寧思明 胡思雋 田苗苗 聶勇戰(zhàn)

腫瘤生物標志物是反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的一系列物質(zhì)，在臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測和預(yù)后評估。血液能夠較真實反映機體的生理和病理變化，是腫瘤生物標志物研究的主要樣本來源。與血液相比，尿液具有采集簡便、非侵入性以及免受體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制的影響，成分是更為簡單且穩(wěn)定的血液濾液。因此，通過研究尿液標本尋找腫瘤生物標志物是眾多研究者追求的目標。

隨著質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）檢測技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法的快速進步，基于MS 的高通量和高精度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)標志物在腫瘤的早期診斷和療效評估等方面發(fā)揮重要作用，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在尿液中尋找生物標志物的研究日益廣泛。在2016年蔡夢等[1]和趙青等[2]研究中，詳細闡述了部分腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白標志物，并進行了系統(tǒng)地分析總結(jié)，為尿液腫瘤標志物進一步的研究提供有價值的參考。本文綜述了近20年來通過MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)的尿蛋白標志物在常見腫瘤中的研究進展，并對尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究的優(yōu)劣勢和應(yīng)用前景進行分析。

1 基于MS 的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生物標志物發(fā)現(xiàn)中的研究進展

1.1 常用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

早期的蛋白質(zhì)組學(xué)主要應(yīng)用于定性分析，隨著研究的不斷深入，提供蛋白質(zhì)種類等定性信息的分析技術(shù)已經(jīng)不能滿足實際蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求，當今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點逐漸轉(zhuǎn)向定量分析。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)鑒定經(jīng)常使用的MS 技術(shù)包括雙向凝膠電泳質(zhì)譜（two-dimensional electrophoresis MS，2-DE-MS）、毛細管電泳質(zhì)譜（capillary electrophoresis MS，CE-MS）、表面增強激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption/ionization time-offlight MS，SELDI-TOF-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS，MALDI-TOF-MS）[3]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)主要基于雙向電泳（2-DE）和MS兩大類技術(shù)。隨著高精度MS 技術(shù)的快速發(fā)展，基于MS 的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)逐漸成為主要的分析手段。根據(jù)是否對目標蛋白進行定量，常用的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可分為非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)兩大類。

非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)是對樣品中所有蛋白進行無差別定量分析，根據(jù)是否對樣品中的蛋白質(zhì)或多肽進行標記，又分為非標記和標記定量技術(shù)。常用的非標記定量技術(shù)包括label-free 和基于數(shù)據(jù)非依賴采集（data-independent acquisition/sequential window acquisition of all theoretical mass spectra，DIA/SWATH）技術(shù)，標記定量技術(shù)主要為細胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標記（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，

SILAC）技術(shù)、同位素親和標簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）技術(shù)、同位素標記相對和絕對定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)、串聯(lián)質(zhì)量標簽（tandem mass tags，TMT）技術(shù)、二甲基化或18O 標記技術(shù)[4]。Label-free 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢在于成本低廉和樣品制備簡單，與標記定量相比，定量的準確性相對較差。Label-free 和標記定量技術(shù)均屬于數(shù)據(jù)依賴采集技術(shù)（data dependent analysis，DDA），盡管已廣泛用于復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的定性和定量分析，但DDA 一級掃描過程中總是偏向信號強的肽段進行裂解，因此容易造成感興趣的低豐度肽段的丟失。數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent analysis，DIA）技術(shù)利用高分辨MS 采集各區(qū)域范圍內(nèi)所有母離子的全部碎片離子信息，最后根據(jù)DDA參考譜圖庫對DIA 數(shù)據(jù)進行定性與定量分析。與DDA 技術(shù)相比，DIA 技術(shù)可對樣品中所有離子的碎片信息進行無偏向性的數(shù)據(jù)采集，具有定量準確度高、重復(fù)性好和可回溯性高等優(yōu)點[5]。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)能夠?qū)δ繕说鞍踪|(zhì)、目標肽段進行選擇性檢測，從而實現(xiàn)目標蛋白質(zhì)/多肽的相對/絕對定量。目前，主要有多重反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（multiple reaction monitoring，MRM）/選擇反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（selected reaction monitoring，SRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測技術(shù)（parallel reaction monitoring，PRM）。該技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)依賴商品化抗體質(zhì)量的蛋白驗證方法，如酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）和蛋白免疫印跡（Western blot）等，能夠同時對多個目標蛋白質(zhì)/肽段進行選擇性檢測分析。

非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)旨在發(fā)現(xiàn)并檢測樣品中更多的蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和生物標志物等，適合于生物標志物發(fā)現(xiàn)的早期研究階段。在非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)感興趣的特定蛋白質(zhì)或生物標志物之后，可進一步通過靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，在更多的樣本中驗證和研究這些蛋白質(zhì)。相比于非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)具有更高的準確性、靈敏度和重現(xiàn)性，可以有效彌補非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)重復(fù)性和分析效率低的缺點。根據(jù)不同的定量原理，任何一種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)均不可能是完美無缺的，應(yīng)根據(jù)實驗需求進行合適選擇。目前基于MS 的常用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的特點、優(yōu)勢及局限性進行匯總，見表1。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)用于生物標志物發(fā)現(xiàn)的研究策略

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，生物標志物的臨床前研究通常分為3 個階段：發(fā)現(xiàn)階段，驗證階段和確認階段。整個標志物研究階段通常呈現(xiàn)的特點為患者群體規(guī)模的增加和候選生物標志物數(shù)量的減少。生物標志物的發(fā)現(xiàn)階段主要目標是全面量化單個或混合樣本中的數(shù)千種蛋白質(zhì)。非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為一種適合對大量蛋白質(zhì)進行相對定量以尋找新的候選生物標志物的工具。發(fā)現(xiàn)階段主要生成候選生物標志物列表為后續(xù)階段分析建立至關(guān)重要的橋梁。生物標志物的驗證和確認階段通過擴大樣本數(shù)量和規(guī)模，驗證并確認發(fā)現(xiàn)階段最有潛力的候選蛋白生物標志物列表。該階段通過靶向蛋白定量方法來識別感興趣的蛋白質(zhì)或肽段。基于驗證和確認階段篩選出的候選標志物的優(yōu)先排序結(jié)果，在臨床驗證階段將選擇數(shù)量有限且有前景的潛在候選標志物進行進一步評估。

2 尿蛋白質(zhì)組學(xué)生物標志物的特征

2.1 尿蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標志物研究中的優(yōu)勢

蛋白質(zhì)組學(xué)常用的研究對象包括臨床組織樣本和生物體液如腦脊液、血液、尿液等。由于組織樣本和近源體液通常需要高侵入性手段獲得，因此非侵入性收集的尿液、唾液和汗液等體液逐漸引起研究者的關(guān)注。例如，唾液蛋白在口腔癌、肺癌等多種癌癥中的應(yīng)用[6]，汗液中的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白在囊性纖維化中的應(yīng)用等[7]。由于唾液蛋白具有易降解、易受飲食習(xí)慣等影響，汗液樣本量少、采樣困難等缺點，使其在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中受到較大限制。生物標志物是與疾病相關(guān)的可測量指標，由于血液與身體各部位息息相關(guān)，能夠較真實的反映人體微環(huán)境狀態(tài)。因此，血液一直是尋找生物標志物的最主要來源。但是血液樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析存在一定的缺點：血液取樣是侵入性的；血液含有20 種高豐度蛋白質(zhì)使低豐度蛋白質(zhì)的識別能力變差，這將掩蓋那些豐度較低但可能具有潛在意義的蛋白質(zhì)。相較血液而言，尿液在腫瘤分子標志物的發(fā)現(xiàn)方面具有采集簡單、無創(chuàng)，容易連續(xù)性獲得等優(yōu)點。尿蛋白質(zhì)組相較血液蛋白質(zhì)組復(fù)雜性更低，因此更易于檢測低豐度蛋白的變化[8]。另外，血液作為體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，受到人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機制的調(diào)節(jié)并盡可能保持機體穩(wěn)定，然而，在檢測過程中血液中微小的變化會被機體的穩(wěn)態(tài)機制逐漸消除，特別是當變化發(fā)生得相對較早且很小的時候，這使得很難發(fā)現(xiàn)血液中的變化[9]，而尿液收集全身的廢物，變化比血液更豐富，其被認為是早期和敏感生物標志物發(fā)現(xiàn)的最有吸引力的來源之一。

近年來，越來越多的研究表明，尿液在疾病早期的蛋白質(zhì)組學(xué)變化使其成為更好的生物標志物來源。如市面上的早孕試紙通過檢測尿液中的特異激素人絨毛膜促性腺激素來判斷是否懷孕，盡管這種檢測不能保證100%的準確率，但它具有快速、方便、靈敏、特異性高等優(yōu)點，已被廣泛用于早孕的初篩檢查。隨著尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的不斷深入，許多復(fù)雜疾病得到了廣泛的研究。2022年，Bi 等[10]通過TMT 定量技術(shù)，對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者組以及健康對照組的尿液和血清樣本進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)尿液中的蛋白分子量分布與全人類蛋白組的蛋白分子量分布一致。此外，該研究還表明尿液蛋白組顯示出比血液蛋白組更高的檢測靈敏度。

2.2 尿蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標志物研究中存在的問題

隨著MS 檢測技術(shù)和分析方法的快速發(fā)展，尿蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸趨于成熟。各種新型MS 技術(shù)的出現(xiàn)，使得尋找腫瘤生物標志物的困難程度大大降低。盡管尿蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標志物的發(fā)現(xiàn)中得到了廣泛的應(yīng)用，但到目前為止，很少有尿蛋白候選生物標志物被應(yīng)用于臨床中。因為有效生物標志物的發(fā)現(xiàn)受到許多因素的挑戰(zhàn)，綜合多個方面的專家建議和新技術(shù)的進展，其主要包括研究設(shè)計、樣本收集和準備、蛋白質(zhì)定量、儀器平臺和數(shù)據(jù)分析等因素影響[11]。研究設(shè)計包括患者選擇和嚴格的統(tǒng)計設(shè)計。樣本收集和準備包括尿液的采集和蛋白質(zhì)的提取。蛋白質(zhì)定量即不同蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)的選擇，包括發(fā)現(xiàn)生物標志物的非靶向定量技術(shù)或驗證候選生物標志物的靶向定量技術(shù)。儀器平臺和數(shù)據(jù)分析包括基于MS 平臺的選擇和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法的選擇等。

目前，大多數(shù)生物標志物的研究局限于患病群體和健康對照組之間的比較，由于尿液中潛在蛋白生物標志物的濃度非常低，尿液的特征與患者的性別、年齡、激素狀態(tài)、飲食或身體活動等差異密切相關(guān)。因此，在尿蛋白生物標志物研究中，假陽性的發(fā)現(xiàn)率很高。已有研究者提出對于尿液生物標志物的研究，轉(zhuǎn)化為臨床最接近的方法是對同一患者進行疾病標志物前后的比較。這樣，只要被比較的兩種狀態(tài)之間的生存方式無顯著變化，大多數(shù)混雜因素就可以被抵消掉。通過使用同一患者疾病前后對照樣本進行早期診斷標志物的篩選，并且可以收集健康人的尿液樣本作為未來的對照[9]。如在2020年進行的一項研究中，Wu 等[12]通過label-free 定量技術(shù)對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的術(shù)前和術(shù)后尿樣進行差異蛋白的分析。由于腫瘤患者術(shù)后引起的應(yīng)激反應(yīng)較大，延長患者術(shù)后樣本收集時間對試驗樣本策略來講，將會是一個更好的選擇，但同時也會增加樣本收集的難度。另外，由于各種實驗條件的限制，多數(shù)尿蛋白標志物的研究還不夠成熟，大部分蛋白質(zhì)組學(xué)研究均處于單中心研究階段，且缺乏在其他腫瘤患者尿液中的驗證研究，這樣很難建立高可信度和高特異性的疾病生物標志物。因此，這些潛在的腫瘤生物標志物應(yīng)用到臨床中還需要很長的路要走。

3 尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

癌癥的進展與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)，這些變化造成了正常細胞和癌細胞之間基因、蛋白質(zhì)和代謝物表達的一系列差異，其中一些變化可以在體液中被捕獲到來鑒定體內(nèi)的腫瘤狀態(tài)。體液中有意義的蛋白質(zhì)多為低豐度蛋白質(zhì)，隨著MS 技術(shù)的飛速發(fā)展，基于MS 的高通量、高靈敏及高深度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日漸成熟，為篩選和定量體液中的低豐度生物標志物提供了技術(shù)可能。如最新的超靈敏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)εR床復(fù)雜生物樣本中小于微克級的上萬個蛋白質(zhì)實現(xiàn)快速定量深度分析。另外，針對基于MS 的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在體液中篩選出的微量目標蛋白，已有多種操作簡單且快速的技術(shù)用于靶向蛋白的定量分析。如腫瘤標志物即時檢測（POCT）技術(shù)、基于特異性親和試劑的ELISA 法、新型的超高靈敏度單分子（Simoa）蛋白質(zhì)檢測技術(shù)等。尿液分子包括細胞內(nèi)成分、循環(huán)蛋白和抗體，通常與機體的各個部位接觸。因此，對腫瘤患者尿液成分的檢測可能有助于識別新的生物標志物和監(jiān)測疾病的進展。近年來，尿蛋白質(zhì)組學(xué)在各類腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)的研究中得到迅速發(fā)展，下面將對11 種常見腫瘤中已發(fā)現(xiàn)并初步驗證的尿蛋白生物標志物進行歸納總結(jié)。

3.1 泌尿系統(tǒng)腫瘤

膀胱癌（bladder cancer，BLCA）、腎癌（kidney cancer，RC）和前列腺癌（prostate cancer，PCa）是國際主要泌尿系統(tǒng)癌癥。由于泌尿系統(tǒng)與尿液直接接觸，且尿液中70%的蛋白質(zhì)由泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生。因此，尿液十分適用于泌尿系統(tǒng)腫瘤生物標志物的研究。目前，已被推廣于臨床應(yīng)用的尿蛋白腫瘤標志物多為泌尿系統(tǒng)癌癥。如美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的BLCA 尿液標志物核基質(zhì)蛋白22（NMP22）。

BLCA 目前檢測和監(jiān)測腫瘤進展以及復(fù)發(fā)的標準方法涉及尿細胞學(xué)、膀胱鏡和活檢檢查。盡管BLCA 尿液標志物如膀胱腫瘤抗原（BTA）和NMP22等已用于臨床尿樣檢測，但至今臨床應(yīng)用并不如細胞學(xué)檢查廣泛，主要原因可能存在許多干擾因素，如炎癥、血尿等會影響檢測結(jié)果。RC 的診斷以臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查為主，大多數(shù)患者確診時已到晚期。因此，RC 的早期篩選和診斷至關(guān)重要。PCa 目前篩查的手段主要包括前列腺特異性抗原（PSA）/前列腺特異性膜抗原（PSMA）血清水平的測量、直腸指診（DRE）和前列腺活檢。PSA 是PCa 檢測、隨訪和治療監(jiān)測中最重要的生物標志物，采用PSA 血清檢測可顯著降低PCa 的死亡率，但同時也導(dǎo)致了對惰性PCa 的過度診斷和治療。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見表2。提示其中BLCA 相關(guān)文獻報道，不同于以往疾病組和健康對照組的樣本策略，Li 等[13]利用iTRAQ標記定量技術(shù)對發(fā)現(xiàn)組中BLCA Ⅲ期患者的術(shù)前和術(shù)后尿樣進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，該研究通過驗證確認了一組具有代表性的候選生物標志物分子，其表達水平的改變與BLCA 患者的復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。因此，這些分子可能成為監(jiān)測和預(yù)測BLCA 的有用生物標志物。這種同一患者術(shù)前術(shù)后的樣本設(shè)計很大程度降低了尿液中混雜因素的影響。

表2 常見泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標志物

3.2 呼吸系統(tǒng)腫瘤

肺癌（lung cancer，LC）在國際上是男性中最常被診斷的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因之一。肺癌分為兩種類型：小細胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。目前用于LC 診斷的方法有胸部X 光、CT、PET、痰細胞學(xué)和支氣管鏡檢查等。但這些既耗時又昂貴并且存在受到輻射照射的危險。癌胚抗原（CEA）、鱗狀細胞癌抗原（SCC-Ag）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是檢測肺癌、監(jiān)測病情進展和疾病復(fù)發(fā)的常用血清標志物。然而，對于局限性腫瘤，上述標志物的診斷能力相對較差。事實上，多數(shù)LC 病例是在進展期或晚期發(fā)現(xiàn)的，因此增加了癌癥相關(guān)的死亡率。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在常見的呼吸系統(tǒng)腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見表3。其中Ma 等[20]通過DIA 定量蛋白質(zhì)組學(xué)MS 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者尿液中蘋果酸脫氫酶2（MDH2）含量顯著高于對照組，并通過ELISA 方法對1 091 例NSCLC患者和736 例健康對照組的尿液樣本進行驗證，該研究表明，與對照組相比，早期 NSCLC 患者的尿MDH2濃度更高，提示MDH2 可能作為早期檢測NSCLC 的潛在生物標志物。該項研究樣本量相對較大，增加了研究結(jié)果的可信度和說服力，但健康人群與NSCLC患者的人口學(xué)特征并不完全匹配，以及尿液中MDH2蛋白在NSCLC 中的特異性均需進一步的驗證和研究。

表3 常見呼吸系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標志物

3.3 乳腺及婦科腫瘤

乳腺癌（breast cancer，BC） 是女性中最常見的惡性腫瘤，目前診斷程序的第一步包括乳房檢查和影像學(xué)檢查。盡管目前檢測到早期BC 的病例數(shù)大幅增加，但篩查性乳房X 光檢查僅略微降低了晚期癌癥的檢出率，這種不平衡表明存在嚴重的過度診斷。在篩查試驗呈陽性結(jié)果的情況下，需要進行乳腺活檢，通過檢查細胞形態(tài)學(xué)來確認癌癥的存在。乳腺活檢是一種侵入性檢查，對患者來說具有一定的風(fēng)險。卵巢癌（ovarian cancer，OC）盡管在手術(shù)和免疫治療等方面取得了巨大進步，但OC 的5年總生存率僅為45%[24]。腫瘤抗原125（CA125）是OC 中應(yīng)用最廣泛的血清標志物，但缺乏足夠的診斷敏感度和特異性使其難以用于早期診斷。子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，ECa）的治療主要是手術(shù)治療。晚期或轉(zhuǎn)移性ECa 的患者預(yù)后較差，其5年生存率<20%，與早期患者>90%的5年生存率相比，復(fù)發(fā)的風(fēng)險更高[25]。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳腺癌及常見的婦科腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見表4。其中Ye 等[26]通過SELDI-TOF-MS 和ELISA 方法，對收集的128 例卵巢癌患者、118 例其他類型疾病患者和188 例健康對照組的尿液樣本進行分析驗證，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用來自嗜酸性粒細胞源性神經(jīng)毒素（EDN）和骨橋蛋白（OPN）的片段，對于早期OC 診斷的靈敏度和特異性分別達到72%和93%。該研究值得注意的是通過對健康對照組和不同類型疾病組進行了尿蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)卵巢癌特異的潛在生物標志物，這樣的實驗設(shè)計為癌癥的特異性研究提供了有價值的參考。

表4 乳腺及常見婦科腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標志物

表4 乳腺及常見婦科腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標志物 （續(xù)表4）

3.4 消化系統(tǒng)腫瘤

消化系統(tǒng)腫瘤是臨床上常見的惡性腫瘤，如肝癌（hepatic cancer，HCC）、結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）、胰腺癌（pancreatic cancer，PaC）、胃癌（gastric cancer，GC）等腫瘤，其發(fā)病率較高，盡管用于診斷的腫瘤標志物較多，但目前尚沒有特異性和靈敏度均較高的診斷方法。HCC 目前的診斷方法主要依賴于成像技術(shù)，但成本較高且耗時，不適用于早期肝癌的大規(guī)模篩查。盡管甲胎蛋白（AFP）、脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）和肝素結(jié)合細胞因子（MDK）等已被報道為HCC 特異的生物標志物，但由于實際檢測的敏感性和特異性較低，研究人員仍在努力尋找新的生物標志物。CRC 目前檢測的“金標準”是內(nèi)窺鏡檢查，但其具有高侵入性及潛在的并發(fā)癥等風(fēng)險。臨床數(shù)據(jù)顯示Ⅰ期CRC 患者的5年生存率為93%，而Ⅳ期僅為8%。因此，早期發(fā)現(xiàn)CRC 可顯著提高患者的生存率。雖然近年來一些CRC 生物標志物，如CEA，已經(jīng)應(yīng)用于當前的臨床診斷中，但其靈敏度和特異性相對較差。PaC 目前根治的唯一手段是外科手術(shù)。然而，僅有20%～25% 的患者在疾病切除有效的早期階段被診斷出來[32]。在目前的診斷方法中，通常將糖類抗原19-9（CA19-9）血清檢測作為PaC 的輔助檢測。然而，盡管CA19-9 的敏感性可達80%，但其特異性較低，不適用于可切除期PaC 的檢測。GC 的常見癥狀也見于胃良性疾病，由于不是癌癥特異性的，因此通常在進展期或晚期被確診出來，降低了治療的效果和患者存活的機會。然而，對于早期胃癌手術(shù)治療后5年生存率在90%以上，這突出了在高危人群中進行早期篩查的重要性。目前，臨床使用的胃腸道腫瘤血清學(xué)蛋白生物標志物，包括CEA、CA19-9 和癌抗原72-4（CA724），但由于其在GC 患者中的陽性率<40%，且在早期胃癌患者中低于20%，不足以用于GC 的早期診斷。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在常見的消化系統(tǒng)腫瘤生物標志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見表5。與傳統(tǒng)ELISA 和Western blot 驗證方法不同，Br?ker 等[33]利用非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的候選標志物，再通過靶向蛋白質(zhì)組學(xué)MRM 定量技術(shù)進行候選標志物的驗證，從而系統(tǒng)地對24 例直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者和25 例健康對照的尿液標本進行差異表達多肽篩選和進一步多肽組的驗證，發(fā)現(xiàn)兩個有潛力的多肽其敏感性和特異性分別為88% 和88%，很可能作為直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的無創(chuàng)檢測。該研究分別利用不同MS 技術(shù)的優(yōu)勢在發(fā)現(xiàn)組和驗證組進行標志物篩選和驗證研究，將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)合理應(yīng)用于不同實驗分析中，但試驗納入的樣本量較少，且亟需大量樣本進行后續(xù)驗證。

表5 常見消化系統(tǒng)癌癥中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標志物

表5 常見消化系統(tǒng)癌癥中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標志物 （續(xù)表5）

4 結(jié)語與展望

尿液本身具有非侵入性、收集簡單、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、種類多且不受機體穩(wěn)態(tài)機制調(diào)控等先天優(yōu)勢。目前，尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤標志物研究中需要解決的主要問題包括：擴大臨床驗證組的樣本量、促進臨床多中心合作和提高候選標志物在其他腫瘤中的驗證研究。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，基于MS 技術(shù)在尿液中尋找用于腫瘤早期診斷的生物標志物不僅僅局限于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，其研究對象和領(lǐng)域已涉及多種物質(zhì)，如氨基酸、激素、揮發(fā)性有機化合物[38]等。有研究系統(tǒng)對基于MS 技術(shù)在4 種高發(fā)癌癥常見標本中發(fā)現(xiàn)的腫瘤蛋白標志物進行了綜述，其中匯總的常見標本主要為血清和組織樣本，旨在闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制、開展精準的靶向治療，為實現(xiàn)腫瘤精準診療提供新的理論依據(jù)[39]。本文主要匯總了基于MS 技術(shù)在多種常見腫瘤尿液樣本中發(fā)現(xiàn)的蛋白標志物，旨在尋找疾病早期高靈敏度和高特異性的候選生物標志物，為腫瘤的早診早治提供更多的臨床依據(jù)。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)的不斷進步和尿中微量蛋白檢測靈敏度及穩(wěn)定性的不斷提高，尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤標志物的研究已經(jīng)取得了很大進步。由于任何一種尿液腫瘤標志物的研究都有其局限性，在臨床應(yīng)用中應(yīng)當采用單一生物標志物（或生物標志物組）或與臨床檢測相結(jié)合等手段聯(lián)合分析。此外，伴隨日新月異的基因檢測新技術(shù)的涌現(xiàn)和成熟，結(jié)合血清腫瘤標志物、基因標志物和尿蛋白質(zhì)標志物的聯(lián)合診斷，期待高靈敏度、高特異性且便捷的腫瘤生物標志物技術(shù)被更好地應(yīng)用于臨床，受益于腫瘤患者。