林 兵 王倩倩 陽 靜 胡煒倩 張圳甜 邵建忠 張和平 朱翠鳳

(1 南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院臨床營養(yǎng)科，廣東省深圳市 518101； 2 湖州聚療康復醫(yī)療中心有限公司，浙江省湖州市 313000； 3 內蒙古農業(yè)大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室,農業(yè)農村部奶制品加工重點實驗室,內蒙古自治區(qū)乳品生物技術與工程重點實驗室,內蒙古呼和浩特市 010018)

孤獨癥譜系障礙(autistic spectrum disorder，ASD)患兒的主要特征為存在社交、言語和非言語溝通上的困難，以及刻板或重復行為，多數病例的發(fā)育異常始于嬰幼兒期，在5歲前就已表現出明顯的癥狀，部分可持續(xù)至成年。該病給患兒家庭帶來重大的精神負擔和經濟壓力，受到社會各界的廣泛關注。近年來，ASD的發(fā)病率一直處于快速增長的狀態(tài)，根據美國疾病控制與預防中心公布的數據，2010年美國ASD患病率為1.47%[1]， 2021年時已達到2.27%[2]。目前我國仍缺乏ASD患病率的官方統計報告，2018年一項Meta分析結果顯示，我國ASD的患病率約為0.39%，且處于快速增長階段[3]。

以往有關ASD的研究主要集中在基因遺傳方面，然而近年來的研究表明環(huán)境因素對ASD的影響更大，包括飲食因素、腸道菌群變化、生命早期暴露于有毒有害物質等都可能對ASD的發(fā)生、發(fā)展產生影響[4]。有學者發(fā)現近一半的ASD患兒伴有胃腸道疾病癥狀，主要表現為腹瀉、腹脹、便秘、胃食管反流等，且ASD的嚴重程度與胃腸功能障礙嚴重程度往往呈正相關[5]。正常情況下，腸道具有屏障功能，可有效地阻擋腸道內寄生菌向腸腔外組織、器官移位，防止機體受內源性微生物及其分泌毒素的侵害。當腸道屏障功能受損或異常時，如出現缺血再灌注損傷、氧化應激、腸道微生物群失調、細胞自噬、不良遺傳和環(huán)境因素等影響，則需要使用合適的指標來準確評估腸道屏障的損傷情況及程度[6]。近年來，血清二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、D-乳酸和細菌內毒素作為評估腸道屏障功能的指標，已逐漸得到重視。本研究通過比較ASD患兒和正常同齡兒童血清的DAO、D-乳酸和細菌內毒素水平，來評估ASD兒童的腸道屏障功能及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 納入于2021年1～10月期間，因合并生長發(fā)育遲緩等問題至南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院臨床營養(yǎng)科門診和湖州聚療康復醫(yī)療中心就診的ASD患者(ASD組)。納入標準：(1)由具有資質的兒科或康復科醫(yī)師根據美國精神病學會出版的《精神障礙診斷與統計手冊第5版》[2]標準診斷為ASD；(2)年齡在3～16周歲之間，性別不限；(3)無已知的免疫缺陷性疾病。排除標準：(1)嚴重營養(yǎng)不良的患兒，診斷參考2009年我國九市兒童生長發(fā)育調查結果的標準[7]，體重低于同性別、同年齡兒童平均體重-2個標準差；(2)患有需要立即治療(或危及生命)的嚴重胃腸道疾病者；(3)有嚴重過敏史的患兒；(4)腎功能不全和肝功能障礙的患兒；(5)患有炎癥性腸病、腸梗阻、腸穿孔、腸出血、乳糜瀉、腸易激綜合征、嗜酸性粒細胞增多癥、食管炎、嗜酸細胞性胃腸炎或類似病癥的患兒；(6)具有嚴重感知覺或運動障礙的患兒。選擇同期因偏食等問題至營養(yǎng)科門診就診的3～16周歲非孤獨癥兒童作為對照組。納入標準：生長發(fā)育正常，即身高/體重均在同年齡、同性別兒童平均身高/體重±2個標準差范圍內。排除標準同ASD組。共納入ASD組患兒19例，正常對照組兒童38例，兩組性別、年齡、食物和藥物過敏史、近1個月抗生素和益生菌使用史比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。所有調查對象的家屬均簽署了知情同意書，本項目通過了南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的審查(批號：NYSZYYEC20200045)。

表1 兩組兒童一般情況的比較

1.2 臨床資料的收集 包括年齡、性別、身高、體重、食物和藥物過敏史、各種疾病史(遺傳性疾病、血液系統疾病、腎病)、近1個月的用藥史等。

1.3 腸道屏障功能的檢測 空腹8 h以上后采集靜脈血5 mL，用抗凝管于4 ℃冷藏備檢。檢測時先以3 500 r/min的速度離心6 min，取上層血清20 μL，采用腸屏障功能生化檢測儀(北京中生金域診斷技術股份有限公司，型號：JY-DLT)和DAO/D-乳酸/細菌內毒素試劑盒(北京中生金域診斷技術有限公司，批號：09210101)，由檢驗師專人進行血清DAO、D-乳酸、細菌內毒素水平的測定。

1.4 ASD患兒病情嚴重程度的評估 采用兒童孤獨癥評定量表(Childhood Autism Rating Scale，CARS)[8]進行評估。該量表由15項內容組成，每項按1～4級評分，最高60分，總分≥30分可診斷為ASD，其中≥30分但<36分為輕-中度ASD，≥36分為重度ASD。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料均服從正態(tài)分布，以(x±s)表示，方差齊時采用t檢驗進行組間比較，方差不齊時采用t′檢驗進行組間比較；采用Pearson檢驗進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組血清DAO、D-乳酸和細菌內毒素水平 與對照組相比，ASD組血清D-乳酸水平更高(P<0.05)，而兩組血清DAO和細菌內毒素水平差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 兩組血清DAO、D-乳酸和細菌內毒素水平的比較(x±s)

2.2 ASD患兒病情嚴重程度與血清DAO、D-乳酸、細菌內毒素水平的相關性 與輕-中度ASD患兒相比，重度ASD患兒的血清D-乳酸水平更高(P<0.05)，而不同嚴重程度ASD患兒之間的血清DAO和細菌內毒素水平差異無統計學意義(均P>0.05)，見表3。在ASD組中，CARS評分與血清D-乳酸水平呈正相關(r=0.555，P=0.014)，與血清DOA、細菌內毒素水平之間無相關性(r=-0.052、0.075，P=0.832、0.760)。

表3 不同病情嚴重程度ASD患者血清DAO、D-乳酸和細菌內毒素水平的比較(x±s)

3 討 論

腸道作為人體的“第二大腦”，可影響大腦認知和神經系統的發(fā)育。常見的胃腸道癥狀可能與ASD的發(fā)生、發(fā)展密切相關，這是因為腸道功能異?？梢酝ㄟ^腸道微生物-腸-腦軸影響腸道神經系統、神經內分泌系統和免疫系統等，從而間接地調控大腦功能，5-羥色胺、細菌內毒素等有毒有害物質穿過腸道屏障后，可直接作用于大腦或引發(fā)炎癥因子分泌間接作用于大腦，最終誘發(fā)神經和社交功能障礙[9-10]。

目前，評估腸道屏障功能的手段主要有血清DAO、D-乳酸、內毒素水平測定，以及腸道黏膜組織病理學檢測、血培養(yǎng)查找致病菌、糖分子探針檢測腸黏膜通透性等[11]。其中，DAO是小腸黏膜上皮細胞細胞質中的一種高活性酶，正常情況下在其他組織和外周血中含量極低；如果腸道黏膜細胞受損或壞死，細胞內DAO會釋放至血液中，導致血清DAO水平增加，因此其是評價腸道屏障功能非常敏感的指標。血清D-乳酸主要來自腸道內細菌無氧代謝，其他組織器官很少分泌，正常情況下其水平較低，但在缺血、缺氧條件下D-乳酸水平明顯升高，并穿過受損的腸黏膜，而人體自身缺少D-乳酸分解代謝酶，因此其濃度較為穩(wěn)定，臨床可將其用于評估腸道缺血缺氧情況和腸黏膜通透性的變化。內毒素主要由革蘭陰性菌死亡裂解產生，是革蘭陰性菌細胞壁中的脂多糖。當腸道屏障功能受損導致腸黏膜通透性增加時，內毒素可通過腸黏膜進入血液系統，形成內毒素血癥。上述3種實驗室指標是評價患者腸道屏障功能的快捷經濟指標，近年來在重癥、頑固性腹瀉等患者中逐漸得到重視和應用[12-13]。國內有研究報告，成人抑郁癥患者血清中的D-乳酸和細菌內毒素水平升高，且兩者水平與患者的年齡增長呈正相關[14]。但目前上述3種實驗室指標在ASD患兒中的相關研究仍較少。

本研究結果顯示，ASD組血清D-乳酸水平高于正常對照組(P<0.05)，但是兩組的血清DAO和細菌內毒素水平之間差異無統計學意義(均P>0.05)。這表明ASD患兒可能主要存在腸道缺血缺氧和黏膜通透性改變的問題，而沒有急性的腸黏膜壞死或腸道革蘭陰性菌顯著增加的情況[15]。亞組分析提示重度ASD患兒的血清D-乳酸水平較輕-中度ASD患兒更高，ASD患兒的CARS評分與血清D-乳酸水平呈正相關(均P<0.05)，表明ASD患兒病情越重，其腸道屏障功能損傷越重。這也與既往一些有關ASD與腸道屏障功能之間關系的研究的結果相似。例如，de Magistris等[16]通過口服果糖/甘露醇回收率實驗發(fā)現，36.7%的孤獨癥患兒和21.2%的孤獨癥患兒父母腸道通透性增加，而對照組中發(fā)生腸道通透性改變的兒童僅占4.8%。另有動物實驗顯示，丙戊酸誘導的ASD大鼠模型存在黏膜肌層厚度變薄和腸動力下降的情況[17]。Hsiao等[9]研究發(fā)現，孕期感染病毒的母鼠，其子代除了表現出ASD的核心癥狀，在成年后還會出現腸道通透性增加，以及血液中腸道微生物代謝產物增加的情況。這些研究結果表明，ASD與腸屏障功能損傷相關，但是腸黏膜組織病理學、口服乳糖/甘露醇回收率試驗等檢測方法應用較少，不適宜推廣，目前仍缺少認可度高、可方便快捷評估ASD患者腸道屏障功能的方法，而本研究結果提示血清D-乳酸或可發(fā)揮這一評估作用。

當前世界各國對ASD的研究基礎仍很薄弱[18-19]，尤其對ASD的病因研究仍較缺乏。近年來，腸道微生物-腸-腦軸機制逐漸受到重視，腸道屏障功能可能是其中的關鍵一環(huán)，本研究表明ASD患兒的血清D-乳酸水平升高，這反映其腸道屏障功能存在一定損傷，且孤獨癥疾病評分越高，腸道屏障功能損傷越嚴重。由此可見，對腸道屏障功能進行及時和連續(xù)的監(jiān)測可以評估ASD患兒腸-腦軸的變化，具有重要的臨床價值。但本研究樣本量不大，加上飲食差異等因素可能對腸道屏障功能產生潛在影響[6，20]，因此未來仍需更加深入地研究以明確腸道屏障功能在ASD中的作用。