付春張鯤李膨呈張偉男夏晗李長生仇靜靜王興軍趙傳志李愛芹

(1.濰坊市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 濰坊 261071；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)作物種質(zhì)資源研究所(生物技術(shù)研究所)/山東省作物遺傳育種與生態(tài)生理重點實驗室，山東 濟南 250100；3.山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，山東 濟南 250100)

花生是重要的油料作物和經(jīng)濟作物。我國花生年種植面積約467萬hm2，僅次于玉米、水稻、小麥、大豆、油菜、馬鈴薯等作物。近年來，我國花生生產(chǎn)與消費持續(xù)增長，已經(jīng)成為我國總產(chǎn)量最大的油料作物，發(fā)展花生生產(chǎn)對于保障我國糧油安全、促進農(nóng)民增收、調(diào)整農(nóng)業(yè)種植結(jié)構(gòu)和改善膳食結(jié)構(gòu)等具有重要意義[1]。

栽培花生(Arachis hypogaeaL.)是異源四倍體(AABB，2n＝4×＝40)，是由二倍體祖先種Arachis duranensis(AA，2n＝2×＝20)和Arachis ipaensis(BB，2n＝2×＝20)雜交后自然加倍形成的[2，3]。由于優(yōu)異親本種質(zhì)資源缺乏，在花生育種過程中，獅頭企和伏花生等骨干親本被反復(fù)利用，導(dǎo)致栽培花生的遺傳背景狹窄[4]?；ㄉ鷮儆?0多個野生近緣種，遺傳多樣性豐富。與栽培種相比，花生野生種所處的環(huán)境更復(fù)雜、更惡劣，對生物和非生物脅迫具有很高的抗性，尤其對青枯病、黃曲霉、葉斑病保持了很高的抗性，如A.diogoi和A.correntina對番茄斑點枯萎病毒(TSWV)具有很好的抗性，是花生抗病、抗蟲、抗干旱種質(zhì)創(chuàng)新的重要基因庫；另外，野生花生資源還具有高蛋白質(zhì)、高氨基酸和高油脂含量等特點[5－9]。因此，將野生花生的優(yōu)良基因轉(zhuǎn)移到栽培花生中是花生遺傳改良的重要途徑。然而，關(guān)于花生野生資源遺傳多樣性和基因組方面的研究相對滯后，制約了其在花生遺傳改良中的應(yīng)用。

基因組大小(genome size)是指一個基因組中所擁有的DNA含量，是種質(zhì)資源評價和利用的重要參考之一。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry)是測定基因組大小的常用方法之一，與傳統(tǒng)壓片方法相比更具優(yōu)勢和特點，已廣泛應(yīng)用于植物、真菌等的基因組大小測定[10－12]。DNA分子標(biāo)記(molecular marker)是能反映生物個體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段，在農(nóng)作物種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性分析等方面具有廣泛應(yīng)用。

本研究對收集和保存的10份野生花生資源進行了遺傳多樣性分析和基因組大小測定，以期為野生花生的鑒定和評價、基因組解析、重要性狀的遺傳解析及在育種中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用的花生種質(zhì)資源材料Tifrunner、獅頭企、伏花生和IpaDur由本實驗室保存，野生花生種質(zhì)資源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所、廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院和美國種質(zhì)資源庫提供(表1)。2021年5月將供試材料種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗場，7月取幼嫩葉片提取基因組DNA。流式細(xì)胞儀分析采用馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)做內(nèi)標(biāo)，馬鈴薯材料由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所楊煜老師提供。

表1 本研究所用的花生種質(zhì)材料

1.2 花生基因組DNA的提取

取未展開的花生嫩葉置于裝有鋼珠的2.0 mL離心管中，用高通量組織研磨器(SCIENTZ－48)磨成粉。利用北京天根生化科技有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒，參照說明書的步驟進行DNA提取。分別用Eppendorf分光光度計和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和質(zhì)量，存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SSR分子標(biāo)記分析

PCR反應(yīng)體系如下:正、反向引物(10μmol/L)各1μL，2×PowerTaqPCR Master-Mix 10μL，DNA模板2μL，加入滅菌的雙蒸水補足到20μL。在PCR儀(寶生物TP600)上進行如下程序:95℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，50~60℃退火30 s(退火溫度參照引物報告單)，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；然后72℃延伸7 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。PCR結(jié)束后采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。電泳及染色參照文獻[13]的方法進行。

1.4 聚類分析

電泳完畢后，以二進制人工讀帶法進行數(shù)據(jù)分析，清晰的條帶記為“1”，在同一位置無帶或不易分辨的記為“0”。參照文獻[13]的方法，利用軟件NTSYS－pc計算遺傳相似系數(shù)(genetic similarity，GS)，采用UPGMA法進行聚類分析。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測基因組大小

采用Otto細(xì)胞核提取液配方和PI熒光染料，按照文獻[14]的方法進行，具體步驟如下:

(1)細(xì)胞核懸液的制備。取待測花生種質(zhì)材料的新鮮嫩葉4~8片及內(nèi)標(biāo)馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)新鮮嫩葉混合后置于冰上的培養(yǎng)皿中，加入預(yù)冷的OttoⅠ緩沖液(0.1 mol/L檸檬酸，0.5%(v/v)Tween 20，pH 2.3)2 mL，用鋒利刀片將葉片切碎，得到細(xì)胞核粗懸液；用45μm孔徑尼龍網(wǎng)過濾粗懸浮液，150×g離心5 min，棄大部分上清，留約100μL，輕輕振動使細(xì)胞核重新懸浮，再加入100μL新鮮預(yù)冷的OttoⅠ緩沖液，輕輕晃動，室溫孵育。

(2)基因組DNA特異性染色。加入OttoⅡ緩沖液(0.4 mol/L Na2HPO4?12H2O，pH 8.9)1 mL和50μg/mL RNase 50μL，3 min后加入碘化丙啶(PI)至濃度為5μg/mL。

(3)上機檢測。使用CytoFLEX流式細(xì)胞分析儀(美國Beckman)對染色樣品進行檢測，每個樣品至少收集5 000個顆粒，并進行3次重復(fù)測定。使用儀器自帶的軟件進行數(shù)據(jù)收集和分析。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)偏差/平均通道數(shù)的比值CV<3%時，說明實驗結(jié)果可信。待測樣本核DNA含量或倍性水平＝參照樣本核DNA含量或倍性水平×(待測樣本G0峰熒光均值/參照樣本G0峰熒光均值)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記篩選和分析

隨機選取10個本實驗室前期開發(fā)的花生SSR標(biāo)記，對9個花生野生近緣種和1個花生栽培種(Tifrunner)的基因組DNA進行PCR擴增和多態(tài)性篩選，其中7個標(biāo)記能在至少7個以上的花生材料中擴增出清晰、可辨識的多態(tài)性條帶，最終用這7個標(biāo)記對所選10份花生材料進行遺傳多樣性分析(表2)。這7個標(biāo)記分別來源于花生A03(2個)、A07、A09、B02、B03和B06染色體，從10個花生種質(zhì)材料中共檢測到33個變異位點，平均每個標(biāo)記4.7個，變幅為3~6個，其中，標(biāo)記gSSR－87000和gSSR－101199檢測到的等位變異最多，均為6個；gSSR－20130和gSSR－25150檢測到的等位變異最少，均為3個。鑒別力(discriminating power，DP)變幅為2~4，平均每個標(biāo)記2.85，其中，gSSR－25150和gSSR－101199的鑒別力最高，均為4；gSSR－87000、gssR－20130和gSSR－31113鑒別能力最低，均為2。遺傳多態(tài)性信息含量(PIC)在0.68~0.98之間，平均0.90。

表2 花生全基因組SSR來源及多態(tài)性等信息

2.2 種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系

根據(jù)相似系數(shù)矩陣按UPGMA法進行聚類，繪制10份種質(zhì)材料的親緣關(guān)系樹，結(jié)果(圖1)顯示，四倍體的花生栽培種Tifrunner與四倍體的野生花生A.monticola聚在一起，與人工合成的四倍體材料IpaDur距離也比較近；花生A和B亞基因組的祖先種A.duranesis和A.ipaensis被聚在了一起；花生屬花生區(qū)組的另外3個材料A.stenosper-ma、A.batizocoi和A.magna聚在一起；來源于根莖區(qū)組的A.glabrata與花生區(qū)組的A.cardenasis聚在一起。

圖1 10份花生種質(zhì)材料聚類分析結(jié)果

2.3 花生屬部分野生資源基因組大小的測定

為了測定野生花生基因組的大小，我們首先利用流式細(xì)胞儀測定了已知基因組花生種質(zhì)Tifrunner、伏 花 生、獅 頭 企、A.duranensis(V14167)、A.ipaensis、A.monticola(PI 497261)及內(nèi)標(biāo)(馬鈴薯Solanum tuberosumL.)的熒光強度(圖2)。各種質(zhì)的基因組大小測定結(jié)果與文獻中的預(yù)測結(jié)果基本一致(表3)，說明該測定方法準(zhǔn)確有效，可用于對花生野生種基因組大小的測定。但由于基因組中存在大量重復(fù)序列和一些不能組裝的序列，因此，預(yù)測的基因組大小要大于實際組裝的結(jié)果。

圖2 已知基因組花生材料的熒光強度檢測結(jié)果

表3 流式細(xì)胞儀對已知基因組花生種質(zhì)基因組大小的測定結(jié)果

利用該測定方法對4個基因組大小未知的野生花生種質(zhì)進行檢測，結(jié)果表明，A.duranensis(PI sesn2848)、A.cardenasis(PI 262141)、A.batizocoi(Grif15032)、A.monticola(PI 468199)的基因組大小分別為1.26、1.61、1.25、2.78 Gb，人工合成四倍體IpaDur的基因組大小為2.81 Gb。其熒光強度檢測結(jié)果見圖3。

圖3 花生野生種質(zhì)的熒光強度檢測

3 討論與結(jié)論

優(yōu)異的親本種質(zhì)資源是作物新品種培育的前提和基礎(chǔ)，栽培花生的遺傳基礎(chǔ)相對狹窄導(dǎo)致難以培育出突破性品種。野生花生資源遺傳多樣性豐富且具有抗逆、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)異基因，是花生遺傳改良的寶貴資源。引進野生花生種質(zhì)資源，并了解其遺傳多樣性及親緣關(guān)系是有效利用野生花生的基礎(chǔ)。我國自20世紀(jì)70年代以來從美國和國際半干旱熱帶地區(qū)作物研究所(International Crops Research Institute for the Semi－Arid Tropics，ICRISAT)引進了大量的野生花生種質(zhì)資源，大部分保存在武漢和南寧的野生花生種質(zhì)資源圃，并開展了一系列野生花生資源的評價和利用工作。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、地理分布和雜交親和性等特點，花生屬的植物可以分為9個區(qū)組，其中花生區(qū)組是比較大的一個區(qū)組，栽培花生及其二倍體祖先種A.duranensis、A.ipaensis及四倍體野生種A.monticola均屬于花生區(qū)組[9，20]?；ㄉ鷧^(qū)組的野生花生與栽培花生親緣關(guān)系較近，對它的研究和應(yīng)用也相對較多。例如，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院將花生區(qū)組抗銹病的二倍體野生種與珍珠豆型農(nóng)家品種賀粵1號雜交后進行染色體加倍和選擇，選育出了能穩(wěn)定遺傳且性狀優(yōu)良的四倍體新品系[21]；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所系統(tǒng)鑒定了79份野生花生對青枯病的抗性反應(yīng)，從中篩選出高抗青枯病材料15份，并通過SSR分析了花生屬6個區(qū)組84份材料(38份為花生區(qū)組)的親緣關(guān)系和遺傳多樣性，篩選出59對穩(wěn)定的SSR引物[22]。這些野生材料均來源于花生區(qū)組且具有很高的抗性，是花生遺傳改良的寶貴材料，而且很多材料的染色體片段已經(jīng)滲入到栽培花生中[22，23]。

本課題組前期利用花生野生種A.duranensis和A.ipaensis的基因組，開發(fā)了11萬條覆蓋花生基因組的SSR標(biāo)記[24]。本研究從中隨機選取了10個標(biāo)記，用于對栽培花生Tifrunner和野生花生A.stenosperma、A.batizocoi、A.magna、A.cardenasis、A.glabrata、A.monticola、A.duranensis、A.ipaensis及人工合成四倍體材料IpaDur進行檢測，發(fā)現(xiàn)其中7個標(biāo)記具有穩(wěn)定的多態(tài)性，可以用于這些花生材料的特異性識別，也可以用于在創(chuàng)新材料中追蹤野生花生的基因組片段。我們開發(fā)的花生全基因組SSR很多是A和B亞基因組特異的，而本研究所用野生花生材料基本上都是二倍體，只含有A、B亞基因組或者K基因組等，因此很多標(biāo)記是特異的，但在不同材料中不會表現(xiàn)出共顯性的特點。另外，這一特性也可能會對野生花生遺傳進化樹的聚類結(jié)果產(chǎn)生影響。

流式細(xì)胞術(shù)重復(fù)性好、測定結(jié)果精確，已被廣泛用于植物基因組大小的測定。本研究利用流式細(xì)胞術(shù)對6份基因組大小已知的花生種質(zhì)進行測定，結(jié)果與預(yù)測基因組大小相近，也證明了該方法的準(zhǔn)確度較高。用該法對4份基因組大小未知種質(zhì)進行檢測，得到其基因大小分別為A.duranensis(PI sesn2848)1.26 Gb，A.cadenasis(PI 262141)1.61 Gb，A.batizocoi(Grif15032)1.25 Gb，A.monticola(PI 468199)2.78 Gb。本研究結(jié)果可為野生花生的基因組學(xué)研究提供參考。