)期、植株生理狀態(tài)、培養(yǎng)基和消毒效果。造成污染的原因有很多，常見的如環(huán)境污染引起，超凈工作臺(tái)過濾裝置失效，培養(yǎng)基及器皿滅菌不徹底，外植體本身帶菌等。造成污染的病原主要為細(xì)菌、真菌、內(nèi)源菌。在整個(gè)組培過程中，最難處理的就是內(nèi)源菌污染，即由于外植體材料內(nèi)部（細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間）攜帶的微生物（如內(nèi)生細(xì)菌、真菌等），在用消毒劑處理過程中不能被一般的表面消毒方法所清除，在培養(yǎng)過程中從外植體內(nèi)部滋長(zhǎng)。蘭科植物根部本身攜帶眾多內(nèi)生真菌[2-3]，易引起組培污染。常見的對(duì)策為：改進(jìn)外植體消毒方法，如利用多種消毒劑間隙消毒、使用抗生素等。試驗(yàn)中使用HgCl2、新潔爾滅、農(nóng)用鏈霉素對(duì)見血青的消毒有明顯的效果，污染率為8.33%。

馬鈴薯、香蕉等有機(jī)添加物是蘭科植物組織培養(yǎng)中常用的有機(jī)添加物。它們含有氨基酸、礦物質(zhì)、維生素和碳水化合物等成分，這些成分對(duì)細(xì)胞的增殖和培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。天然有機(jī)物的添加對(duì)蘭科植物的組培有明顯促進(jìn)作用，常見的有馬鈴薯汁、椰子汁和香蕉汁等[1,4-6]。何官榕等[1]研究發(fā)現(xiàn)，添加香蕉汁、馬鈴薯汁有利于見血青不定芽誘導(dǎo)和增殖；王加文等[4]研究表明，對(duì)紫花羊耳蒜原球莖生長(zhǎng)的效果椰乳＞香蕉汁＞馬鈴薯汁。本研究中椰汁、香蕉汁對(duì)側(cè)芽萌發(fā)均有明顯影響。