郝麗娜，郝麗莎

1.成都青羊菲爾醫(yī)療美容診所，四川成都 610000；

2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000

黃褐斑是一種色素沉著疾病，常見于女性，邊界清楚，皮損呈淡褐色或深褐色，對稱分布于面部，影響面部美觀[1]。近年來研究表明，紫外線暴露、遺傳易感性、性激素水平異常與黃褐斑的發(fā)病高度相關(guān)[2]，但具體發(fā)病機制尚不明確，可能還有其他致病因素參與[3]。臨床治療黃褐斑的方法很多，但總體療效不理想。中醫(yī)學(xué)認為肝脾腎三臟與黃褐斑關(guān)系密切，其病因在于肝郁、脾濕、腎虛，病機在于氣機不暢、氣血瘀滯、顏面失養(yǎng)。其中“瘀”是黃褐斑發(fā)生的重要因素，治療中應(yīng)以活血化瘀為治療基礎(chǔ)，兼顧其他致病之因進行治療[4-5]。丹參作為活血化瘀、涼血消癰的傳統(tǒng)中藥，具有改善微循環(huán)、擴張血管、抗炎等多種功效[6]。陳之堯等[7]應(yīng)用1 565 nm非剝脫點陣激光聯(lián)合丹參注射液行皮內(nèi)注射治療黃褐斑患者63例，治療中起效較快，臨床改善明顯。李桂玲等[8]應(yīng)用丹參等具有活血化瘀、祛斑散結(jié)的自制中藥按摩膏和面膜治療黃褐斑20例，治療效果顯著，總有效率達70%。目前雖有大量的單味中藥或復(fù)方中藥治療黃褐斑的研究，但多為經(jīng)驗的總結(jié)，缺乏發(fā)病和治療機制上的探討。因此，本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)探討丹參治療黃褐斑的潛在分子機制，為臨床治療以及丹參藥物的研發(fā)提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 丹參活性成分及靶點篩選利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/)[9]檢索丹參的有效成分，并對有效成分相關(guān)靶點進行預(yù)測。設(shè)置藥動學(xué)篩選條件：口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[10]，對丹參成分進行初篩，獲得活性化合物以及對應(yīng)的靶標蛋白。應(yīng)用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt(http://www.uniprot.org/uploadlists/)將其轉(zhuǎn)換為統(tǒng)一基因名稱。

1.2 黃褐斑靶點篩選利用GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和DisGeNet(https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫收集黃褐斑靶點。合并疾病數(shù)據(jù)庫靶點，在UniProt數(shù)據(jù)庫中校正基因信息，經(jīng)過檢索和校對去重后確定黃褐斑的潛在靶點。

1.3 交集靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為明確丹參靶點與黃褐斑潛在靶點間的相互作用，利用Venny2.1.0網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)將兩者靶點取交集，獲得丹參治療黃褐斑的靶點。將丹參治療黃褐斑靶點提交至STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，限定種屬為homo sapiens，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。運用CytoScape 3.8.2分析PPI網(wǎng)絡(luò)，利用CytoHubba篩選得到排名前4的關(guān)鍵靶點。

1.4 功能與通路的富集分析利用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線分析數(shù)據(jù)庫，對丹參治療黃褐斑的靶點進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)及基因本體(GO)富集分析。將富集結(jié)果利用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)在線工具可視化，制作GO分析結(jié)果柱狀圖和KEGG通路氣泡圖。

1.5 丹參成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建將丹參活性成分、治療黃褐斑的靶點、GO富集以及KEGG富集信號通路導(dǎo)入CytoScape3.8.2網(wǎng)絡(luò)作圖軟件，構(gòu)建丹參成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)。其中丹參活性成分、靶點、信號通路在網(wǎng)絡(luò)中以節(jié)點(node)表示；各節(jié)點之間的相互關(guān)系以邊(edge)表征。

1.6 丹參治療黃褐斑關(guān)鍵靶點的分子對接驗證運用分子對接技術(shù)模擬化合物與靶點的相互作用，對結(jié)合模式和結(jié)合能力進行預(yù)測。從RCSB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中下載PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，選擇物種為“homo sapiens”，實驗方法為“X-RAY DIFFRACTION”，高分子實體類型為“Protein”，選擇較低分辨率的蛋白晶體作為對接的模板。從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org/)中下載篩選出的丹參有效成分3D結(jié)構(gòu)的mol2格式文件。用PyMOL軟件移除靶點蛋白中的配體和水分子，保存為pdb格式文件。用AutoDock Tools1.5.6軟件對靶點蛋白進行加氫以及電荷計算，對丹參有效成分進行配體設(shè)置的預(yù)處理，所有配體和受體文件均保存為pdbqt格式。運用AutoDock Vina軟件對篩選出的主要靶點進行分子對接，評估和驗證化合物-靶標關(guān)系的結(jié)合親和力，以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果。使用PyMOL軟件對結(jié)果進行可視化，顯示蛋白質(zhì)和小分子的3D結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)殘基和結(jié)合鍵。

2 結(jié)果

2.1 丹參活性成分及靶點通過TCMSP獲得丹參化學(xué)成分及對應(yīng)的靶標蛋白，并運用UniProt數(shù)據(jù)庫將得到的靶標蛋白轉(zhuǎn)換為基因名。剔除無對應(yīng)的靶基因信息后，得到58個潛在的活性成分(表1)，進一步篩選得到其對應(yīng)的105個可能靶點。

表1 丹參主要活性成分

2.2黃褐斑靶點從GeneCards數(shù)據(jù)庫獲得黃褐斑靶點34個。從DisGeNet數(shù)據(jù)庫中以“chloasma”為關(guān)鍵詞獲得黃褐斑靶點31個。合并所有黃褐斑靶點后刪除重復(fù)值，在UniProt數(shù)據(jù)庫校正疾病基因名，最終獲得51個黃褐斑靶點。

2.3 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)將篩選的丹參成分靶點與黃褐斑靶點取交集，通過Venny2.1.0網(wǎng)站繪制韋恩圖，得到丹參成分-黃褐斑共同靶點7個，分別為血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、雌激素受體2(ESR2)、孕酮受體(PGR)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶2(NOS2)、酪氨酸酶(TYR)，見圖1A。將靶點提交至STRING平臺，選擇物種為“homo sapiens”，獲得交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)互作圖(圖1B)。應(yīng)用CytoScape 3.8.2軟件中的Cyto-Hubba插件得到按照MCC(Maximal Clique Centrality)分析法，獲得排名前4的關(guān)鍵基因(圖1C)，依次為VEGFA、PTGS2、ESR1、PGR，圖中度值越大，則節(jié)點就越大，表示該節(jié)點越重要。

圖1 丹參治療黃褐斑靶點PPI分析

2.4 靶點功能與通路的富集分析將丹參治療黃褐斑的靶點信息導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫進行GO、KEGG富集分析。設(shè)定閾值P＜0.05。獲得GO注釋條目37個，其中包括19個生物過程(biological processes，BP)、2種細胞組分(cell composition，CC)和16種分子功能(molecular function，MF)。按照P值升序排列，繪制GO條目柱狀圖(圖2A)。生物過程富集結(jié)果表明基因表達的負調(diào)控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、血管生成、細胞遷移的正調(diào)控、乳腺小泡發(fā)育、對維生素D的反應(yīng)、細胞內(nèi)雌激素受體信號通路、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、氧化還原過程、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、對雌二醇的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的負調(diào)控、缺氧反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程均在丹參治療黃褐斑過程中發(fā)揮著重要作用。核心靶點大多位于細胞核和細胞質(zhì)。KEGG通路富集分析得到7條信號通路并繪制氣泡圖(圖2B)，結(jié)果顯示丹參可作用于癌癥的途徑、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、催乳素信號通路、HIF-1信號通路、雌激素信號通路、小細胞肺癌、利什曼病。

圖2 交集靶點GO及KEGG分析結(jié)果

2.5 藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)以上述得到的丹參有效成分、交集靶基因、GO和KEGG富集通路為基礎(chǔ)，利用CytoScape3.8.2網(wǎng)絡(luò)作圖軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)(圖3)。

圖3 丹參治療黃褐斑的藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

2.6 分子對接結(jié)果分析基于PPI互作網(wǎng)絡(luò)以及有關(guān)文獻報道[11]，選取與黃褐斑相關(guān)經(jīng)典靶點蛋白4個[血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、前列腺素G/H合酶2(PTGS2)、雌激素受體1(ESR1)、酪氨酸酶(TYR)]進行分子對接(圖4～圖6)。受體蛋白與活性成分結(jié)合所需的能量越少，結(jié)合越穩(wěn)定。本次結(jié)果表明，參與分子對接的打分值均為負數(shù)(表2)，最低結(jié)合能均小于-5 kal/mol，活性成分分子與靶點受體蛋白周圍分子可通過氫鍵等分子間作用力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象，表明丹參主要活性成分與黃褐斑相關(guān)靶點生物親和力高，具有良好的活性。

表2 丹參活性成分與靶點蛋白間的最低結(jié)合能

圖4 木樨草素(luteolin)與靶點蛋白對接

圖5 丹參酮ⅡA(tanshinoneⅡa)與靶點蛋白對接

圖6 隱丹參酮(cryptotanshinone)與靶點蛋白對接

3 討論

中醫(yī)認為，血瘀是黃褐斑形成的重要因素，臨床應(yīng)當確立在活血化瘀的基礎(chǔ)上，兼顧其他致病之因進行治療[4]。丹參是多年生草本植物，以根入藥，具有活血化瘀、祛瘀生新等功效[12]。有研究表明，采用丹參治療黃褐斑效果明顯、治療安全，有利于減輕皮膚氧化應(yīng)激情況[7，13]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，對丹參治療黃褐斑的作用機制進行分子層面的探討。

本次采用TCMSP獲得丹參化學(xué)成分及對應(yīng)的靶標蛋白，剔除無對應(yīng)的靶基因信息后，得到58個潛在的活性成分，主要為丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱa、隱丹參酮、木犀草素等。丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮均屬于丹參酮類化合物，具有抑制炎癥細胞增殖、清除氧自由基、植物雌激素樣作用等[14]。有研究顯示，植物雌激素在體內(nèi)可產(chǎn)生雙向調(diào)節(jié)作用，其調(diào)節(jié)方向與機體內(nèi)源性雌激素狀態(tài)以及雌激素受體的數(shù)量和類型相關(guān)[15-18]。在體內(nèi)雌激素水平較低時有擬雌激素作用；當體內(nèi)雌激素水平較高時有抗雌激素作用[19]。JIAN等[20]和KIM等[21]研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可通過結(jié)合黑素細胞上雌激素受體誘導(dǎo)黑素生成相關(guān)酶合成，進而促進黑色素生成。此過程可能通過cAMP-PKA途徑，增強cAMP水平，上調(diào)環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)和酪氨酸酶家族蛋白的表達來實現(xiàn)[22]。JANG等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，女性在妊娠期以及口服避孕藥后，黃褐斑的發(fā)病率會明顯升高，而且，在黃褐斑皮損真皮處，雌激素受體-β的表達也增高。以上結(jié)果表明，黃褐斑的發(fā)病機制與體內(nèi)較高雌性激素水平及其雌激素受體信號通路密切相關(guān)[11]。本次研究也顯示，丹參中的丹參酮、丹參新醌、原紫草酸、異隱丹參酮等多種化合物可與黃褐斑的ESR1、ESR2、PGR等核心靶點相結(jié)合，作用于細胞內(nèi)雌激素信號通路、催乳素信號通路，并參與類固醇激素介導(dǎo)以及對雌二醇反應(yīng)等生物過程。這提示，在較高雌性激素水平的人體內(nèi)，丹參可能作用于ESR1、ESR2等核心靶點發(fā)揮抗雌激素樣作用，進而干擾黃褐斑的生成代謝。

酪氨酸酶是黑色素的關(guān)鍵限速酶，其大量生成易導(dǎo)致黃褐斑發(fā)生[23-24]。丹參藥物中的活性成分木犀草素是一種黃酮類化合物，具有多種藥理活性，如消炎、抗過敏、降尿酸、抗腫瘤等[12]。楊城等[25]研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素能非競爭性抑制酪氨酸酶，作用位點位于酪氨酸酶疏水口袋邊緣，相互作用力包括疏水作用力與氫鍵。劉華等[26]研究也表明，木犀草素能快速與酪氨酸酶發(fā)生作用并迅速降低酶的活性，通過顯著增強酪氨酸酶的表面疏水性，誘導(dǎo)酪氨酸酶構(gòu)象伸展和解折疊，使酶結(jié)構(gòu)變化不利于形成活性中心，進而降低酪氨酸酶活力。本次PPI網(wǎng)絡(luò)和GO富集分析顯示，黃褐斑的核心靶點TYR主要位于細胞核和細胞質(zhì)，可通過VEGFA與ESR1、ESR2等其他核心靶點相互作用，共同參與氧化還原過程、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、缺氧反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物過程。分子對接顯示，木犀草素與TYR可形成穩(wěn)固結(jié)合，最低結(jié)合能為-7.1 kal/mol。以上提示，丹參可能通過抑制酪氨酸酶干擾黑色素的生成，進而治療黃褐斑。

環(huán)氧合酶-2(COX-2)可由前列腺素G/H合酶2(PTGS2)基因轉(zhuǎn)錄生成，正常情況下，COX-2在多數(shù)組織或細胞中不表達或低表達，在受紫外線、脂多糖(LPS)、白細胞介素-l(IL-l)、腫瘤壞死因子(TNF)等多種細胞內(nèi)外因素刺激后可高水平表達[27]。研究發(fā)現(xiàn)，在黃褐斑皮損處，IL-17、COX-2等炎癥因子較周圍皮膚明顯升高，黃褐斑面積及嚴重程度評分與COX-2呈正相關(guān)[28-29]。周凌等[30]研究表明，紫外線可誘導(dǎo)人表皮黑素細 胞 中Cox-2表 達 上 調(diào)，激 活Cox-2/Akt/GSK3β/β-Catenin信號通路，促使β-Catenin向核內(nèi)轉(zhuǎn)移，增加黑素細胞黑色素生成?；堇さ萚31]研究也認為，COX-2不僅能影響黑色素的生成，還能調(diào)控黑素細胞中樹突的形成及延長，影響黑色素的轉(zhuǎn)運和沉著[32]。這提示，黃褐斑的形成與COX-2密切相關(guān)，抑制COX-2的表達可能成為治療黃褐斑的新途徑。研究表明，丹參酮ⅡA可降低內(nèi)皮細胞COX-2 mRNA和蛋白的表達，其機制可能與抑制p38MAPK、NF-κB的磷酸化有關(guān)[33]。趙俊云等[34]研究也顯示，丹參酮ⅡA可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB、激活蛋白-1的活性，進而抑制環(huán)氧合酶-2的表達，從而抑制乳腺癌細胞的增殖。本次研究表明，丹參中的大部分化合物木犀草素、丹參酮、丹參醇等均能與PTGS2靶點相互作用，主要富集于癌癥途徑、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、小細胞肺癌、利什曼病等信號通路，參與血管生成、一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、細胞對缺氧反應(yīng)以及對雌二醇反應(yīng)等生物過程。以上提示，丹參可能通過多種信號通路共同調(diào)節(jié)COX-2的表達，進而干擾黑色素的生成，影響黃褐斑代謝。

VEGF是血管生成的主要介質(zhì)，可促進血管生成，誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞遷移、增殖和侵襲[35-37]。其家族成員有：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、內(nèi)分泌腺源性VEGF和胎盤生長因子等[38]。其中，VEGF-A在促進血管生成以及腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮主導(dǎo)作用[39]。KWON等[40]研究發(fā)現(xiàn)，黃褐斑皮損處的血管數(shù)目、血管大小以及血管密度均大于病變周圍皮膚，VEGF、干細胞因子(SCF)等影響血管生成的細胞因子水平明顯升高。本次PPI網(wǎng)絡(luò)分析也顯示，丹參治療黃褐斑的核心靶點中，VEGFA靶點度值大，顏色紅，與其他靶點之間作用關(guān)系強。KEGG和GO富集結(jié)果顯示，VEGFA主要富集于血管內(nèi)皮生長因子信號通路、癌癥途徑和HIF-1信號通路，參與血管生成、細胞對缺氧反應(yīng)等生物過程。這提示，VEGFA可能與黃褐斑的形成過程關(guān)系密切。有研究表明，木犀草素能降低VEGF表達，抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路，進而抑制A375和B16F10細胞的增殖和侵襲能力，誘導(dǎo)細胞凋亡[41]。張曦倩等[42]研究也顯示，木犀草素能有效減少大鼠卵巢中VEGF、VEGFR-2、IL-6的表達，可有效抑制OHSS大鼠卵巢組織的炎癥反應(yīng)及血管通透性。本次分子對接表明，丹參中的木犀草素化合物可與VEGFA形成穩(wěn)固結(jié)合，最低結(jié)合能為-7.7 kal/mol。以上提示，丹參可能通過VEGFA靶點，作用于血管內(nèi)皮生長因子信號通路和HIF-1信號通路，進而影響黃褐斑的生成。

本次分子對接結(jié)果顯示，丹參活性成分木犀草素、丹參酮ⅡA、隱丹參酮與核心靶點蛋白VEGFA、PTGS2、ESR1、TYR對接良好，構(gòu)象穩(wěn)定，最低結(jié)合能均小于-5 kal/mol，從而驗證了本研究的結(jié)果。

綜上所述，本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)，對丹參活性成分、作用靶點、生物過程以及相關(guān)通路進行分析，發(fā)現(xiàn)丹參治療黃褐斑具有多成分、多靶點、多途徑相互作用的特點，其主要成分及關(guān)鍵靶點可能通過抗雌激素作用、抗炎、抗血管生成、抗酪氨酸酶等方面治療黃褐斑，其分子機制涉及血管內(nèi)皮生長因子信號通路、細胞內(nèi)雌激素信號通路、催乳素信號通路、HIF-1信號傳導(dǎo)通路等。這些結(jié)果提示，丹參有望成為治療黃褐斑的臨床藥物，但因網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法的局限性，后期仍需要進一步的實驗驗證。