曾 帆,吳田振,于振朋,孫林霞,郭天慧

(南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇省生物多樣性與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210023)

趨同進(jìn)化(convergent evolution)是進(jìn)化生物學(xué)的研究熱點(diǎn),是指親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種在自然選擇的作用下,為了適應(yīng)相似的生境而產(chǎn)生的相同或相似的表型、生理以及行為特征[1]. 盡管自然界中趨同進(jìn)化的例子很多,但是趨同進(jìn)化的分子機(jī)制研究還很少. 大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)和小熊貓(Ailurusfulgensstyani),親緣關(guān)系較遠(yuǎn),通過基因組的測定,鑒定了多個(gè)與肢體發(fā)育和蛋白消化相關(guān)的基因出現(xiàn)趨同信號(hào),為大、小熊貓演化出趨同的食竹食性以及具有抓握竹子的偽拇指提供了分子證據(jù)[2-3]. 蝙蝠和海豚在系統(tǒng)發(fā)生樹上相距甚遠(yuǎn),但均演化出回聲定位的能力,是趨同進(jìn)化的又一典型,近些年鑒定了與聽覺相關(guān)的基因在二者之間具有平行/趨同進(jìn)化位點(diǎn),且在Perestin基因的系統(tǒng)發(fā)育樹中聚在一起,為二者趨同進(jìn)化提供了很強(qiáng)的分子證據(jù)[4-5].

海洋哺乳動(dòng)物(marine mammals),也稱為“海獸”,是哺乳動(dòng)物中進(jìn)化十分獨(dú)特的類群,它們由不同的陸生祖先分別從陸地重返海洋,親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但為了適應(yīng)海洋環(huán)境,進(jìn)化出一系列趨同的表型和生理特征,是研究趨同進(jìn)化的理想模型. 它們都擁有與魚類類似的流線型體型以減少在水中游動(dòng)時(shí)的阻力[6];皮下脂肪層增厚用以保持體溫,減少溫度散失;滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)用以適應(yīng)高滲的海洋環(huán)境;儲(chǔ)氧能力提高用以增加在水中的屏息時(shí)長[7];骨密度的變化用以適應(yīng)不同的潛水深度[8]. 除此以外,海洋哺乳動(dòng)物普遍發(fā)生了味覺和嗅覺的喪失[9];鯨類和海牛發(fā)生了毛發(fā)的缺失[10],為趨同進(jìn)化的研究提供了理想的模型.

滲透調(diào)節(jié)是生境轉(zhuǎn)換后海洋哺乳動(dòng)物共同面臨的一個(gè)最主要的挑戰(zhàn). 形態(tài)學(xué)研究表明,許多海洋哺乳動(dòng)物的腎臟演化出復(fù)腎結(jié)構(gòu),如鯨類、鰭足類、北極熊和水獺擁有數(shù)十甚至上千個(gè)小腎,且每一個(gè)小腎在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理作用上都相當(dāng)于陸生哺乳動(dòng)物的獨(dú)立腎,以此增加了腎臟的表面積,提高了腎臟的排泄能力,為海洋哺乳動(dòng)物形成高濃度的濃縮尿提供了前提. 其中,完全營水生生活的鯨類的腎最為特殊,呈葡萄狀,小腎數(shù)目在種間差別很大,體型較大的須鯨可達(dá)6 000～7 000個(gè)[11-12],而體型較小的淡水豚類小腎一般僅有65～170個(gè)[13]. 前人研究發(fā)現(xiàn)鯨類尿液的滲透濃度以及Na+濃度均顯著高于大小與之相近或比之大的陸生哺乳動(dòng)物,如鯨類尿液中尿素濃度比牛高4倍[14],提示鯨類通過排高度濃縮的尿液以調(diào)節(jié)水鹽平衡. 然而,海洋哺乳動(dòng)物滲透調(diào)節(jié)的分子機(jī)制的研究才剛剛開始. 研究發(fā)現(xiàn)腎臟中與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的基因在海洋哺乳動(dòng)物中出現(xiàn)了高表達(dá)的現(xiàn)象[15],進(jìn)一步為海洋哺乳動(dòng)物具有高效的水鹽調(diào)節(jié)提供了分子證據(jù). Xu等發(fā)現(xiàn)許多與滲透調(diào)節(jié)相關(guān)的基因在鯨類譜系中顯著受正選擇作用,如水通道蛋白2(aquaporin2,AQP2)和尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(urea transporters,UTA)編碼基因SLC14A2顯著受到正選擇,提示鯨類可能通過增強(qiáng)對(duì)水和尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)以產(chǎn)生高濃縮的尿液,以此適應(yīng)高滲的海洋環(huán)境,進(jìn)一步證實(shí)鯨類產(chǎn)生濃縮尿是維持體內(nèi)水平衡的一個(gè)有效機(jī)制. 水鹽調(diào)節(jié)系統(tǒng)——腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)中兩個(gè)關(guān)鍵的成員管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)和管緊張素原(angiotensinogen,AGT)鑒定到多個(gè)正選擇位點(diǎn),特別是長江江豚中多個(gè)基因受正選擇,提示鯨類水鹽調(diào)節(jié)系統(tǒng)是維持滲透調(diào)節(jié)的又一重要機(jī)制[16-17].

尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Urea transporters)是特異性轉(zhuǎn)運(yùn)尿素的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,對(duì)機(jī)體的滲透調(diào)節(jié)起著關(guān)鍵性的作用[18]. 其中,UT-A是目前已克隆出的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族之一,共6個(gè)成員(UT-A1至UT-A6),由同一基因SLC14A2編碼并經(jīng)過不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄后剪接形成. 在UT-A亞家族的成員中,UT-A1、UT-A2、UT-A3和UT-A4均在腎臟中表達(dá),且SLC14A2基因敲除后尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)缺陷的小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的尿素濃縮功能缺陷,說明此基因在機(jī)體滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮了及其重要的作用[19-20]. 鯨類中該基因顯著受正選擇,提示鯨類通過提高尿素轉(zhuǎn)運(yùn)能力,從而增強(qiáng)了機(jī)體的水鹽調(diào)節(jié)功能. 然而,該基因在其他海洋哺乳動(dòng)物中的進(jìn)化以及是否與鯨類一樣具有趨同的排高濃縮尿液的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚. 據(jù)此,本研究下載了73個(gè)哺乳動(dòng)物的SLC14A2基因,運(yùn)用比較基因組學(xué)方法探討了以下科學(xué)問題:(1)滲透調(diào)節(jié)基因SLC14A2在海洋哺乳動(dòng)物不同類群中是否受到相似的選擇壓力?(2)海洋哺乳動(dòng)物間是否具有尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的趨同分子機(jī)制?

1 材料與方法

1.1 SLC14A2基因序列數(shù)據(jù)

本研究在哺乳動(dòng)物中選取了73個(gè)物種,涵蓋了15個(gè)目,其中海洋哺乳動(dòng)物包括鯨類25個(gè)代表性物種,鰭足類6個(gè)物種以及海牛類的1個(gè)物種(海牛).SLC14A2基因序列是在NCBI數(shù)據(jù)庫和OrthoMaM(Orthologous Mammalian Markers,http://orthomam2.mbb.univ-montp2.fr/OrthoMaM)數(shù)據(jù)庫中下載得到. 對(duì)于基因組尚未注釋的物種,通過本地BLAST,最終獲得了73個(gè)哺乳動(dòng)物SLC14A2基因的序列. 由于本地BLAST可能會(huì)造成相鄰?fù)怙@子拼接處存在非3倍數(shù)堿基的插入或缺失,所以采用了一系列針對(duì)于存在移碼突變的序列比對(duì)方法,運(yùn)用Macse軟件中的AlignSequence、Exportalignment程序、Hmmcleaner程序、Prank程序以及Gblocks程序,確定獲得序列為同源序列[21-23].

1.2 選擇壓力分析

氨基酸的非同義替代(non-synonymous substitution rate,dN)與同義替代(synonymous substitution rate,dS)的比值ω(dN/dS)常用作選擇壓力(selective pressure)的檢測指標(biāo)(Kimura,1979). 如果ω=1為中性選擇(neutral selection);ω>1為正選擇(positive selection);ω<1為純化選擇(negative selection). 由于影響功能基因的選擇作用往往都只是發(fā)生在一些特定的支系的特定位點(diǎn)上,因此,為了檢測海洋哺乳動(dòng)物進(jìn)化過程中經(jīng)歷了怎樣的選擇壓力,本研究采用了基于密碼子的最大似然法(maximum likelihood,ML)的PAML4.7軟件包中的codeML程序,檢測特定支系或者位點(diǎn)上所受的選擇壓力[24].

首先,僅針對(duì)33種海洋哺乳動(dòng)物SLC14A2基因序列的數(shù)據(jù)集,運(yùn)用位點(diǎn)模型(site modal)中的三對(duì)模型(M7vs M8、M8 vs M8a和M1a vs M2a)檢測正選擇位點(diǎn). 運(yùn)用似然率檢測法(likelihoodratio tests,LRTs)評(píng)估兩個(gè)模型之間是否存在顯著差異,計(jì)算2ΔL值與自由度之間的卡方分布情況,若P值<0.05,則認(rèn)為兩個(gè)模型之間存在顯著差異. 利用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯(bayes empirical bayes,BEB)方法計(jì)算M8和M2a模型中的正選擇位點(diǎn)的后驗(yàn)概率(Posterior probability),如果后驗(yàn)概率≥0.8,即認(rèn)為該位點(diǎn)是潛在的正選擇位點(diǎn)[25]. 另外,使用在線網(wǎng)站Datamonkey(http://www.datamonkey.org/)中的固定效應(yīng)似然法(fixed effects likelihood,FEL)進(jìn)一步檢測正選擇位點(diǎn),設(shè)置FEL顯著性水平小于0.2[26]. 同時(shí)被兩種ML方法檢測的位點(diǎn),為強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn).

其次,在所有哺乳動(dòng)物73個(gè)物種的SLC14A2基因序列的數(shù)據(jù)集中,選擇分支模型(branch model)和支位點(diǎn)模型(branch-site model)進(jìn)一步探究正選擇作用是否局限于某些特定的進(jìn)化譜系. 分支模型主要包括free ratio模型和two ratio模型. Free ratio模型允許系統(tǒng)發(fā)育樹上每一個(gè)進(jìn)化譜系具有不同的ω值,而Two ratio模型允許前景支(即所感興趣的支系)與背景支之間存在不同的ω值. 運(yùn)用LRT分別檢測Free ratio和Two ratio模型與零假設(shè)one ratio模型(即假設(shè)系統(tǒng)發(fā)生樹上所有支系具有相同的ω值)是否差異顯著. 如果模型顯著,則通過Free ratio檢測ω>1的正選擇支系,運(yùn)用Two ratio模型檢測前景支海洋哺乳動(dòng)物是否出現(xiàn)加速進(jìn)化. 此外,進(jìn)一步運(yùn)用更加嚴(yán)格的分支位點(diǎn)模型(Ma)分析,該模型允許在特定支上的每一個(gè)位點(diǎn)都有獨(dú)立的ω值,將進(jìn)化譜系分為前景枝(foreground,即感興趣的枝系)和背景枝(background),使用LRT對(duì)備擇假設(shè)Ma(正選擇模型:0<ω0<1,ω1>1和ω2≥1)和零假設(shè)Ma0(中性模型:0<ω0<1,ω1=1和ω2=1)進(jìn)行比較. 當(dāng)成對(duì)模型(Ma vs Ma0)差異顯著且ω>1時(shí),接受正選擇模型Ma,且所檢測的位點(diǎn)P>0.8時(shí),被認(rèn)為是強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn). 衡量枝位點(diǎn)模型顯著性的P值則通過多重檢驗(yàn)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate,FDR)予以矯正,校正后的P<0.05時(shí)則為模型顯著.

1.3 海洋哺乳動(dòng)物SLC14A2基因平行/趨同位點(diǎn)檢測

為了驗(yàn)證海洋哺乳動(dòng)物在二次入水過程中,是否發(fā)生了趨同進(jìn)化,本研究使用PAMLv4.7中Codeml程序?qū)γ總€(gè)基因進(jìn)行祖先序列重建. 通過對(duì)海洋哺乳動(dòng)物各枝系中尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸的序列分析,尋找趨同氨基酸替代,得到海洋哺乳動(dòng)物支系間從祖先到現(xiàn)生氨基酸變化. 根據(jù)預(yù)測的祖先位點(diǎn)的差異,編碼區(qū)基因序列的氨基酸替換事件分為平行替換和趨同替換兩種模式. 如果兩個(gè)進(jìn)化枝具有相同的祖先氨基酸狀態(tài),并衍生出相同的現(xiàn)生氨基酸,便認(rèn)為該位點(diǎn)為平行替換位點(diǎn);反之,如果兩個(gè)進(jìn)化枝具有不同的祖先氨基酸狀態(tài),并衍生出相同的現(xiàn)生氨基酸,則為趨同替換位點(diǎn),這兩種模式都被認(rèn)為是海洋哺乳動(dòng)物趨同進(jìn)化的證據(jù). 考慮到偶然氨基酸替代引起的干擾,本研究在JTT-fgen氨基酸替換模型下進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),比較實(shí)際觀察到的趨同位點(diǎn)數(shù)目與隨機(jī)期望出現(xiàn)的趨同位點(diǎn)數(shù). 若觀測值大于期望值,則認(rèn)為存在氨基酸趨同或平行替換;反之,則不存在[27].

1.4 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)

位于關(guān)鍵區(qū)域的氨基酸改變可能會(huì)通過影響構(gòu)型,進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的功能產(chǎn)生影響. 為深入探究這些正選擇位點(diǎn)是否位于重要的功能域,本研究使用印太瓶鼻海豚(Tursiopsaduncus)SLC14A2基因的核苷酸序列在I-TASSER網(wǎng)站上(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)進(jìn)行了蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測,并將檢測到的正選擇位點(diǎn)用PyMOL軟件(http://pymol.sourceforge.net/)定位到了其空間結(jié)構(gòu)中. 使用uniprot網(wǎng)站(http://www.uniprot.org/)查閱獲取更多功能域的信息.

2 結(jié)果與討論

2.1 選擇壓力分析

首先,運(yùn)用位點(diǎn)模型對(duì)33個(gè)海洋哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)集進(jìn)行選擇壓力分析,LRTs結(jié)果顯示在SLC14A2基因中正選擇模型M8顯著優(yōu)于中性模型M7和M8a(P<0.001),且ω=1.955,提示這個(gè)基因顯著受正選擇作用. 然后,在M8模型中,使用BEB方法在SLC14A2基因中鑒定到了9個(gè)顯著受到正選擇的位點(diǎn)(35、462、463、467、468、469、470、512、741)且后驗(yàn)概率均大于0.8. 位點(diǎn)模型中的M1a vs. M2a較M8 vs. M8a模型所得到的結(jié)果更為穩(wěn)定,因此又使用前者進(jìn)一步檢測,結(jié)果表明M2a(ω=6.517)模型明顯優(yōu)于M1a模型(P<0.001),并鑒定了2個(gè)正選擇的位點(diǎn)(35、463),這兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)也被M8模型鑒定到(表1). 另外,進(jìn)一步使用DataMonkey中的FEL模型鑒定了4個(gè)正選擇位點(diǎn)(35、90、276、735). 綜合以上3種ML方法,共有 2個(gè)位點(diǎn)(35、463)至少被兩種以上ML方法鑒定到,認(rèn)為是強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn)(表1).

其次,為了檢測SLC14A2基因受到的正選擇是否局限于特定的進(jìn)化譜系,在所有哺乳動(dòng)物譜系73個(gè)物種中,LRT檢測發(fā)現(xiàn)free ratio模型顯著優(yōu)于one ratio模型(P<0.001),且在鯨類的多個(gè)支系中檢測到顯著的正選擇信號(hào),即須鯨類的共同祖先支、瓶鼻海豚和印太瓶鼻海豚最近共同祖先以及鼠海豚和小頭鼠海豚共同祖先(ω>1,P<0.001),而在其他海洋哺乳動(dòng)物類群以及陸生哺乳動(dòng)物中均沒有鑒定出顯著的正選擇. 另外,以32種海洋哺乳動(dòng)物作為前景支(ω=0.17211),其他陸生哺乳動(dòng)物為背景支(ω=0.13012),運(yùn)用two ratio模型檢測發(fā)現(xiàn)SLC14A2基因在海洋哺乳動(dòng)物支系具有顯著的加速進(jìn)化(P<0.001)(圖1).

由于分支模型和位點(diǎn)模型并不能同時(shí)考慮位點(diǎn)和支系發(fā)生的正選擇作用,因此進(jìn)一步采用了更為嚴(yán)格的支位點(diǎn)模型檢測選擇壓力. 結(jié)果在小須鯨鑒定到顯著的正選擇,且鑒定了2個(gè)顯著的正選擇位點(diǎn)(592、598,表1). 綜合M8、M2a、FEL以及支位點(diǎn)模型的方法,共有4個(gè)正選擇位點(diǎn)(35、463、592、598)被認(rèn)為是強(qiáng)烈的正選擇位點(diǎn).

表1 在海洋哺乳動(dòng)物中用兩種ML方法檢測到的正選擇位點(diǎn)Table 1 Positively selected sites detected using two maximum likelihood(ML)methods across cetacean phylogeny

2.2 海洋哺乳動(dòng)物SLC14A2基因特異氨基酸突變位點(diǎn)和平行/趨同進(jìn)化分析

為了探究海洋哺乳動(dòng)物適應(yīng)高滲的海洋環(huán)境是否進(jìn)化出了特異位點(diǎn),對(duì)SLC14A2基因進(jìn)行掃描后發(fā)現(xiàn)海洋哺乳動(dòng)物具有11個(gè)特異的氨基酸突變位點(diǎn). 其中,鯨類具有5個(gè)特異突變位點(diǎn)(Y14H、T398A、L455H、Q485R、A707S);鰭足類具有6個(gè)特異突變位點(diǎn)(G64T、S99G、T111S、K518M、A527T、S529H,圖1),其中第398、707位氨基酸位于尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域中,提示海洋哺乳動(dòng)物可能通過尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白特異的氨基酸突變,提高機(jī)體在高滲環(huán)境下的適應(yīng)能力.

進(jìn)一步檢測SLC14A2基因在海洋哺乳動(dòng)物類群間是否存在趨同的分子機(jī)制,重建了該基因的祖先序列,并進(jìn)行非同義平行/趨同氨基酸位點(diǎn)檢測,鑒定了6個(gè)平行替換位點(diǎn)在海洋哺乳動(dòng)物類群間表現(xiàn)出顯著的趨同進(jìn)化信號(hào). 如圖1所示,在鯨類譜系中鑒定了2個(gè)平行替換位點(diǎn)(L20S、R532S),如在20位氨基酸位點(diǎn)處具有一個(gè)平行氨基酸替代,中華白海豚的最近共同祖先支(n)與白鯨和一角鯨最近共同祖先支(v)均為絲氨酸(S),而其他哺乳動(dòng)物支系均為亮氨酸(L). 在鯨類和鰭足類兩個(gè)海洋哺乳動(dòng)物類群中共鑒定了4個(gè)平行替換位點(diǎn)(H1P、A219V、L508T、H814I),例如在第1位氨基酸位點(diǎn)處具有一個(gè)平行氨基酸替代,本研究中使用的鰭足類所有物種和抹香鯨(Physetercatodon)支系均為P,而其他哺乳動(dòng)物物種此位點(diǎn)為H;在219位點(diǎn)處,小須鯨(Balaenopteraacutorostrata)和夏威夷僧海豹(Neomonachusschauinslandi)鑒定了1個(gè)平行氨基酸替代(A219V). 這些位點(diǎn)經(jīng)過JTT-fgen氨基酸替換模型統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn),觀測值大于期望值,表明檢測到的位點(diǎn)是可靠的平行/趨同氨基酸替代位點(diǎn).

不同海洋哺乳動(dòng)物類群之間鑒定到的平行/趨同氨基酸提示為了適應(yīng)共同的高滲環(huán)境海洋哺乳動(dòng)物可能進(jìn)化出了趨同的尿素轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,其中第219和814位氨基酸位點(diǎn)位于尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白重要的跨膜結(jié)構(gòu)域,因此海洋哺乳動(dòng)物可能通過跨膜結(jié)構(gòu)域的改變,增強(qiáng)了對(duì)尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,從而對(duì)機(jī)體的水鹽平衡進(jìn)行調(diào)控.

Free-ratio和支位點(diǎn)模型鑒定的正選擇分別用紅線和紅五星標(biāo)注. 右側(cè)為SLC14A2基因在海洋哺乳動(dòng)物中檢測到的特異氨基酸位點(diǎn)(黃色)和平行/趨同位點(diǎn)(藍(lán)色). 字母表示祖先枝. 作為外群的陸生哺乳動(dòng)物包括鯨偶蹄目、食肉目、嚙齒目等.圖1 Free-ratio和支位點(diǎn)模型鑒定的海洋哺乳動(dòng)物SLC14A2基因的正選擇Fig.1 Evidence of positive selection across the phylogeny of marine mammals identified by free-ratio and branch-site models in SLC14A2 gene

強(qiáng)烈正選擇位點(diǎn)和位于跨膜結(jié)構(gòu)域的特異氨基酸位點(diǎn)分別用紫色和藍(lán)色圓球表示.圖2 SLC14A2蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)Fig.2 The three-dimensional structure of the SLC14A2 protein

2.3 SLC14A2基因三維結(jié)構(gòu)分析

印太瓶鼻海豚(T.aduncus)的SLC14A2基因核苷酸序列在I-TASSER網(wǎng)站上(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)進(jìn)行了蛋白三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測,并運(yùn)用PyMOL軟件(http://pymol.sourceforge.net/)將強(qiáng)烈正選擇位點(diǎn)和重要的特異氨基酸突變定位到3D結(jié)構(gòu)中(圖2). 這些位點(diǎn)大多位于重要的結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域附近,如第463位正選擇位點(diǎn)位于蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)S490附近;第35位正選擇位點(diǎn)位于蛋白的極性氨基酸(polar amino acid)區(qū)域,此區(qū)域使得此段蛋白穩(wěn)定位于膜外,同時(shí)此位點(diǎn)也與蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)S26鄰近[28],提示正選擇位點(diǎn)可能與蛋白尿素轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān). 另外,第398、707位特異氨基酸位點(diǎn)存在于蛋白重要的跨膜結(jié)構(gòu)域. 跨膜結(jié)構(gòu)域的改變通常與通道蛋白開放時(shí)間和轉(zhuǎn)運(yùn)效率密切相聯(lián)系[29-30]. 因此海洋哺乳動(dòng)物可能通過跨膜結(jié)構(gòu)域的改變,增強(qiáng)了對(duì)尿素的轉(zhuǎn)運(yùn)能力,從而對(duì)機(jī)體的水鹽平衡進(jìn)行調(diào)控.

3 結(jié)論

趨同進(jìn)化是進(jìn)化生物學(xué)中的核心科學(xué)問題. 海洋哺乳動(dòng)物不同類群是獨(dú)立起源的,由不同的陸生祖先演化而來,親緣關(guān)系相距甚遠(yuǎn). 但是,為了適應(yīng)高滲的海洋環(huán)境,海洋哺乳動(dòng)物產(chǎn)生了趨同的滲透調(diào)節(jié)適應(yīng)機(jī)制,具有很強(qiáng)的排鹽保水能力,且能夠產(chǎn)生高度濃縮的尿液. 先前的解剖學(xué)證據(jù)表明海洋哺乳動(dòng)物具有復(fù)腎結(jié)構(gòu),通過增加腎臟表面積以提高腎臟的排泄能力[11-12],為海洋哺乳動(dòng)物形成高濃度的濃縮尿提供了前提. 本研究發(fā)現(xiàn)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)基因——SLC14A2在海洋哺乳動(dòng)物發(fā)生了顯著的加速進(jìn)化(P<0.001),且有2個(gè)正選擇位點(diǎn)至少被兩種ML方法檢測到,這兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)都位于蛋白激酶C的磷酸化位點(diǎn)附近,推測與蛋白尿素轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān). 因?yàn)楦邼B透的內(nèi)環(huán)境主要通過蛋白激酶C介導(dǎo)增加 UT-A1 和UT-A1A3的磷酸化,從而增強(qiáng)尿素的轉(zhuǎn)運(yùn),且已有研究證實(shí)敲除SLC14A2基因則出現(xiàn)不能濃縮尿液的生理缺陷[19]. 因此本研究在海洋哺乳動(dòng)物中鑒定的加速進(jìn)化和正選擇,提示可能增強(qiáng)了尿素轉(zhuǎn)運(yùn)能力從而維持了極高的滲透壓以濃縮尿液,為海洋哺乳動(dòng)物產(chǎn)生高濃縮尿液提供了分子證據(jù). 另外,本研究通過對(duì)73個(gè)物種的SLC14A2基因進(jìn)行比較,在鯨類和鰭足類中共鑒定出11個(gè)特異的氨基酸位點(diǎn),其中2個(gè)氨基酸位于蛋白質(zhì)重要的功能結(jié)構(gòu)域,提示海洋哺乳動(dòng)物可能通過這些氨基酸突變使尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白功能發(fā)生適應(yīng)性的改變,從而增強(qiáng)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)能力以適應(yīng)高滲的海洋環(huán)境. 特別重要的是,在海洋哺乳動(dòng)物三個(gè)類群間鑒定了6個(gè)平行/趨同進(jìn)化位點(diǎn),且其中兩個(gè)位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域中,有研究表明跨膜結(jié)構(gòu)域中單個(gè)氨基酸的改變即可改變通道蛋白的動(dòng)力學(xué)和滲透特性[29-30]. 因此,推測海洋哺乳動(dòng)物可能通過改變跨膜結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響通道蛋白打開的時(shí)間和尿素轉(zhuǎn)運(yùn)的效率,進(jìn)一步為海洋哺乳動(dòng)物尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要功能以產(chǎn)生高度濃縮的尿液提供趨同的分子證據(jù).

特別需要指出的是,用free-ratio模型和更嚴(yán)格的支位點(diǎn)模型鑒定的正選擇均發(fā)生在鯨類譜系,可能與鯨類完全營水生生活面臨較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)壓力有關(guān). 之前生理學(xué)研究表明,鯨類尿液中尿素濃度比其近緣的陸生哺乳動(dòng)物——牛高4倍[14],說明鯨類通過排高度濃縮的尿液以調(diào)節(jié)水鹽平衡. 鯨類SLC14A2顯著的正選擇進(jìn)一步證實(shí)鯨類通過增強(qiáng)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)以產(chǎn)生高度濃縮的尿液. 另外,比較基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)也在長江淡水江豚和海生江豚中分別鑒定了與尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SLC14A2、ACE相關(guān)基因的特異的SNP,且發(fā)現(xiàn)兩類江豚存在SLC14A2基因的表達(dá)差異,進(jìn)一步為海生江豚產(chǎn)生高濃縮尿液(東亞江豚尿液:(74.96±20.06)mmol/L;長江江豚(40.7±15.78)mmol/L)提供了分子證據(jù)[17]. 先前研究已經(jīng)證實(shí)水通道蛋白AQP2在鯨類中顯著受正選擇,AQP2基因的表達(dá)定位于腎臟的集合管,通過主動(dòng)運(yùn)輸對(duì)水分進(jìn)行重吸收,該基因顯著的正選擇提示鯨類可能通過增強(qiáng)水通道蛋白的功能而增強(qiáng)集合管對(duì)水的重吸收的能力,進(jìn)一步為產(chǎn)生高度濃縮尿液提供了分子證據(jù). 滲透調(diào)節(jié)是一個(gè)綜合調(diào)控的過程,腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在哺乳動(dòng)物水鹽代謝調(diào)節(jié)中起重要作用. 該系統(tǒng)中關(guān)鍵基因血管緊張素轉(zhuǎn)化酶ACE和血管緊張素原AGT在多個(gè)研究中均證實(shí)鯨類譜系顯著受正選擇[16-17],表明鯨類可能還通過RAAS調(diào)節(jié)系統(tǒng)更高效地維持鯨類的水鹽平衡.

綜上,本研究通過對(duì)尿素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因SLC14A2在海洋哺乳動(dòng)物中的進(jìn)化分析,揭示海洋哺乳動(dòng)物SLC14A2基因的進(jìn)化與滲透調(diào)節(jié)機(jī)制的關(guān)系. 分析結(jié)果表明海洋哺乳動(dòng)物類群間SLC14A2基因的加速進(jìn)化、正選擇位點(diǎn)以及平行/趨同位點(diǎn)的鑒定,均為海洋哺乳動(dòng)物趨同的產(chǎn)生高度濃縮尿液以保水提供了分子證據(jù). 另外,正選擇主要集中在鯨類進(jìn)化譜系,可能與鯨類完全營水生生活面臨更大的滲透調(diào)節(jié)的壓力有關(guān). 當(dāng)然,SLC14A2基因在海洋哺乳動(dòng)物中滲透調(diào)節(jié)的具體功能,將來還需要進(jìn)一步的功能驗(yàn)證,以揭示該基因與滲透調(diào)節(jié)的關(guān)系.