肖 雪 言柯柯 李麗媚 趙 軍 張 哲 周曉瑩

(廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院1 耳鼻咽喉頭頸外科，2 放療科，廣西南寧市 530021； 3 廣西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院-附屬口腔醫(yī)院兒童口腔科，廣西南寧市 530021； 4 廣西醫(yī)科大學生命科學研究院，廣西南寧市 530021)

GLOBOCAN2020數(shù)據(jù)顯示，頭頸部腫瘤是世界上第七高發(fā)的惡性腫瘤，2020年全球新發(fā)病例超過90萬[1]。頭頸部鱗狀細胞癌(簡稱為頭頸鱗癌)是發(fā)生于口腔、口咽、下咽、喉、鼻竇、唾液腺等解剖位置的惡性腫瘤，約占頭頸部腫瘤的90%。由于頭頸鱗癌的臨床癥狀不典型，許多病例初診時就已經(jīng)處于晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)。盡管在過去的二三十年間腫瘤治療手段飛速發(fā)展，但是頭頸鱗癌患者的治療效果仍不佳。如何尋找有效的診斷及預后評估的標記物，是當今頭頸鱗癌研究的熱點。

頭頸鱗癌的發(fā)病危險因素有很多，包括經(jīng)典的危險因素如吸煙、飲酒，以及近年來備受關注的人乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus，HPV)[2]。HPV相關性頭頸鱗癌約占所有頭頸鱗癌的25%，這類患者以青壯年人群為主，治療效果通常較好，預后也好于HPV陰性患者[3]，但具體的原因和機制尚未完全闡明。

脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)，又稱含Patatin樣磷脂酶結構域蛋白3，是脂肪分解過程中的限速酶[4]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)鼻咽癌細胞通過表觀遺傳沉默UbcH8后下調ATGL的表達，導致脂滴堆積從而維持其惡性表型[5]。我們還報告了EB病毒編碼的潛伏膜蛋白2A通過影響ATGL的表達從而抑制鼻咽癌細胞的惡性生物學行為[6]。但是ATGL在頭頸鱗癌中的表達及作用尚未見研究報告。因此，本研究分析ATGL在頭頸鱗癌中的表達及與腫瘤預后的關系，并基于腫瘤免疫和表觀遺傳探討相關分子機制，以及HPV感染通過調控ATGL表達對頭頸鱗癌免疫微環(huán)境的影響。

1 資料與方法

1.1 ATGL在頭頸鱗癌中轉錄水平和蛋白表達水平的分析 首先，通過UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)對ATGL在頭頸鱗癌中的轉錄水平和蛋白表達水平進行分析[7]，其中轉錄水平分析納入520例頭頸鱗癌組織和44例頭頸部非癌組織，蛋白表達水平分析納入108例頭頸鱗癌組織和71例頭頸部非癌組織。另外，UALCAN數(shù)據(jù)庫提供以“HPV感染狀態(tài)”為分層因素的分析，因此本研究納入80例HPV陽性和434例HPV陰性的頭頸鱗癌組織，聯(lián)合44例非癌組織，進行ATGL的轉錄水平分析。

隨后，通過GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索ATGL微陣列數(shù)據(jù)集，納入標準為：(1)包含腫瘤和非腫瘤分組；(2)腫瘤組為根據(jù)WHO標準[8]確診為頭頸鱗癌的患者；(3)每組病例數(shù)>3例；(4)可獲得ATGL的數(shù)據(jù)。對入選的微陣列進行Meta分析以驗證ATGL在頭頸鱗癌中的轉錄水平。使用SPSS 22.0軟件進行相關統(tǒng)計學分析，使用漏斗圖和Begg′s檢驗進行發(fā)表偏倚評價，使用Cochran′sQ檢驗進行異質性分析，當P<0.05、I2>50%時被認為有異質性，此時使用隨機效應模型進行分析。通過繪制森林圖分析ATGL在頭頸鱗癌中的表達情況，通過繪制漏斗圖并進行Begg′s檢驗以評價和檢驗發(fā)表偏倚。以P<0.05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

1.2 ATGL表達與頭頸鱗癌分級和預后的關系 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫分析ATGL蛋白表達與頭頸鱗癌腫瘤分級的關系。根據(jù)Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)繪制不同腫瘤分期(Ⅲ、Ⅵ期)頭頸鱗癌患者和整體頭頸鱗癌患者的生存曲線[9]，分析ATGL基因表達與生存情況的關系。

1.3 ATGL在頭頸鱗癌中的DNA甲基化水平分析 通過MethSurv(https://biit.cs.ut.ee/methsurv/)分析ATGL CpG島在頭頸鱗癌中的甲基化狀態(tài)，并評估ATGL CpG島甲基化與頭頸鱗癌患者預后的相關性[10]，預后評價指標為總體生存率。

1.4 ATGL相關信號傳導通路的基因富集分析 通過基因富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)軟件[11]，解析ATGL參與調控的信號通路。將基因集設置為“h.all.v7.5.1.symbols.gmt”，對TCGA數(shù)據(jù)庫的頭頸鱗癌基因表達譜數(shù)據(jù)進行富集分析，F(xiàn)DR<0.25，基因數(shù)量設置為≥35。

1.5 ATGL與頭頸鱗癌中免疫細胞浸潤的相關性分析 使用TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.cistrome.org/)分析ATGL基因表達與頭頸鱗癌中免疫細胞浸潤水平的相關性，分析在不同HPV感染狀態(tài)下，ATGL基因表達與免疫細胞標志物的相關性[12]。

2 結 果

2.1 ATGL在頭頸鱗癌中的轉錄水平和蛋白表達水平 通過UALCAN數(shù)據(jù)庫進行分析發(fā)現(xiàn)，ATGL在頭頸鱗癌組織中的轉錄水平低于頭頸部非癌組織(P<0.01)，見圖1。隨后，納入GEO數(shù)據(jù)庫的21個數(shù)據(jù)集(表1)進行Meta分析，由于數(shù)據(jù)集之間存在異質性(I2=60.2%，P<0.001)，因此使用隨機效應模型，分析結果顯示ATGL在頭頸鱗癌組織中的表達下調[SMD(95%CI)=-0.34(-0.58，-0.10)，P<0.05]，漏斗圖提示數(shù)據(jù)沒有發(fā)表偏倚(Begg′s檢驗P>0.05)，見圖2。在蛋白表達水平方面，UALCAN數(shù)據(jù)平臺分析結果提示ATGL在頭頸鱗癌組織中的蛋白表達水平亦低于頭頸部非癌組織(P<0.001)，見圖1。

圖1 ATGL在頭頸鱗癌組織中的表達情況

表1 納入數(shù)據(jù)集的基本信息

圖2 ATGL在頭頸鱗癌中轉錄水平的驗證結果

2.2 ATGL表達與頭頸鱗癌分級和預后的關系 對ATGL蛋白表達水平與頭頸鱗癌腫瘤分級之間的關系進行分析，結果提示，與中分化(Grade 2)頭頸鱗癌組織相比，低分化(Grade 3)頭頸鱗癌組織中ATGL的蛋白表達更低(P<0.05)，見圖3A。對78例Ⅲ期、259例Ⅳ期的頭頸鱗癌患者中進行總體生存分析，結果提示ATGL高表達的患者的生存率更高(均P<0.05)，見圖3B、圖3C；對499例頭頸鱗癌患者進行總體生存分析，結果提示ATGL低表達、ATGL高表達的頭頸鱗癌患者的中位生存期分別為48.87個月、58.73個月，ATGL高表達者的總體生存率更高(P<0.05)，見圖3D。

圖3 ATGL表達與頭頸鱗癌分級、分期和預后的關系

2.3 ATGL DNA甲基化與頭頸鱗癌患者預后的相關性 MethSurv數(shù)據(jù)庫中ATGL共有20個候選CpG島位點，由于甲基化改變通常發(fā)生在CpG島，因此我們對ATGL CpG島的7個甲基化位點進行分析，結果提示共有3個位點的甲基化與患者的預后相關，分別為cg04519421、cg09051513和cg19713609(均P<0.05)，見表2。進一步分析發(fā)現(xiàn)與cg04519421、cg09051513位點未發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者相比，發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者生存率更低(均P<0.05)，預后更差；而與cg19713609位點未發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者相比，發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者的生存率更高(均P<0.05)。見圖4。

表2 ATGL DNA甲基化對頭頸鱗癌患者預后的相關性

圖4 ATGL CpG位點cg04519421、cg09051513和cg19713609不同甲基化水平患者的生存曲線比較

2.4 ATGL相關信號傳導通路的GSEA結果 最終納入富集分數(shù)最高、同時滿足P<0.05和FDR>0.25的15個信號通路，發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗癌中ATGL主要涉及轉錄因子E2F、DNA損傷檢查點G2M、原癌基因MYC、蛋白分泌、上皮-間質轉化、轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Hedgehog、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，MTOR)、糖酵解等信號傳導通路，見表3。ATGL的表達與這些信號通路的基因富集呈負相關，即頭頸鱗癌可能通過下調ATGL來激活這一系列信號通路。

表3 ATGL參與調控的信號傳導通路列表

2.5 ATGL表達與頭頸鱗癌的腫瘤純度及免疫細胞浸潤相關性分析 結果顯示，ATGL的基因表達水平與腫瘤純度無相關性(r=0.038，P=0.394)，而與B淋巴細胞(r=0.215，P=2.09×10-6)、CD4+T淋巴細胞(r=0.246，P=4.61×10-8)及CD8+T淋巴細胞(r=0.124，P=6.75×10-3)、巨噬細胞(r=0.215，P=1.94×10-6)、中性粒細胞(r=0.230，P=3.50×10-7)及樹突狀細胞(r=0.243，P=6.38×10-8)等免疫細胞的浸潤水平呈正相關，見圖5。

圖5 ATGL基因表達與頭頸鱗癌的腫瘤純度和免疫細胞浸潤水平的相關性

2.6 HPV通過上調ATGL的表達影響頭頸鱗癌免疫微環(huán)境 通過ULACAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，與HPV陰性的頭頸鱗癌組織相比，ATGL的轉錄水平在HPV陽性的頭頸鱗癌組織中表達更高，見圖6?；诖死^續(xù)探索在HPV感染狀態(tài)下ATGL對頭頸鱗癌免疫微環(huán)境的影響，結果顯示，與HPV陰性的頭頸鱗癌組織相比，在HPV陽性的頭頸鱗癌組織中ATGL基因表達水平與CD8+T淋巴細胞、T淋巴細胞(總)、B淋巴細胞、樹突狀細胞浸潤水平的相關性更高，見表4。

圖6 不同HPV感染狀態(tài)的頭頸鱗癌組織中的ATGL表達水平

表4 ATGL與免疫細胞標志物表達的相關性

3 討 論

ATGL在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中扮演了重要角色。ATGL具有腫瘤特異性，在不同的腫瘤類型中其表達情況也不同，例如，ATGL在乳腺癌、結腸癌、肝癌等組織中表達上調[13-15]，但在更多的腫瘤中，如肺癌、胰腺癌、平滑肌肉瘤，ATGL的轉錄水平呈現(xiàn)異常下調，并參與腫瘤進展的調控[16]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)ATGL在頭頸鱗癌中的轉錄水平下調(P<0.05)；與中分化頭頸鱗癌相比，在低分化頭頸鱗癌中ATGL蛋白的表達水平更低(P<0.05)；且ATGL基因表達水平越低，腫瘤Ⅲ期及Ⅳ期患者的生存率、頭頸鱗癌患者的總體生存率均更低(P<0.05)。這表明ATGL低表達與頭頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展及預后均有關。Qiao等[17]在一項病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，外周血中ATGL的異常甲基化與早期肺癌，尤其是年輕女性罹患肺癌的發(fā)病風險密切相關。本研究的甲基化水平分析結果也提示ATGL CpG島的3個位點的甲基化與患者的預后相關(P<0.05)，其中cg04519421、cg09051513位點發(fā)生高甲基化的頭頸鱗癌患者生存率更低。結合甲基化水平分析結果，我們推測頭頸鱗癌細胞可能通過表觀遺傳機制沉默ATGL的表達，以促進自身的惡性生物學行為，從而導致預后不良。

有學者提出，ATGL 通過氧化物酶增殖體激活受體α、炎癥、氧化還原穩(wěn)態(tài)及自噬等途徑調控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。而本研究結果提示，頭頸鱗癌中ATGL主要涉及轉錄因子E2F、DNA損傷檢查點G2M、原癌基因MYC、上皮-間質轉化、TGF-β、Hedgehog、PI3K/AKT/MTOR、糖酵解等信號傳導通路，表明上述通路均從不同層面或角度參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，這也印證了我們提出的關于頭頸鱗癌細胞通過下調ATGL從而激活腫瘤進程的假說。

腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞及其周圍的免疫細胞、炎癥細胞、成纖維細胞、微血管、細胞因子和趨化因子等構成[19]。在這個復雜的體系中，腫瘤細胞及其微環(huán)境相互影響，維持腫瘤細胞的惡性表型。本研究結果顯示，頭頸鱗癌中ATGL的表達與B淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞等免疫細胞浸潤程度呈正相關(P<0.05)。這提示頭頸鱗癌細胞可能通過下調ATGL，以抑制免疫細胞的防御功能，從而發(fā)生免疫逃避，導致患者預后不良。

HPV也參與調控頭頸鱗癌的免疫微環(huán)境。有研究報告，HPV調控頭頸鱗癌腫瘤微環(huán)境中的體液免疫，從而導致HPV特異性B淋巴細胞反應的發(fā)生，并激活抗體分泌細胞和生發(fā)中心B淋巴細胞[20]。在HPV相關性頭頸鱗癌中，CD8+T淋巴細胞占腫瘤浸潤淋巴細胞的30%[21]。2021年，Eberhardt等[21]提出，HPV特異性PD-1+干細胞樣CD8+T淋巴細胞具有很高的增殖潛能，對于維持腫瘤特異性CD8+T淋巴細胞應答至關重要，靶向性調控這一細胞亞群可能可以通過利用局部免疫反應，從而改善患者的臨床結局。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與HPV陰性的頭頸鱗癌組織相比，ATGL在HPV陽性的頭頸鱗癌組織中的表達較更高，并與CD8+T淋巴細胞、T淋巴細胞(總)、B淋巴細胞、樹突狀細胞高浸潤的相關性相對更強。由此可從HPV調控免疫重編程的角度切入，解釋HPV陽性的頭頸鱗癌患者臨床治療效果和預后較好的現(xiàn)象。

本研究從腫瘤免疫和表觀遺傳的角度，對ATGL在頭頸鱗癌尤其是HPV相關性頭頸鱗癌中的作用及相關機制進行了多維度的探索。結合研究結果，我們提出：ATGL是頭頸鱗癌的抑癌基因，是候選的預后評估相關分子標志物；頭頸鱗癌細胞可能通過表觀遺傳機制沉默ATGL的表達，從而促進自身的惡性生物學行為，同時抑制免疫細胞的防御功能以發(fā)生免疫逃避，由此導致不良預后；而HPV可介導ATGL高表達從而激活腫瘤微環(huán)境中的免疫應答，這是HPV相關性頭頸部鱗狀細胞癌患者治療應答較好的可能機制。