郭治華， 劉振寧， 李子英， 蒲 羿， 韓思盈

百草枯(paraquat, PQ)是一種觸殺型高效除草劑。盡管自2016年開始國內(nèi)已經(jīng)發(fā)布禁止生產(chǎn)銷售百草枯水劑，但是在臨床上仍有百草枯中毒事件的發(fā)生。急性百草枯中毒病死率高，通常情況下20%百草枯溶液10～20 mL即可造成患者多器官損傷甚至死亡。百草枯進(jìn)入體內(nèi)以后，迅速吸收入血，分布全身各個(gè)組織器官，造成肺臟、肝臟、腎臟、心肌等功能損傷。由于肺臟中存在著豐富的多胺攝取系統(tǒng)，肺泡上皮細(xì)胞很容易將其攝取，產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)造成急性肺損傷[1]。腎臟作為百草枯的主要排泄器官，同樣可以造成急性腎損傷。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn), 近50%百草枯中毒患者出現(xiàn)了急性肝損傷[2]。然而，百草枯導(dǎo)致急性肝損傷的機(jī)制以及能否有藥物對肝臟產(chǎn)生保護(hù)作用，目前尚未明確，需要進(jìn)一步研究和探索。

桂皮醛(cinnamaldehyde, CA)是中國傳統(tǒng)中藥材肉桂揮發(fā)油的主要成分，具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[3-4]。桂皮醛可以顯著減少活性氧自由基釋放，降低一氧化氮表達(dá)水平，并增加抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽還原酶的含量，發(fā)揮抗氧化作用[3]。桂皮醛可以抑制巨噬細(xì)胞NACHT、LRR和PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)炎性小體的激活，降低促炎癥因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用[5]。鑒于既往研究顯示氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)是百草枯在體內(nèi)導(dǎo)致器官損傷的主要機(jī)制，而桂皮醛能否在百草枯致小鼠急性肝損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用，目前尚不清楚，國內(nèi)外未見相關(guān)研究報(bào)道。本研究將采用不同劑量桂皮醛對百草枯中毒小鼠進(jìn)行預(yù)處理，研究其對肝臟的保護(hù)作用以及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑 百草枯和桂皮醛(Sigma-Aldrich公司， 美國)；IL-1β ELISA試劑盒(R&D，美國)，SOD和丙二醛(MDA)檢測試劑盒(南京建成生物公司，中國)；過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α(PGC-1α)、沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)、NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Proteintech，美國)；其余均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。

1.2動物與分組

清潔級雄性C57BL/6N小鼠(體質(zhì)量18～25 g)，共計(jì)24只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。小鼠飼養(yǎng)的條件為室內(nèi)溫度控制20～25 ℃、濕度控制40%～60%，晝夜節(jié)律控制，自由攝取水和食物。該實(shí)驗(yàn)研究方案經(jīng)過中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)[倫理編號：2020PS195K(X1)]。

將24只小鼠隨機(jī)平均分成4組，每組6只。百草枯中毒(PQ)組：按照百草枯30 mg/kg劑量一次性腹腔注射；低劑量桂皮醛(PQ+L-CA)和高劑量桂皮醛(PQ+H-CA)干預(yù)組：按照50 mg/(kg·d)或100 mg/(kg·d)兩種不同劑量桂皮醛進(jìn)行小鼠灌胃7 d，然后給予百草枯30 mg/kg腹腔注射；對照組(Control)：0.3 mL生理鹽水灌胃。在百草枯腹腔注射后24 h，處死小鼠，留取血液和肝組織標(biāo)本，置于-80 ℃保存以備檢測。取肝臟左葉部分置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h，以備石蠟包埋切片。

1.3研究方法

1.3.1 HE 染色 取出保存在4%多聚甲醛固定好的小鼠肝組織，流水中沖洗1 h后切割組織塊(厚度約0.5 cm)，常規(guī)組織梯度酒精脫水，二甲苯透明，再將標(biāo)本放置65 ℃液態(tài)蠟塊中浸蠟，包埋模具內(nèi)包埋成蠟塊，使用切片機(jī)連續(xù)切片厚度約4 μm。將切片用二甲苯脫蠟，再移入蘇木精染色3 min，然后流水沖洗，晾干后放入1%鹽酸乙醇溶液分化，伊紅液染色10 s后，流水沖洗終止染色，放在梯度酒精中脫水，二甲苯透明處理，滴加中性樹膠封片保存。在光鏡下使用圖像采集軟件(NIS-Elements F3.0)觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3.2 肝臟組織學(xué)評分 兩名研究人員采用盲法對肝臟組織病理學(xué)變化進(jìn)行評估。肝臟組織病理學(xué)評分[6]涉及到下列項(xiàng)目：肝竇充血，肝細(xì)胞空泡化，肝細(xì)胞壞死；分?jǐn)?shù)范圍設(shè)定為0：沒有改變，1：微小改變(單個(gè)細(xì)胞壞死)，2：輕度改變(<30%)，3：中度改變(30%～60%)，4：重度改變(>60%)。

1.3.3 免疫組化染色 將肝臟組織切片使用0.1 mol/L PBS漂洗3～5次，然后使用3%H2O2孵育20 min，再使用PBS沖洗5次，加入適量3% Triton X-100進(jìn)行孵育。20 min以后，再用0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)20 min。然后滴加10%正常山羊血清封閉游離的結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育20 min。去上血清，分別滴加適量兔抗鼠PGC-1α、SIRT1及NLRP3抗體(1∶500稀釋)， 4 ℃冰箱過夜。同時(shí)使用PBS代替一抗作為陰性對照。使用PBS沖洗玻片3～5次，然后滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗工作液(1∶200)，室溫孵育30 min。再次使用PBS沖洗3～5次, 滴加SABC, 室溫20 min。使用PBS沖洗20 min，再使用DAB顯色劑顯色2～3 min，終止顯色。蘇木素復(fù)染15 s，分色，二甲苯透明，晾干，中性樹膠封片。

1.3.4 肝組織MDA、SOD和血清IL-1β含量測定 按照建成生物公司SOD和MDA檢測試劑盒說明書執(zhí)行，檢測肝組織中含量；使用ELISA方法按照IL-1β說明書檢測血清中含量。

1.3.5 Western blot 方法檢測肝組織PGC-1α、SIRT1、NLRP3及Caspase-1的表達(dá) 按照細(xì)胞核蛋白提取試劑盒說明，提取肝組織蛋白；配制 15%分離膠和5%濃縮膠，蛋白定量后取50 μg 加樣，聚丙烯酰胺在120 V條件下電泳2 h；50 V 條件下PVDF 膜轉(zhuǎn)膜3 h；5%脫脂牛奶封閉，滴加PGC-1α、SIRT1、NLRP3和Caspase-1一抗(1∶100)，4 ℃過夜; 次日，使用 TBST 緩沖液清洗 3 次，每次 5 min。再加入二抗(1∶500)室溫下孵育2 h，再用TBST 緩沖液清洗 3 次，每次5 min，后滴加 ECL 發(fā)光液，然后置于凝膠成像系統(tǒng)顯影，獲得圖像。使用Image J軟件獲得各個(gè)條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量，并進(jìn)行組間比較。

2 結(jié)果

2.1肝組織損傷評分 正常小鼠肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)完整。百草枯中毒組小鼠肝臟組織肝小葉中央靜脈淤血，周圍肝細(xì)胞水腫，甚至出現(xiàn)胞漿疏松化，肝細(xì)胞核出現(xiàn)固縮甚至溶解，匯管區(qū)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤。使用桂皮醛預(yù)處理以后，尤其是高劑量組小鼠肝小葉靜脈淤血明顯減輕，肝細(xì)胞漿空泡化減輕，肝細(xì)胞壞死減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少(見圖1)。肝組織病理學(xué)評分結(jié)果顯示，百草枯中毒后肝組織病理學(xué)評分增加，而使用桂皮醛預(yù)處理以后肝組織病理學(xué)評分下降，尤其是高劑量組，與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

注：PQ為百草枯中毒組；PQ+L-CA為低劑量桂皮醛干預(yù)組；PQ+H-CA為高劑量桂皮醛干預(yù)組；Control為對照組

表1 不同組別小鼠肝組織病理學(xué)評分分)

2.2肝組織中SIRT1、PGC-1α、NLRP3和Caspase-1蛋白表達(dá) PGC-1α和SIRT1蛋白在正常小鼠肝組織中僅少量表達(dá)。百草枯中毒后二者表達(dá)增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。使用桂皮醛預(yù)處理以后，二者表達(dá)較前增加，尤其是高劑量組更為明顯，與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NLRP3和Caspase-1在正常小鼠肝組織中表達(dá)量極少。百草枯中毒后二者表達(dá)增加，明顯高于對照組(P<0.05)。與百草枯中毒組比較，桂皮醛預(yù)處理可以減輕百草枯誘導(dǎo)的NLRP3和Caspase-1表達(dá)(P<0.05)。見圖2、3。

注：PQ為百草枯中毒組；PQ+L-CA為低劑量桂皮醛干預(yù)組；PQ+H-CA為高劑量桂皮醛干預(yù)組；Control為對照組；SIRT1為沉默調(diào)節(jié)蛋白1；PGC-1α為過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α；NLRP3為NACHT、LRR和PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3

2.3肝組織中MDA和SOD含量 百草枯中毒小鼠肝組織中MDA含量較正常組小鼠增加，而SOD含量降低(P<0.05)。經(jīng)過桂皮醛預(yù)處理后，MDA含量較百草枯中毒組降低，而抗氧化蛋白SOD含量隨著桂皮醛的劑量增加，與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

注：PQ為百草枯中毒組；PQ+L-CA為低劑量桂皮醛干預(yù)組；PQ+H-CA為高劑量桂皮醛干預(yù)組；Control為對照組； SIRT1為沉默調(diào)節(jié)蛋白1；PGC-1α為過氧化物酶體增殖物激活受體-γ共激活因子-1α；NLRP3為NACHT、LRR和PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3; Caspase-1為半胱氨酸蛋白酶-1；GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；與Control組比較，*P<0.05；與PQ組比較，#P<0.05

2.4血清IL-1β含量 與對照組比較，百草枯中毒小鼠血清IL-1β含量增加(P<0.05)。使用桂皮醛預(yù)處理以后，IL-1β含量下降，尤其是高劑量組，與百草枯中毒組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同組別小鼠肝組織中MDA和SOD含量及血清IL-1β含量

3 討論

除肺臟之外，肝臟作為百草枯中毒另一個(gè)重要器官，引起眾多臨床醫(yī)生的關(guān)注，其中毒機(jī)制尚不十分清楚。目前普遍認(rèn)為百草枯作為強(qiáng)氧化劑，進(jìn)入體內(nèi)后通過氧化還原系統(tǒng)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而觸發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥細(xì)胞浸潤，炎癥細(xì)胞因子大量分泌，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[7]。既往研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒后肝臟出現(xiàn)局灶性甚至廣泛性細(xì)胞壞死，中性粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞等大量炎性細(xì)胞浸潤。在本研究中，同樣發(fā)現(xiàn)百草枯中毒小鼠肝組織出現(xiàn)細(xì)胞水腫，細(xì)胞空泡變性，肝細(xì)胞凋亡。使用桂皮醛預(yù)處理以后，肝細(xì)胞損傷較百草枯中毒小鼠減輕，尤其是高劑量組肝組織損傷評分明顯減輕，對百草枯中毒導(dǎo)致的急性肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。

SIRT1 是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide， NAD)依賴性蛋白去乙?；?，屬于sirtuins 家族，可以使NF-κB、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α, PGC-1α)等賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；{(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[8]。PGC-1α是線粒體生物合成的重要調(diào)控因子，能夠通過誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)清除活性氧自由基，在維持氧化還原狀態(tài)方面起到非常重要的生物學(xué)作用[9]。SIRT1 可以使肝內(nèi)線粒體的生成增加，促進(jìn)肝內(nèi)抗氧化物酶、MnSOD 的表達(dá)[10]。此外，還有研究表明SIRT1對 PGC-1α 的去乙?；茱@著提高PGC-1α的活性。PGC-1α 基因敲除鼠過氧化氫酶，SOD1及SOD2 表達(dá)水平均明顯下降，抗氧化能力減弱[11]。本研究發(fā)現(xiàn), 百草枯中毒小鼠肝組織中SIRT1和PGC-1α均有少量增加。使用不同劑量桂皮醛預(yù)處理以后，SIRT1和PGC-1α在肝組織中的表達(dá)均進(jìn)一步增加，抗氧化酶SOD活性增強(qiáng)，作為細(xì)胞脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA明顯減少。相對于低劑量桂皮醛而言，高劑量桂皮醛更為明顯增加SIRT1和PGC-1α的表達(dá)及SOD的活性，發(fā)揮抗氧化作用。

NACHT、LRR和PYD結(jié)構(gòu)域蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3)炎性小體是由模式識別受體識別病原體相關(guān)分子模式或危險(xiǎn)相關(guān)分子模式，進(jìn)而招募凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白及效應(yīng)分子胱冬肽酶(pro-caspase1)組成。當(dāng)NLRP3炎性小體被激活以后，pro-caspase-1 可通過剪切活化成為具有酶活性的Caspase-1，Caspase-1活化后可使IL-1β和IL-18前體轉(zhuǎn)變成成熟的IL-1β和IL-18釋放至細(xì)胞外，參與炎癥反應(yīng)[12]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者研究[13-15]發(fā)現(xiàn), NLRP3炎性小體參與包括內(nèi)毒素(LPS)、藥物、缺血再灌注等各種原因引起的急性肝損傷。既往課題組研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒可以誘導(dǎo)NLRP3炎性小體活化，進(jìn)而導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18表達(dá)增加[16]；在百草枯中毒導(dǎo)致急性肝損傷的動物模型中，NLRP3炎性小體同樣參與其中過程[17]。在本研究中，兩種劑量桂皮醛均能夠減少NLRP3 和Caspase-1蛋白表達(dá)，導(dǎo)致小鼠血清IL-1β含量進(jìn)一步減少。高劑量桂皮醛對NLRP3炎性小體活化抑制作用尤為明顯，減少炎性細(xì)胞因子的分泌。

近年來，桂皮醛越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注和研究。在鼠傷寒沙門氏菌感染引起的小鼠肝損傷動物模型中，肉桂醛可通過減少促炎細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，減輕炎癥反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，達(dá)到保護(hù)肝損傷的目的[18]。另一項(xiàng)研究[19]表明，桂皮醛可通過抑制NF-κB和p53通路減輕大鼠腸系膜缺血再灌注導(dǎo)致的急性肝損傷，減輕細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步說明桂皮醛在急性肝損傷方面的保護(hù)作用。在本研究中，兩種不同劑量桂皮醛呈劑量依賴性對百草枯中毒導(dǎo)致急性肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，減輕肝組織病理學(xué)損傷，增加抗氧化酶SOD的表達(dá)，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，減少炎性細(xì)胞因子IL-1β的釋放。分析其作用機(jī)制，桂皮醛可能通過調(diào)控SIRT1/PGC-1α表達(dá)和抑制NLRP3炎性小體活化發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，從而對百草枯中毒導(dǎo)致急性肝損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究只從動物層面進(jìn)行了初步探索，未在細(xì)胞水平對桂皮醛的藥理作用進(jìn)行更深入的研究，更多分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。桂皮醛作為一種天然植物的提取物，具有很好的臨床研究價(jià)值，未來有望應(yīng)用于百草枯中毒患者的臨床救治。