楊曉蓉 楊啟梅 韓想利 張文

1 陜西省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科(西安 710068)

梅尼埃病是臨床常見的耳科疾病，臨床多表現(xiàn)為發(fā)作性眩暈、耳鳴、耳脹滿感及感音神經(jīng)性聽力下降等，其病因及發(fā)病機制尚不明確，認為與內淋巴管機械性阻塞、內淋巴吸收障礙、內耳缺血、免疫反應、遺傳因素及感染等有關[1]。研究發(fā)現(xiàn)免疫反應學說與梅尼埃病發(fā)病關系密切，內淋巴囊中免疫球蛋白和淋巴細胞參與內淋巴液的吸收，是內耳免疫反應的部位[2]。有研究報道，內耳可以介導局部免疫炎性反應，梅尼埃病患者自身存在免疫紊亂，免疫因素與梅尼埃病發(fā)生發(fā)展關系密切[3，4]。梅尼埃病患者存在局部及全身免疫反應，對糖皮質激素免疫抑制治療有效，提示其發(fā)病機制與免疫因素有關[5]。CD4+CD25+Foxp3+調節(jié)性T細胞(Treg)具有免疫抑制功能，在維持細胞免疫耐受方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Treg細胞能夠抑制T淋巴細胞和B淋巴細胞的免疫應答，抑制抗體介導的免疫反應，在自身免疫性疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用；Treg細胞功能障礙或數(shù)量減少時，機體免疫耐受抑制，免疫功能紊亂，引發(fā)一系列免疫反應，進而損害自身組織、器官及細胞，引發(fā)自身免疫性疾病[6]。張菊紅等[7]研究表明，CD4+CD25+Treg細胞抑制功能下降與自身免疫性感音神經(jīng)性聾發(fā)病關系密切，其功能或數(shù)量變化與自身免疫性內耳疾病小鼠病情嚴重程度呈正相關。Treg作為免疫學研究的重點近年在慢性炎癥及自身免疫疾病的治療中提供了重要指導。基于梅尼埃病的免疫學病機及Treg細胞可介導免疫耐受，推測Treg在梅尼埃病的發(fā)病中有重要作用，故本研究通過觀察CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及其相關因子在梅尼埃病患者外周血中的表達，探討其在梅尼埃病發(fā)生中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1研究對象及分組 納入2019年8月至2021年5月收治的45例梅尼埃病患者作為研究組，以同期健康人群30例作為對照組。研究組中男7例，女28例，年齡32～68歲，平均44.7±6.9歲；其中緩解期13例，發(fā)作期32例；單側36例，雙側9例；聽力分期1期3例，2期20例，3期16例，4期6例。健康對照組中男12例，女18例，年齡34～69歲，平均45.2±5.8歲。兩組性別、年齡等差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)學倫理委員會批準，患者及家屬均知情同意。

梅尼埃病組納入標準：梅尼埃病診斷參考《梅尼埃病診斷和治療指南(2017)》[8]；無耳蝸和前庭相關其他疾??；排除其他原因引起的眩暈；近期未使用免疫制劑、糖皮質激素、抗組胺藥物等；無其他重大疾病等；以患者最近6月內間歇期聽力最差時0.5、1.0、2.0 kHz純音平均聽閾進行分期，一期:平均聽閾≤25 dB HL，二期:平均聽閾為26～40 dB HL，三期:平均聽閾為41～70 dB HL，四期:平均聽閾>70 dB HL。健康對照組患者無耳鼻疾病，常規(guī)體檢及專科查體均正常。

1.2外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞檢測 采集兩組對象晨起空腹外周靜脈血約5 ml，抗凝管中低溫保存；取新鮮抗凝全血100 μL，梯度離心法分離外周血中單個核細胞(PBMCs)，加入FITC-CD4抗體、PE-CD25抗體各20 μL，混勻避光反應10 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清，固定穿孔，加入APC-FOXp3抗體標記，多聚甲醛固定，利用流式細胞儀以CD4設門，用CD4+CD25+和Foxp3+標記Treg細胞亞群，檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的百分比。

1.3外周血PBMCs中CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞相關因子轉化生長因子-β(TGF-β)、叉頭狀轉錄因子p3(Foxp3)mRNA相對表達檢測 采用Trizol法提取單個核細胞總RNA，檢測樣品濃度，通過逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，以此為模板配置PCR反應體系行PCR擴增反應，反應條件為：95 ℃ 15 s，：61 ℃ 15 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)40次，采用2-△△CT法分析TGF-β、Foxp3 mRNA相對表達。引物序列如下：TGF-β上游：5′-TGAAGCACGGAC-AGCCAGACG-3′，下游：5′-CTGCTAGCCAGTCA-GCCGAAT-3′；Foxp3上游：5′-AAGACAGGCCA-TCGGCCAGAAC-3′，下游：5′-TCCACGTGATCG-AGCGGTCGAC-3′；GAPDH上游：5′-GCACGGTGAACGCTCAGAAC-3′，下游：5′-TGCTGAACA-GCCGAGTCGA-3′。

1.4血清IL-10水平檢測 采用促凝真空采血管采集兩組晨起空腹外周靜脈血約3 ml，待其自然凝固后3 600 r/min離心15 min，收集血清低溫保存；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清白細胞介素-10(interleukin-10, IL-10)水平，檢測按操作說明書嚴格進行，檢測試劑盒購自北京達科為生物科技有限公司。

2 結果

2.1兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及相關因子水平比較 由表1可見，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比、外周血Foxp3 mRNA相對表達及血清IL-10水平明顯低于健康對照組，外周血TGF-β mRNA相對表達量則明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。健康對照組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及Foxp3 mRNA、血清IL-10水平高于梅尼埃病緩解期組，緩解期組高于發(fā)作期組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)；健康對照組TGF-β mRNA水平低于梅尼埃病緩解期組，緩解期組低于發(fā)作期組(P<0.05)。

表1 兩組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及相關因子水平比較

2.2外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及相關因子水平與梅尼埃病患者不同聽力分期和單雙側患耳的關系 梅尼埃病單、雙側患者及不同聽力分期患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比、血清IL-10及外周血TGF-β、Foxp3 mRNA水平組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2、3)。

表2 單、雙側梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及相關因子水平比較

2.3梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比與TGF-β、Foxp3、IL-10表達的相關性 Pearson相關性分析顯示，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比與外周血TGF-βmRNA水平呈負相關(r=-0.704，P<0.05)，與血清IL-10水平(r=0.679，P<0.05)和外周血Foxp3 mRNA水平(r=0.725，P<0.05)呈正相關。

表3 不同聽力分期梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及相關因子水平比較

3 討論

T淋巴細胞參與的細胞免疫和漿細胞介導的體液免疫是免疫反應的兩種，正常情況下，免疫系統(tǒng)能夠協(xié)調阻止免疫細胞對自身分子及組織、細胞產生免疫反應；當Treg細胞功能障礙時，機體免疫系統(tǒng)紊亂，機體自動識別抗原，引起一系列免疫反應，促進慢性炎癥及自身免疫性疾病的發(fā)生[6,9]。Treg細胞在維持機體穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，是免疫耐受的關鍵，相比于正常人群，自身免疫性疾病患者發(fā)病期Treg細胞水平降低，免疫抑制減輕，機體呈現(xiàn)高免疫反應狀態(tài)；隨著疾病緩解，Treg細胞水平升高，機體免疫抑制功能增強，免疫反應減弱[10]。而在自身免疫性內耳疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，Treg細胞參與該病的病機為激活的T細胞穿過血腦屏障進入腦實質，經(jīng)局部抗原的再次刺激能夠分泌大量細胞因子和趨化因子，招募外周循環(huán)中的T細胞、B細胞及單核細胞進入內耳，擴大免疫反應，損傷內耳組織[7]。CD4+CD25+Treg細胞通過抑制過強的自身免疫反應可對自身免疫性內耳疾病大鼠產生保護作用[7]。CD4+CD25+Treg細胞能抑制調控免疫反應，維持機體免疫耐受和免疫平衡，在防止變應性疾病、自身免疫疾病及母胎免疫耐受中發(fā)揮關鍵作用[11～13]?；诿纺岚２∶庖叻磻獙W說，內耳能夠接受抗原刺激產生免疫應答以及Treg細胞介導參與自身免疫性疾病的發(fā)展，本研究探討了CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞與梅尼埃病發(fā)生的關系，結果顯示梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的百分比明顯降低，表明梅尼埃病患者免疫抑制減弱。

CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞在體內主要通過TGF-β、IL-10等抑制性細胞因子發(fā)揮作用。TGF-β是誘導外周血CD4+T細胞向Treg細胞轉化的關鍵，其能抑制免疫活性細胞增殖、抑制細胞因子產生、抑制淋巴細胞分化，是切斷免疫應答的信號之一[14]。Treg細胞數(shù)量減少，機體代償機制促進TGF-β分泌以調節(jié)Treg細胞數(shù)量，增強免疫抑制功能[15]；IL-10是重要的抗炎因子，主要由Foxp3+Treg細胞分泌，能夠抑制輔助性T細胞(Th細胞)介導的免疫病理學反應，維持組織穩(wěn)態(tài)[16]。Treg細胞不同群體及其分泌的IL-10在維持免疫耐受方面具有重要意義，可提示疾病轉歸[17]。腺病毒介導的IL-10因子轉導入豚鼠內耳并表達基因產物，可在一定程度上減輕內耳組織免疫炎性損傷和聽力損傷[18]。此外，F(xiàn)oxp3是Treg細胞重要的調控基因，也是其重要的特異性標志，對Treg細胞的生成及功能維持起著重要作用[19]。本研究檢測梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞相關因子發(fā)現(xiàn)，TGF-βmRNA相對表達明顯升高，F(xiàn)oxp3 mRNA和血清IL-10水平明顯降低；健康對照組CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比及相關因子表達優(yōu)于梅尼埃病緩解期，緩解期優(yōu)于發(fā)作期，且CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞百分比與TGF-β、Foxp3、IL-10表達存在明顯的相關性，表明梅尼埃病患者處于免疫增強狀態(tài)，提示Treg細胞介導的細胞免疫調節(jié)與梅尼埃病的發(fā)生發(fā)展關系密切。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及相關因子水平在不同聽力分期和單雙側梅尼埃病患者中無明顯差異，表明梅尼埃病患者Treg細胞穩(wěn)定表達，印證了其本身即存在免疫抑制，可將Treg細胞及其相關因子作為梅尼埃病免疫檢測的預測指標。

綜上所述，梅尼埃病患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及相關細胞因子TGF-β、Foxp3、IL-10異常表達，且與病情進展程度關系密切，可能與患者體內免疫抑制減弱有關。由Treg細胞調控的細胞免疫異?？赡苁敲纺岚２〉陌l(fā)病機制之一，然目前關于CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞及其相關因子與梅尼埃病的研究報道較少，其參與調控的機制還需后期進一步的繼續(xù)探究分析。