何明川，鈕徐融*，曾舒泉，謝永輝，戴恩，李美燕，吳國星，張忠，王志江

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省煙草公司昆明市公司，云南 昆明 650051；3.山東第一醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 泰安 271016)

煙草黑脛病是目前世界上危害較嚴(yán)重的煙草真菌性病害之一，對世界煙草生產(chǎn)造成巨大的沖擊和威脅，受到廣泛關(guān)注[1，2]。近年來在該病害流行預(yù)測預(yù)報、化學(xué)及生物農(nóng)藥防治等相關(guān)領(lǐng)域取得了較大進(jìn)展，對煙草黑脛病的防控手段主要為種植抗病品種、優(yōu)化煙草栽培管理技術(shù)和化學(xué)與生物防治[3，4]。但由于煙草疫霉的侵染過程伴有其他病原微生物的發(fā)生，易使抗病品種抗性喪失，且該病原菌游動孢子形成速度快且數(shù)量大、侵染寄主后發(fā)病快，所以田間監(jiān)測與管理難度較大[5]，化學(xué)防治被廣泛運(yùn)用以控制病害。相比化學(xué)防治，生物防治在長期研究與實際運(yùn)用中表現(xiàn)出無污染、無公害、不易產(chǎn)生抗藥性、藥效持續(xù)時間長等優(yōu)點(diǎn)[6]，應(yīng)進(jìn)行深入的研究并予以廣泛運(yùn)用。目前用于防治煙草黑脛病的拮抗菌多分離自根際土壤和植物根莖葉[7－9]，而分離自昆蟲體內(nèi)的具有拮抗煙草黑脛病特性的細(xì)菌卻鮮有報道。本課題在前期從美洲大蠊腸道內(nèi)分離出一株對煙草疫霉具有拮抗作用的Y12菌株，本試驗通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列測定等方法對該菌株進(jìn)行鑒定，采用單因素試驗確定其最佳培養(yǎng)基和最適發(fā)酵條件，為利用該菌對煙草黑脛病進(jìn)行生物防治和菌劑制備等奠定基礎(chǔ)，同時對利用昆蟲腸道微生物進(jìn)行生物防治提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗于2021年7—12月在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院生物化學(xué)實驗室進(jìn)行。拮抗菌Y12分離自美洲大蠊腸道內(nèi)，保存于－80℃超低溫冰箱。

1.2 供試培養(yǎng)基

蛋白胨酵母蔗糖(YSP)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，蔗糖20.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；牛肉膏酵母(NYBD)培養(yǎng)基:牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；細(xì)菌基礎(chǔ)(CM)培養(yǎng)基:葡萄糖5.0 g，(NH4)2SO42.0 g，檸檬酸鈉1.0 g，MgSO4?7H2O 0.2 g，K2HSO44.0 g，KH2SO46.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；牛肉膏蛋白胨瓊脂(NA)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；蛋白胨酵母(LB)培養(yǎng)基:蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；燕麥(OA)培養(yǎng)基:燕麥30.0 g，瓊脂18.0 g，加蒸餾水至1 L。

1.3 Y12菌株抑菌效果測定

采用平板對峙法對拮抗菌Y12的抑菌效果進(jìn)行測定。利用6 mm打孔器在已活化的煙草疫霉平板上打取菌餅，接種于新的OA平板中央，將已分離純化的Y12菌株單菌落使用接種環(huán)接種于OA平板距菌餅十字對稱2.2 cm處，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3~5 d后取出并測量抑菌圈半徑，計算抑菌率。以不接拮抗菌作為空白對照，每個處理3個重復(fù)[10]。

抑菌率(%)＝(對照平板菌落直徑－處理平板菌落直徑)/對照平板菌落直徑×100。

1.4 拮抗菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學(xué)與生理生化鑒定 挑取Y12單菌落接種于LB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落形態(tài)特征，并參考?常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊?等對菌株進(jìn)行生理生化特征鑒定[11，12]。

1.4.2 16S rRNA基因序列分析 以27F(5′－AGAGTTGACCTGGCTCA－3′)和1492R(5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′)為引物擴(kuò)增Y12菌株的16S rRNA基因序列。擴(kuò)增體系(50μL):PCR Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，DNA模板3μL，ddH2O 18μL。擴(kuò)增程序:94.8℃預(yù)變性2.5 min；98℃變性10 s，55℃退火10 s，72℃延伸20 s，30個循環(huán)；72℃延伸2 min。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物，送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序。測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對后將同源性較高的序列用MEGA 7和clustal x1.83軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13]。

1.5 拮抗菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 種子液的制備 挑取Y12菌株單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后備用。

1.5.2 培養(yǎng)基優(yōu)化 分別取50μL種子液接種于100 mL的YSP、NYBD、CM、NA和LB液體培養(yǎng)基中，于25℃、220 r/min、正常光照環(huán)境下培養(yǎng)24 h，使用分光光度法測定菌液在600 nm波長處的OD值以確定該菌在不同培養(yǎng)基中的生長狀況[14]。

1.5.3 培養(yǎng)基組分優(yōu)化 以1.5.2中的最適培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以麥芽糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖以及淀粉作為碳源。接種50μL種子液于25℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[15]。

以1.5.2中的最適培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以氯化銨、酵母浸粉、硝酸銨、甘氨酸以及蛋白胨作為氮源。接種50μL種子液于25℃、220 r/min條件下培養(yǎng)24 h，利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[15]。

1.5.4 溫度對拮抗菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養(yǎng)基中，于不同溫度(16、20、24、28、32、36、40℃)條件下、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，利用分光光度法測定各組菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.5 初始pH值對拮抗菌生長的影響 將50 μL Y12種子液加入最佳培養(yǎng)基中，利用HCl與NaOH調(diào)整pH值至4、5、6、7、8、9、10，于最適溫度下、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[15]。

1.5.6 裝液量對拮抗菌生長的影響 250 mL三角瓶中分別加入20、40、80、120、160 mL最佳培養(yǎng)基，50μL Y12種子液接種于培養(yǎng)基中，于最適溫度下、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.7 發(fā)酵時間對拮抗菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養(yǎng)基中，于最適溫度下、220 r/min、正常光照下振蕩培養(yǎng)，每隔2 h利用分光光度法測定菌液在600 nm波長處的OD值并繪制Y12生長曲線以確定Y12的最佳發(fā)酵時間[14]。

1.5.8 轉(zhuǎn)速對細(xì)菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養(yǎng)基中，于最適溫度、不同轉(zhuǎn)速下(140、160、180、200、220、240 r/min)振蕩培養(yǎng)至最適發(fā)酵時間后利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.9 光照時間對細(xì)菌生長的影響 將50μL Y12種子液加入最佳培養(yǎng)基中，于最適溫度、最適轉(zhuǎn)速、不同光照時間下(0、4、8、12、16、20、24 h)培養(yǎng)至最適發(fā)酵時間后利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[14]。

1.5.1 0 初始接菌量對細(xì)菌生長的影響 接入不同初始菌量(0.05%、0.10%、0.50%、1.00%、2.00%、2.50%、3.00%)至最佳培養(yǎng)基中，于最適溫度、最適轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)至最適發(fā)酵時間后利用分光光度法測定各組培養(yǎng)后的菌液在600 nm波長處的OD值[16]。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，利用DPS 7.05進(jìn)行統(tǒng)計分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Y12菌株抑菌效果

如圖1所示，處理組疫霉菌落平均半徑為(16.30±0.05)mm，抑制率為62.95%±0.11%。

圖1 拮抗菌Y12的抑菌效果

2.2 Y12菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)與生理生化特征 菌株的菌落直徑0.86~3.60 mm，近圓形，隨培養(yǎng)時間延長由銅綠色漸漸變?yōu)辄S褐色，表面濕潤隆起且邊緣略透明呈波狀。菌體短桿狀至橢球狀，(0.28~0.36)μm×(0.71~1.36)μm，未觀察到芽孢，革蘭氏陰性菌(圖2)。生理生化特征如表1所示。

圖2 Y12菌株菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果

表1 拮抗細(xì)菌Y12的生理生化特征

2.2.2 16S rRNA基因序列分析結(jié)果 將Y12菌株16S rRNA基因測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中已有序列進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)該菌與Pseudo-monas aeruginosaDSM 50071(NR117678.1)相似度最高(99%)。結(jié)合2.2.1中所得結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，鑒定該菌為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的Y12菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 Y12菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基種類優(yōu)化 由圖4可知，Y12菌株在NYBD培養(yǎng)基上的生長速度最快(OD600值為2.25)，在YSP、CM、LB、NA培養(yǎng)基上的生長較慢(YSP培養(yǎng)基上最慢)，且顯著低于NYBD培養(yǎng)基。表明NYBD培養(yǎng)基為該菌的最適培養(yǎng)基。

圖4 不同培養(yǎng)基對Y12菌株生長的影響

2.3.2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化 由圖5可知，Y12菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中生長狀況最佳(OD600值為2.07)，而后依次為乳糖、麥芽糖和蔗糖，以淀粉為碳源的處理顯著(P<0.05)低于葡萄糖、乳糖和麥芽糖處理。表明Y12的最適碳源為葡萄糖。

圖5 不同碳源對Y12菌株生長的影響

由圖6可知，Y12菌株在以酵母浸粉為氮源的培養(yǎng)基中生長最快(OD600值為2.24)，而后依次為氯化銨、蛋白胨和硝酸銨，以甘氨酸為氮源的處理與酵母浸粉處理存在顯著差異(P<0.05)。表明Y12的最適氮源為酵母浸粉。

圖6 不同氮源對Y12菌株生長的影響

2.3.3 溫度對Y12菌株生長的影響 由圖7可得，在一定溫度范圍內(nèi)(16~40℃)，Y12菌株的生長量差異不顯著，說明一定范圍溫度變化對Y12生長的影響較小。其中，28℃為該菌的最適生長溫度。

圖7 不同溫度對Y12菌株生長的影響

2.3.4 初始pH值對Y12菌株生長的影響 pH＝7時Y12生長狀況最好(OD600值為2.56)，pH＝4、pH＝5的生長環(huán)境對Y12具有顯著的抑制作用(圖8)，這表明該菌不適于生存在強(qiáng)酸性環(huán)境下，而在弱酸至堿性環(huán)境中能較好的生存。

圖8 不同pH值對Y12菌株生長的影響

2.3.5 裝液量對Y12菌株生長的影響 由圖9可知，裝液量為20 mL時最有利于該菌生長(OD600值為2.54)，在裝液量為40、80、120、160 mL時的培養(yǎng)效果顯著低于20 mL處理(P<0.05)。裝液量越多，氧氣含量越少，Y12菌株的生長受到抑制，這表明該菌為好氧型細(xì)菌，其生長對氧氣含量有較高的要求。

圖9 不同裝液量對Y12菌株生長的影響

2.3.6 發(fā)酵時間對Y12菌株生長的影響 由圖10可知，Y12菌株的生長曲線呈“S”型。0~12 h內(nèi)菌液濃度較低且變化緩慢，處于生長遲緩期。12 h后細(xì)菌生長速度急劇加快，菌液濃度不斷增大，48 h后該菌生長趨于穩(wěn)定。故12~48 h為Y12的對數(shù)生長期，生長速度最快。60 h時菌液濃度達(dá)到峰值，OD600值為2.17，60 h后細(xì)菌濃度逐漸下降，進(jìn)入衰亡期。

圖10 Y12菌株生長曲線

2.3.7 轉(zhuǎn)速對Y12菌株生長的影響 160、220 r/min和240 r/min培養(yǎng)效果較好，其中以220 r/min最優(yōu)(OD600值為1.91)；140、180 r/min培養(yǎng)效果略差；200 r/min培養(yǎng)效果最差，且顯著低于160、220、240 r/min處理(P<0.05，圖11)。

圖11 不同轉(zhuǎn)速對Y12菌株生長的影響

2.3.8 光照對細(xì)菌生長的影響 由圖12可知，每日光照8 h的培養(yǎng)效果最優(yōu)(OD600值為2.36)，其次為4 h和0 h處理。12 h和24 h光照處理下的培養(yǎng)效果較差且與8 h光照處理組存在顯著差異(P<0.05)，16 h和20 h處理效果顯著低于其它處理(P<0.05)。

圖12 不同光照時間對Y12菌株生長的影響

2.3.9 初始接菌量對Y12菌株生長的影響 由圖13可知，不同初始接菌量對Y12菌株生長的影響差異不顯著，其中接菌量為0.10%時最適宜Y12菌株生長(OD600值2.23)。

圖13 不同接菌量對Y12菌株生長的影響

3 討論與結(jié)論

前期從美洲大蠊腸道內(nèi)分離到一株對煙草黑脛病拮抗作用較好的Y12菌株，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析，確定該菌為銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)。假單胞菌是自然界中種類和數(shù)量較多、分布最廣泛的微生物之一，其豐富的遺傳多樣性為人類對其的研究提供了繁多的資源，擁有廣闊的研究前景和應(yīng)用價值[17，18]。有研究表明某些假單胞屬生防菌對煙草黑脛病有良好的拮抗效果，可開發(fā)為生物農(nóng)藥用于田間防治[19]。關(guān)于將假單胞菌作為生防菌防治煙草黑脛病的研究已較為深入。例如許煜泉等[20]研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌JKD－2能分泌鐵載體以抑制稻瘟病菌(Piricularia orzae)的生長；譙天敏等[19]分離得到的一株銅綠假單胞菌ZB27，對雜交竹梢枯病病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用；王遠(yuǎn)山等[21]的研究表明綠針假單胞菌(Pseudomonas choloraphis)可能因分泌某種抗生素類物質(zhì)而表現(xiàn)出對煙草疫霉的拮抗作用；董國菊等[22，23]的研究發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)可通過分解纖維素、蛋白質(zhì)和結(jié)合Fe3＋，破壞煙草黑脛病病原菌細(xì)胞壁，從而抑制其生長。另外，熒光假單胞產(chǎn)生的抗生素吩嗪酸(PCA)和2，4－二乙酰藤黃酚(Ph1)被認(rèn)為在抑制小麥全蝕菌Gaeamuuomyces gramiaisvar.tritici上起重要作用[24]。目前，相關(guān)研究中具有拮抗作用的銅綠假單胞菌多為根際土壤和植物體內(nèi)分離所得[7－9]，而Y12菌株由美洲大蠊腸道中分離得到，為昆蟲內(nèi)生菌用于生物防治提供了資源。

Y12最適培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的篩選結(jié)果表明，該菌最適培養(yǎng)基成分為:牛肉浸膏8.0 g，酵母浸粉5.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 L；最適發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度28℃、pH＝7、裝液量20 mL、發(fā)酵時間60 h、轉(zhuǎn)速220 r/min、光照時間8 h/d、接菌量0.10%。相較于對病原真菌起拮抗作用的銅綠假單胞菌2016NX1的最佳發(fā)酵條件[25]，Y12發(fā)酵的最適轉(zhuǎn)速更高、發(fā)酵溫度更低。采用最適培養(yǎng)基在最適條件下培養(yǎng)Y12可明顯提高其發(fā)酵速度、增加其發(fā)酵產(chǎn)出效率，為利用Y12菌株開展菌劑制備等研究工作奠定了基礎(chǔ)。Y12菌株對煙草黑脛病的拮抗效果僅通過平板對峙試驗進(jìn)行測定，并未在感病植株上進(jìn)行抗病防治試驗，后期需對其田間防治效果進(jìn)行驗證。

本研究表明銅綠假單胞菌Y12對煙草黑脛病病菌具有較明顯的拮抗作用，為煙草黑脛病的生物防治提供了理論基礎(chǔ)。