吳曉青，任何，呂玉平，趙曉燕，周紅姿，張新建，楊合同

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103；2.山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400；3.中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 201602)

草酸(oxalic acid，OA)是簡單的有機(jī)二元酸，核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)等病原菌在侵染植物過程中分泌的外源草酸(相對(duì)于植物細(xì)胞內(nèi)源草酸而言)不僅是非特異性植物毒素，還能通過降低侵染環(huán)境的pH值，一方面誘導(dǎo)自身細(xì)胞壁降解酶(聚半乳糖醛酸酶、天冬氨酸蛋白酶、漆酶等)活性提高，另一方面抑制植物保護(hù)酶的活性，連同抑制植物氧爆作用、調(diào)節(jié)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞關(guān)閉、誘導(dǎo)植物細(xì)胞程序性死亡等參與到侵染機(jī)制中[1，2]。盾殼霉(Coniothyrium minitans)、木霉(Trichoderma)等生防功能菌在拮抗核盤菌、灰霉菌時(shí)會(huì)通過產(chǎn)生草酸脫羧酶(oxalate decarboxylase，OXDC)消除外源草酸的作用，從而阻止病原菌對(duì)植物的侵染[3－6]。但一定濃度的外源草酸又是有效的化學(xué)誘抗劑，能顯著提高植物對(duì)病原菌的系統(tǒng)抗性[7，8]。因此，明確外源草酸的毒性作用和誘抗作用濃度對(duì)合理利用外源草酸具有重要意義。

前期工作中，我們已對(duì)一株防治黃瓜灰霉病的非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)LTR－2降解草酸的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究，本研究在此基礎(chǔ)上，分析了不同濃度草酸浸根及接種木霉對(duì)黃瓜幼苗的毒害程度和葉片中4種抗性酶(兩種抗氧化酶和兩種抗病相關(guān)酶)活性的影響，以期進(jìn)一步了解木霉在黃瓜幼苗抗性系統(tǒng)響應(yīng)外源草酸脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為非洲哈茨木霉LTR－2，由山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離自土壤并保藏。“津研四號(hào)”黃瓜(Cucumis sativusL.)種子，購自天津市津科力豐種苗有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃瓜育苗及取樣 2020年4月，在無菌條件下將黃瓜種子先后浸入75%乙醇和次氯酸鈉溶液(有效氯含量2%)中表面消毒30 s和15 min，無菌水沖洗2~3次，轉(zhuǎn)移至濕潤的濾紙上，于25℃暗培養(yǎng)2 d，待胚根伸長至1~2 cm時(shí)移入折疊式育苗缽中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，在光照25℃12 h、黑暗18℃12 h培養(yǎng)。育苗基質(zhì)為普通園藝基質(zhì)，購自濟(jì)南魯青種苗有限公司，使用前經(jīng)121℃、103 kPa滅菌2次，每次1 h，間隔24 h。待幼苗長出3~4片真葉時(shí)，翻轉(zhuǎn)折疊式育苗缽取出完整植株，用無菌水淋洗去除根部附著的育苗基質(zhì)。

1.2.2 木霉發(fā)酵及草酸處理方法 無菌條件下，將活化的0.5 cm木霉菌塊接入PDA(potato dextrose agar，BD，USA)平皿中央，在25℃、光照12 h、黑暗12 h條件下培養(yǎng)7 d；用接種環(huán)輕輕刮取分生孢子層，混入無菌水中，滅菌脫脂棉過濾制成孢子懸濁液，利用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL，備用。將100 mL PDB(potato dextrose broth，BD，USA)分裝于500 mL三角瓶中，于115℃、90 kPa滅菌25 min。配制0.5 mol/L草酸(分析純)母液，通過0.22μm無菌聚醚砜濾膜過濾除菌，在PDB中添加不同比例的草酸母液使草酸終濃度分別為0、10、20、30、50、80 mmol/L。將100μL上述木霉分生孢子懸濁液接種至含不同濃度草酸的100 mL PDB中。以無菌蒸餾水處理、空白PDB培養(yǎng)基處理、接種木霉的PDB發(fā)酵濾液處理為對(duì)照。所有處理的培養(yǎng)液均在160 r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)5 d。為了方便描述，將處理組和對(duì)照組進(jìn)行編號(hào)，如表1所示。

表1 處理及編號(hào)

1.2.3 浸根法處理黃瓜幼苗 將各處理的木霉發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心和0.22μm聚醚砜濾膜抽濾徹底去除菌體，濾清后的處理液轉(zhuǎn)移至滅菌的500 mL燒杯中，同時(shí)取出10 mL處理液用pH計(jì)測定pH值。從育苗缽中小心取出完整苗體，用清水洗凈根系，用打孔的PVC板將黃瓜幼苗固定在處理液上方，使根系下端浸于處理液中。每瓶插入2棵黃瓜幼苗，每處理設(shè)6瓶重復(fù)。在25℃條件下放置24 h，拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

草酸毒害程度的統(tǒng)計(jì)方法:中毒嚴(yán)重度分為4個(gè)級(jí)別，0級(jí)為所有葉片挺闊，根莖飽滿；1級(jí)有1~2片真葉輕度萎蔫，根莖挺拔；2級(jí)有2~3片真葉萎蔫，根莖軟化；3級(jí)有3片及以上真葉萎蔫，根莖下部失綠萎縮；4級(jí)為整體植株萎蔫，根莖整體萎縮嚴(yán)重。每個(gè)處理重復(fù)3次。參考病情指數(shù)的計(jì)算方法計(jì)算中毒指數(shù)，具體公式為:中毒指數(shù)＝(N0×0＋N1×1＋N2×2＋N3×3＋N4×4)/每處理總苗數(shù)，其中N0、N1、N2、N3和N4分別為各級(jí)別的黃瓜幼苗數(shù)。以每瓶的兩棵幼苗為一個(gè)重復(fù)，采集葉片，每個(gè)處理重復(fù)3次，用液氮速凍后研磨成細(xì)粉，待測酶活。

1.2.4 酶活性測定 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)活性分別采用蘇州科銘的PAL、SOD、CAT、PPO試劑盒(微量法)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，用SPSS 22.0進(jìn)行Duncan’s多重檢驗(yàn)，使用Origin 8.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉處理降低外源草酸對(duì)黃瓜幼苗的脅迫

黃瓜幼苗在各處理?xiàng)l件下處理24 h后呈現(xiàn)出不同程度的生長狀態(tài)(圖1)。無菌水處理(H2O)的黃瓜幼苗葉片挺闊、根莖茁壯飽滿(圖1 A)；PDB培養(yǎng)基處理(PD)后，葉片邊緣出現(xiàn)輕度脫水現(xiàn)象、根莖挺拔(圖1 C)；木霉發(fā)酵液處理(T)后，黃瓜幼苗狀態(tài)與PD處理的相似(圖1 D)。10 mmol/L草酸處理(OA10)的黃瓜葉片出現(xiàn)萎蔫，根莖輕微脫水但未見明顯萎縮(圖1 E)；同草酸濃度的木霉處理(T＋OA10)后，幼苗葉片萎蔫程度降低、根莖恢復(fù)挺拔(圖1 F)。20 mmol/L草酸處理(OA20)對(duì)黃瓜幼苗的脅迫作用明顯，葉片全部萎蔫，根莖出現(xiàn)萎縮失綠及軟化現(xiàn)象(圖1 G)；同草酸濃度的木霉處理(T＋OA20)有效緩解了葉片的萎蔫狀況，根莖輕度萎縮，少有失綠軟化現(xiàn)象(圖1 H)。當(dāng)草酸濃度達(dá)到30 mmol/L(OA30)時(shí)，植株整體嚴(yán)重萎蔫，根莖部變白軟化(圖1 I)；同草酸濃度的木霉處理(T＋OA30)則可改善部分生長較粗壯植株受脅迫的狀況(圖1 J)。當(dāng)草酸濃度提高至50、80 mmol/L時(shí)，幼苗萎蔫情況愈加嚴(yán)重，木霉處理也無明顯緩解作用。

圖1 不同處理黃瓜幼苗的表型

利用中毒指數(shù)對(duì)脅迫程度進(jìn)行量化，結(jié)果表明，10~30 mmol/L草酸對(duì)黃瓜幼苗均有不同程度的毒害作用，而木霉處理顯著緩解了草酸對(duì)黃瓜的脅迫，10、20、30 mmol/L草酸處理下，接種木霉后的幼苗中毒指數(shù)分別降低50.00%、41.18%、22.22%(圖2)。

圖2 不同處理黃瓜幼苗的中毒指數(shù)分布

2.2 木霉緩解草酸處理對(duì)黃瓜PAL活性的影響

結(jié)果(圖3)表明，H2O處理的PAL活性為(28.91±2.32)U/mgFW，PD、T處理后的PAL活性分別為(31.80±0.67)(17.04±4.04)U/mgFW，三者間差異不顯著。與PD處理相比，不同濃度草酸處理均使PAL活性顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)為OA80>OA30>OA50>OA20>OA10；不同草酸濃度下接種木霉后，幼苗中的PAL活性也均高于PD處理，表現(xiàn)為T＋OA30>T＋OA50>T＋OA80>T＋OA20>T＋OA10，除T＋OA10、T＋OA20處理外差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。相同草酸濃度下，接種木霉處理的PAL活性顯著低于未接種的?？梢?，各草酸濃度下接種木霉均抑制了黃瓜幼苗PAL活性的升高。

圖3 不同處理黃瓜幼苗葉片的PAL活性

2.3 木霉緩解草酸處理對(duì)黃瓜PPO活性的影響

結(jié)果(圖4)顯示，PD、T處理后PPO活性分別為(33.66±1.10)(38.10±1.10)U/gFW，兩者間差異顯著，但均與H2O處理[(37.29±0.80)U/gFW)]無顯著差異。與PD處理相比，草酸處理后黃瓜幼苗葉片中的PPO活性均顯著提高(P<0.05)，表現(xiàn)為OA20>OA30>OA80>OA10>OA50；不同草酸濃度下接種木霉后，PPO活性也均升高，表現(xiàn)為T＋OA30>T＋OA50>T＋OA20>T＋OA80>T＋OA10，除T＋OA10處理外均顯著高于H2O、PD、T處理(P<0.05)。相同草酸濃度下，與不接種木霉處理相比，接種木霉的T＋OA30和T＋OA50處理顯著提高黃瓜幼苗葉片中的PPO活性，而其余接種木霉處理均顯著降低PPO活性。可見，接種木霉對(duì)PPO活性的提升作用在30、50 mmol/L草酸處理下最明顯，草酸濃度過低或過高都不能發(fā)揮其對(duì)PPO活性的提升作用。

圖4 不同處理黃瓜幼苗葉片的PPO活性

2.4 木霉緩釋草酸處理對(duì)黃瓜CAT活性的影響

結(jié)果(圖5)顯示，H2O處理的CAT活性為(2 374.39±466.04)nmol/(min?mL)，PD、T處理后活性分別為(2 985.38±528.45)(1 343.62±348.17)nmol/(min?mL)，其中T處理的CAT活性最低，顯著低于H2O和PD處理(P<0.05)，僅為PD處理的45.01%。相比于PD處理，不同濃度草酸處理的CAT活性表現(xiàn)為OA80>OA20>OA30>OA10>OA50，其中，OA20和OA80處理顯著高于PD處理(P<0.05)，其余濃度草酸處理與PD處理無顯著差異；不同草酸濃度下接種木霉后，黃瓜幼苗葉片中的CAT活性均降低，表現(xiàn)為T＋OA50>T＋OA10>T＋OA20>T＋OA30>T＋OA80，其中，T＋OA10和T＋OA50處理與PD處理差異不顯著，但顯著高于T處理(P<0.05)，其余處理均顯著低于PD處理，與T處理差異不顯著。相同草酸濃度下，整體來說接種木霉處理的CAT活性低于不接種木霉的，尤其當(dāng)草酸濃度為20、30、80 mmol/L時(shí)，接種木霉顯著抑制了黃瓜幼苗葉片中的CAT活性。

圖5 不同處理黃瓜幼苗葉片的CAT活性

2.5 木霉緩解草酸處理對(duì)黃瓜SOD活性的影響

結(jié)果(圖6)顯示，PD處理黃瓜幼苗葉片中的SOD活性最高，為(7 771.16±846.55)U/gFW，與H2O處理[(7 754.36±374.00)U/gFW]差異不顯著；T處理的SOD活性[(3 755.00±1124.93)U/gFW]顯著低于兩者(P<0.05)，僅為PD處理的48.32%。相比于PD處理，各濃度草酸處理均降低幼苗葉片中的SOD活性，接種木霉菌后降低效果更明顯，除OA20處理外差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)；隨草酸濃度的升高，不接種木霉時(shí)SOD活性先升高后降低，OA20處理的最高，而接種木霉后SOD活性逐漸降低。相同草酸濃度下，相比于不接種木霉，接種木霉降低葉片中的SOD活性，草酸濃度為20 mmol/L時(shí)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，其余濃度下差異不顯著。

圖6 不同處理黃瓜幼苗葉片的SOD活性

3 討論與結(jié)論

一定濃度的外源草酸對(duì)于植物是非專化性毒素，如用濃度為8 mmol/L以上的草酸浸根處理3 d或10 mmol/L以上的草酸處理葉片24 h均可使油菜產(chǎn)生中毒癥狀，主要表現(xiàn)為葉片黃褐腐化和根莖脫水萎縮，處理濃度越高、時(shí)間越長，受害程度越重[6，9]。黃瓜含水量高，根際含水量達(dá)80%~90%，對(duì)溶液中毒性脅迫因子更為敏感[10]，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，用10~80 mmol/L草酸浸根處理黃瓜幼苗24 h后表現(xiàn)出與無菌水和PDB培養(yǎng)基對(duì)照處理差異顯著的發(fā)育形態(tài)，表明黃瓜幼苗耐草酸脅迫的能力較差；接種木霉可在一定程度上緩解10~30 mmol/L外源草酸對(duì)黃瓜幼苗的脅迫作用，使幼苗的中毒指數(shù)降低22.22%~50.00%，但對(duì)50~80 mmol/L外源草酸的脅迫作用無明顯緩解。前期研究表明，在草酸濃度低于20 mmol/L的培養(yǎng)液中接種木霉并培養(yǎng)5 d，草酸可完全被降解，降解率達(dá)100%；而當(dāng)草酸濃度為30 mmol/L時(shí)，降解率大幅降低至不到20%；當(dāng)草酸濃度繼續(xù)升高后，木霉自身生長也被顯著抑制，對(duì)草酸的降解作用就更加微弱[11]。

PAL與植物抗毒素及酚類化合物的形成密切相關(guān)，雖不能直接抵御病蟲害，但可通過苯丙烷類途徑進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物以增強(qiáng)植物的抗病性[12]。PPO是植物體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶，分為單酚單氧化酶(tyrosinase)、雙酚氧化酶(catechol oxidase)和漆酶(laccase)，其活性與植物抗病有關(guān)，能參與植物的次生代謝，產(chǎn)生一些毒性物質(zhì)，直接毒殺病原菌[13]。CAT廣泛存在于植物中，可催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解，防止過氧化，主要與抗逆性和氧化衰老等生理過程有關(guān)。植物遭受生物和理化因子傷害時(shí)，產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)在傳遞和放大信號(hào)過程中可改變離子的分布和啟動(dòng)核基因的表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)誘導(dǎo)提高植物對(duì)各種脅迫的耐受性，而CAT可清除過多的ROS以使其保持在一定的濃度范圍內(nèi)[14]。SOD是一類具有特定催化功能的蛋白質(zhì)，廣泛存在于植物中，是活性氧清除過程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，可將O2?－快速歧化為H2O2和分子氧，對(duì)防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能具有十分重要的作用[15]。為進(jìn)一步探究木霉緩解草酸毒害的機(jī)理，本研究分析了各處理下黃瓜幼苗葉片中這4種抗性酶的活性變化，結(jié)果表明，與PD處理相比，僅接種木霉的T處理降低PAL、CAT、SOD活性，尤其CAT、SOD活性降低顯著，但顯著增加PPO活性；添加草酸能大幅提高PAL和PPO活性，降低SOD活性，對(duì)CAT活性的影響多不顯著；而接種木霉可有效緩解外源草酸對(duì)PAL和PPO活性的影響，進(jìn)一步降低SOD和CAT活性，總體來說，外源草酸濃度低于20 mmol/L時(shí)，接種木霉對(duì)降低其脅迫作用的效果較好。前人對(duì)接種木霉菌株引發(fā)的植物抗性酶活性變化也進(jìn)行了一些研究[16－20]，但不同木霉菌株引發(fā)的不同植物的抗性酶響應(yīng)模式不同，甚至同一菌株對(duì)不同植物抗性酶系統(tǒng)的作用也不同；另外，不同作物的抗性酶系統(tǒng)對(duì)不同濃度草酸脅迫的響應(yīng)也不同[21，22]。造成上述差異的原因還有待進(jìn)一步研究。

綜上，木霉對(duì)草酸具有一定降解作用，接種木霉能有效緩解低濃度(10~20 mmol/L)外源草酸對(duì)黃瓜幼苗的毒害。這可為進(jìn)一步研究木霉對(duì)植物響應(yīng)外源草酸脅迫的影響提供參考。