張亞男 肖 鵬 孫 瑞 羅亞鴿 謝 文 馮 坤

[1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿與康復(fù)學(xué)院，湖南省長沙市 410208； 2 河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，河南省洛陽市 471002； 3 河南省正骨研究院，河南省骨科醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心，河南省洛陽市 471002]

生物可吸收鎂合金具有可降解性、生物相容性、骨誘導(dǎo)性等優(yōu)勢，作為骨科醫(yī)用材料被廣泛應(yīng)用于臨床[1-3]。WE43鎂合金具有良好的力學(xué)性能和易加工性，故具有應(yīng)用于骨生物材料的價(jià)值[4-6]。目前有關(guān)WE43鎂合金的研究主要集中在體外安全性評價(jià)試驗(yàn)、材料的降解性能和速率等方面，而有關(guān)WE43鎂合金骨植入后在體內(nèi)降解過程中的生物相容性研究并不多。本研究觀察WE43鎂合金骨植入對大鼠血液常規(guī)、肝腎功能的影響，以及WE43鎂合金降解情況，從而探討WE43鎂合金在體內(nèi)的生物相容性。

1 材料與方法

1.1 材料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 WE43鎂合金采購自東莞市億諾金屬材料有限公司，元素含量為鎂93.1%、3.8%釔、2.4%釹、0.5%鋯、0.2%鋅，用數(shù)控機(jī)床加工成直徑約為2 mm、長度約為4 mm的鎂合金圓柱形試樣，尾部有直徑0.9 mm、深度2 mm的小孔1個(gè)，清潔后干熱滅菌備用。12只4月齡SD大鼠購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物許可證號：SYXK(豫)2021-0009]，雌雄各半，單籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～26 ℃，濕度為50%～70%。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成對照組和鎂合金植入組，每組6只，雌雄各半。

1.2 股骨髁骨缺損植入方法 飼養(yǎng)大鼠2周后進(jìn)行手術(shù)。鎂合金植入組大鼠術(shù)前禁食24 h。采用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，剪毛備皮，進(jìn)行股骨髁骨缺損植入手術(shù)。經(jīng)皮暴露左右兩側(cè)股骨髁位置，骨膜下剝離顯露骨質(zhì)，垂直于骨干方向用電鉆鉆頭鉆出大小為2 mm×4 mm的骨缺損(見圖1)； 把WE43鎂合金試樣植入大鼠的骨缺損處(見圖2)，植入完畢后沖洗并縫合傷口；用碘附消毒，再用紗布包裹縫合部位，以防動(dòng)物因疼痛而撕咬。術(shù)后給予慶大霉素肌內(nèi)注射，2萬U/d，1次/d，連續(xù)注射3 d。對照組大鼠不做任何處理。所有大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～26 ℃，濕度為50%～70%。

圖1 電鉆鉆孔

圖2 WE43鎂合金植入

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 血常規(guī)、全血元素和肝腎功能指標(biāo)的檢測：術(shù)后6個(gè)月，采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉兩組大鼠后取腹腔靜脈血，留取全血2 mL并制備血清3 mL(以3 000 r/min離心7 min分離血清)，其中全血用于檢測血常規(guī)和全血元素，血清用于檢測肝、腎功能指標(biāo)。血常規(guī)檢測項(xiàng)目為白細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積和血小板計(jì)數(shù)，采用XE-5000全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(SYSMEX株式會(huì)社)進(jìn)行檢測，試劑盒均購自SYSMEX公司(批號：R0503、R0508、A0013、A0042、A0062)。全血元素包括鎂、鋅、釔、釹和鋯，采用美國賽默飛公司ICAP-RQ型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，所用的標(biāo)準(zhǔn)物均購自美國Inorganic Ventures公司(批號：N2-MG665351、N2-ZN664680、M2-Y02020R、N2-ND668817、M2-ZR663705)。肝功能檢測指標(biāo)包括AST、ALT和堿性磷酸酶，腎功能檢測指標(biāo)包括尿素氮、肌酐和尿酸，均采用LABOSPECT 008AS全自動(dòng)生化分析儀(日立公司)進(jìn)行檢測，試劑盒均購自WAKO公司(批號：003046、910868、004087、004085、910868)。

1.3.2 組織病理學(xué)觀察：采血后采用3%戊巴比妥鈉(100 mg/kg)過量麻醉處死大鼠，取肝臟、腎臟和脾臟組織置于4%中性甲醛固定液48 h，然后進(jìn)行沖洗、酒精梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，將切片烤干后進(jìn)行脫蠟處理，之后順序置入不同濃度的酒精中脫水3 min，使用蘇木精染色5 min后流水清洗3次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗之后使用0.5%伊紅液染色1～3 min，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，使用中性樹膠封固。使用Olympus-BX41顯微鏡進(jìn)行觀察與拍照，制片和染色試劑為羅恩AR純試劑。

1.3.3 植入物降解情況及植入物周圍成骨情況：取鎂合金植入組大鼠左側(cè)股骨髁進(jìn)行Micro CT掃描。采用比利時(shí)Bruker公司的SkyScan 1174型CT儀，以12 μm掃描分辨率對植入物樣本進(jìn)行掃描。用N-Recon軟件進(jìn)行三維圖像重建，用CT-AN軟件進(jìn)行三維分析，計(jì)算植入物體積和觀察新骨生成情況。

1.4 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制 按照動(dòng)物飼養(yǎng)的要求規(guī)定，在飼養(yǎng)的過程中，密切觀察大鼠生長情況，避免大鼠生病或死亡，保證實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行，并做好實(shí)驗(yàn)記錄。 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室已通過ISO15189實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量認(rèn)證，并按要求做好相關(guān)質(zhì)控。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)錄入Excel軟件，建立數(shù)據(jù)庫。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組大鼠血常規(guī)和肝腎功能指標(biāo)的比較 兩組大鼠血常規(guī)與肝腎功能指標(biāo)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

組別nALT(U/L)AST(U/L)堿性磷酸酶(U/L)尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)尿酸(μmol/L)對照組626.48±5.62144.41±54.1350.62±9.975.72±0.6138.51±9.69244.38±61.67鎂合金植入組633.62±8.17146.40±37.2046.59±6.935.28±0.3239.29±2.87195.9±7.00 t值-1.767-0.0740.8131.565-0.1891.913P值0.3830.9620.6130.2930.8810.123正常參考范圍38.67～117.23108.01～340.2741.4～137.52.96～12.7240.30～84.12—

2.2 兩組大鼠全血金屬元素含量的比較 鎂合金植入組大鼠全血鎂、鋅含量略高于對照組，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)；兩組大鼠全血中均未檢出釔、釹、鋯元素。見表2。

表2 兩組大鼠全血金屬元素含量的比較(x±s，mg/L)

2.3 兩組大鼠臟器組織病理學(xué)的比較 鎂合金植入組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞呈放射狀排列，肝組織形態(tài)正常，無明顯病理變化；腎小球體積正常，腎小管無明顯病變，結(jié)構(gòu)清晰，上皮細(xì)胞大小一致，無增生，腎組織結(jié)構(gòu)無異常改變；脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，沒有明顯變化。兩組大鼠臟器組織病理學(xué)比較無明顯差異，見圖3。

圖3 兩組大鼠的臟器組織病理學(xué)切片(HE染色，×100)

2.4 鎂合金植入組大鼠植入物體內(nèi)降解情況 Micro CT掃描結(jié)果顯示，WE43鎂合金植入物植入股骨髁內(nèi)6個(gè)月后已發(fā)生體內(nèi)降解，WE43鎂合金植入物表面出現(xiàn)了明顯的降解性缺損(圖4A、圖4B)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)WE43鎂合金植入物周圍有明顯新骨質(zhì)生成(圖4C)；應(yīng)用測量軟件分析植入后的WE43鎂合金植入物體積，植入前WE43鎂合金植入物體積為(10.18±0.35)mm3，植入6個(gè)月后WE43鎂合金植入物體積為(7.65±0.56)mm3，WE43鎂合金植入物在大鼠體內(nèi)降解丟失了約25%的原始體積。

圖4 Micro CT掃描圖

3 討 論

WE43鎂合金是目前研究較多的可降解骨生物材料之一，利用其體內(nèi)降解性能制造出骨內(nèi)固定器械，可以避免患者二次手術(shù)，并可降低醫(yī)療費(fèi)用和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)[7-9]。血液檢驗(yàn)是生物相容性研究的重要工作之一，血液指標(biāo)的變化能夠較好地反映外科植入物可能對機(jī)體造成的不良影響。血常規(guī)能夠反映機(jī)體的生理、病理狀態(tài)，是臨床疾病診斷的主要檢查項(xiàng)目。由于動(dòng)物品種、檢測儀器、試劑盒、實(shí)驗(yàn)方法及動(dòng)物年齡等多個(gè)因素的影響，動(dòng)物血液指標(biāo)檢驗(yàn)結(jié)果差異較大[10-11]。Tie等[12]將鎂合金植入新西蘭大白兔股骨內(nèi)， 發(fā)現(xiàn)鎂合金的降解過程對大白兔的血液學(xué)指標(biāo)、心臟損傷和炎癥發(fā)生情況、肝功能、代謝過程等均無明顯影響。袁青領(lǐng)等[13]研究發(fā)現(xiàn)，將鎂鋅合金植入大鼠盲腸對其肝腎功能與電解質(zhì)無明顯影響，初步證實(shí)了鎂鋅合金的生物安全性。Wang等[14]將鎂合金植入慢性腎功能衰竭大鼠模型，結(jié)果顯示正常大鼠與慢性腎功能衰竭大鼠的血清、尿液、糞便和內(nèi)臟中的鎂含量均無明顯變化，這提示鎂合金植入也不會(huì)對腎功能衰竭大鼠造成額外的損傷。本研究中，鎂合金骨植入組大鼠的血常規(guī)與肝腎功能指標(biāo)雖然表現(xiàn)出部分變化，但與對照組大鼠比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，且大部分結(jié)果均在參考范圍內(nèi)[15-21]，這提示W(wǎng)E43鎂合金骨植入對大鼠血常規(guī)和肝腎功能指標(biāo)的影響較小，與上述研究結(jié)果類似。

全血金屬元素分析可以檢測鎂合金骨植入后在體內(nèi)降解過程中釋放入血中的金屬離子濃度水平，用電感耦合等離子體質(zhì)譜技術(shù)可以快速地分析血液中的痕量元素含量。鎂和鋅都是機(jī)體生存必需的元素之一，其中鎂元素還是骨組織代謝的元素之一[22]。研究表明，鎂合金有良好的骨誘導(dǎo)性,可促進(jìn)骨折愈合[23]。本研究植入的WE43鎂合金中含有一定含量的鎂元素和鋅元素，但植入6個(gè)月后，與對照組大鼠相比，鎂合金植入組大鼠全血中的鎂、鋅元素含量并沒有大幅升高，表明WE43鎂合金骨植入對大鼠全血中金屬元素含量水平影響較小，沒有出現(xiàn)WE43鎂合金降解后血液中金屬元素含量顯著升高的現(xiàn)象。分析原因可能為：植入物本身鎂、鋅的含量不高，WE43鎂合金植入物的質(zhì)量約為0.02 g,降解25%的釋放量約為5 mg，降解過程為6個(gè)月，降解時(shí)間較長，血液中的金屬元素含量少。此外，鎂、鋅元素可能隨汗液、尿液、糞便排出體外，從而達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。王義生等[24]認(rèn)為鎂離子降解后通過腎臟排出體外，且未對腎臟造成損害。本研究中未從大鼠血樣中檢出釔離子、釹離子和鋯離子，可能為WE43鎂合金在體內(nèi)降解緩慢，而釔、釹、鋯元素在合金中含量很低，降解后的離子被機(jī)體吸收后通過尿、糞排出體外，全血中釔、釹、鋯元素含量水平低于設(shè)備檢測線。

WE43鎂合金可以在體內(nèi)降解，降解產(chǎn)物須通過肝臟、腎臟等組織代謝排出體外，通過組織病理學(xué)觀察可以直觀地評估植入物降解可能對宿主器官產(chǎn)生的毒性損害。本研究結(jié)果顯示，WE43鎂合金骨植入6個(gè)月后，鎂合金骨植入組大鼠的肝臟、腎臟和脾臟組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯異常改變，表明鎂合金骨植入未對大鼠的肝臟、腎臟和脾臟造成明顯的病理損害。Holweg等[25]觀察鎂合金接骨螺釘內(nèi)固定用于綿羊骨折模型的效果，發(fā)現(xiàn)植入后12周綿羊的骨折完全愈合，認(rèn)為植入物的降解過程不影響骨折愈合。Oshibe等[26]在大鼠脛骨中植入0.3 mm×10 mm的WE43鎂合金柱體，在植入12個(gè)月時(shí)發(fā)現(xiàn)其體積損失為36%，植入物周圍骨成熟，板層骨結(jié)構(gòu)發(fā)育正常，這提示W(wǎng)E43鎂合金植入物在骨組織中具有良好的長期穩(wěn)定性和生物相容性。Byun等[27]采用Beagle犬截骨模型對WE43鎂合金骨板和螺釘?shù)男阅苓M(jìn)行評價(jià)，在植入4周時(shí)可觀察到植入物發(fā)生降解，在植入24周時(shí)可觀察到鎂板被吸收，以及在鎂板和螺釘周圍形成的新骨。本研究的Micro CT掃描結(jié)果顯示，在植入大鼠股骨髁內(nèi)6個(gè)月后WE43鎂合金植入物已發(fā)生明顯的體內(nèi)降解現(xiàn)象，其在大鼠體內(nèi)降解丟失約25%的原始體積，進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)鎂合金植入物周圍有明顯新骨質(zhì)生成。這提示W(wǎng)E43鎂合金骨植入后的體內(nèi)降解可能有利于骨折修復(fù)，但是其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，WE43鎂合金骨植入未對大鼠的血常規(guī)、肝腎功能與全血金屬元素含量造成明顯影響，也未對大鼠的肝臟、腎臟和脾臟造成明顯的病理損害，植入6個(gè)月后體內(nèi)降解丟失約25%的原始體積，具有良好的組織相容性，可能有利于骨折修復(fù)。由于本研究樣本量較少，觀察時(shí)間較短，且為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，WE43鎂合金長期骨植入并在體內(nèi)降解后的風(fēng)險(xiǎn)尚需進(jìn)一步觀察和評估。