杜巖，姜文凱，李昕，周文策，2

（1.蘭州大學(xué) 第一臨床學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 普外科，蘭州 730030）

胰腺癌是一種侵襲性和致命性很高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。胰腺導(dǎo)管腺癌是最常見的類型，占所有胰腺癌病例的95%[2]。大多數(shù)胰腺癌患者被診斷時(shí)已經(jīng)是晚期階段，因此只有15%～20%的胰腺癌患者可以接受手術(shù)[3]。此外，胰腺癌即使在根治性切除后仍有很高的復(fù)發(fā)率[1]。因此，探究胰腺癌的發(fā)病機(jī)制以及尋找用于早期診斷的生物標(biāo)記物對(duì)優(yōu)化臨床治療、改善患者預(yù)后有十分重要的意義。

Karyopherin alpha（KPNA）是一組通過結(jié)合核定位信號(hào)分子來介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄因子穿梭運(yùn)動(dòng)的受體蛋白，KPNA4是其中發(fā)揮關(guān)鍵作用的成員之一，既往的研究顯示KPNA4與多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，例如在肺癌中，過表達(dá)的lncRNA MCM3AP-AS1通過靶向關(guān)鍵的miR-340-5p/KPNA4 軸，促進(jìn)肺癌的血管生成和腫瘤進(jìn)展[4]；肝癌中KPNA4在mRNA和蛋白水平高表達(dá)，具有診斷和預(yù)后的價(jià)值[5]。但是KPNA4在胰腺癌中發(fā)揮的作用尚不清楚。在本研究中，我們利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)和臨床數(shù)據(jù)分析了KPNA4在胰腺癌組織中的表達(dá)差異以及預(yù)后價(jià)值，并進(jìn)一步探討了KPNA4在胰腺癌中潛在的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)的下載

從基因型和基因表達(dá)（Genotype-Tissue Expression，GTEx）數(shù)據(jù)庫(kù)中提取167例正常胰腺組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[6]。從人類癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中提取178例胰腺癌組織和4例正常胰腺組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[7]。之前的研究表明，可以合并TCGA和GTEx的數(shù)據(jù)用于基因的差異表達(dá)分析[8]。從高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Expression Omnibus，GEO）中提取芯片表達(dá)數(shù)據(jù)[9]，GEO數(shù)據(jù)庫(kù)芯片ID分別是GSE28735、GSE62165、GSE15471。

1.2 臨床數(shù)據(jù)的下載

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中提取所有胰腺癌患者的臨床資料，選取其中臨床數(shù)據(jù)和生存信息完整的165 個(gè)樣本用于分析KPNA4表達(dá)與臨床指標(biāo)的相關(guān)性。將收集的臨床基線資料均轉(zhuǎn)換為等級(jí)資料，包括年齡（≥60歲vs＜60歲）、性別、惡性腫瘤病史、手術(shù)方式、腫瘤病理分級(jí)（G1/2vsG3/4）、腫瘤TNM分期（T1/2vsT3/4）、腫瘤臨床分期（Ⅰ/Ⅱ期vsⅢ/Ⅳ期）。收集患者的隨訪時(shí)間和隨訪狀態(tài)用于生存相關(guān)的分析。

1.3 本單位臨床樣本收集

從生物樣本庫(kù)中獲取2021年1 月至2022年1 月在蘭州大學(xué)第一醫(yī)院接受胰腺癌手術(shù)治療的42例腫瘤組織樣本和42 例匹配癌旁組織的石蠟包埋組織。所有的患者術(shù)后病理確診為胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌，均未接受化療或放射性治療。所有患者簽署書面知情同意書，方案由蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.4 評(píng)估KPNA4蛋白表達(dá)

按照供應(yīng)商的說明，KPNA4 抗體（proteintech 1∶500）用于PAP法免疫組化。免疫組化結(jié)果的半定量評(píng)估基于陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色的強(qiáng)度，由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科專家通過觀察完成。陽(yáng)性細(xì)胞百分比（EXT）分為4 級(jí)：0、1（＜10%）、2（10%～50%）、3（＞50%）。染色強(qiáng)度（INT）分為4級(jí)：0（無染色）、1（黃色）、2（黃褐色）、3（褐色）。相對(duì)表達(dá)指數(shù)按公式計(jì)算：（EXT×INT）。評(píng)分分?jǐn)?shù)＜4為低表達(dá)，評(píng)分分?jǐn)?shù)≥4為高表達(dá)。

1.5 獲取KPNA4關(guān)聯(lián)基因

Linked Omics是基于TCGA的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包括了多種常見惡性腫瘤的測(cè)序數(shù)據(jù)[10]。LinkedOmics數(shù)據(jù)庫(kù)包含多種分析功能：其中LinkFinder模塊通過相關(guān)性分析得到單基因的關(guān)聯(lián)基因集，LinkInterpreter模塊通過對(duì)關(guān)聯(lián)基因集的富集分析來預(yù)測(cè)目標(biāo)基因的生物學(xué)功能。我們通過LinkedOmics中的胰腺癌表達(dá)譜數(shù)據(jù)，獲取了與KPNA4 表達(dá)量有關(guān)聯(lián)的基因列表，并進(jìn)一步進(jìn)行了功能分析。

1.6 基因富集分析

基因本體論（Gene Ontology，GO）可以提取基因集的顯著生物學(xué)功能。生物過程（biological processes，BP），細(xì)胞成分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）是GO分析最重要的三個(gè)組成。京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）可以評(píng)估基因組所參與的生物學(xué)過程和細(xì)胞通路。通過ClusterProfiler R包進(jìn)行KPNA4關(guān)聯(lián)基因的GO分析和KEGG分析，ggplot2 R包用于結(jié)果的可視化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 22.0 軟件用于統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料使用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較；分類變量的組間比較使用卡方檢驗(yàn)；Spearman分析用于臨床變量和KPNA4 表達(dá)量的相關(guān)性分析；Cox回歸模型用于分析臨床變量和KPNA4 對(duì)胰腺癌患者的預(yù)后意義；Kaplan-Meier生存曲線用于分析KPNA4與患者總生存期的關(guān)系。使用GraphPad Prism 7和R 3.6.0軟件進(jìn)行圖形繪制。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA胰腺癌組織中KPNA4高表達(dá)

通過比較178 例胰腺癌組織和171 例胰腺正常組織，結(jié)果顯示KPNA4 mRNA水平在胰腺癌組織中顯著高表達(dá)[（3.486±0.337）vs（2.122±0.353），圖1A]。從GEO數(shù)據(jù)中獲取KPNA4 的芯片表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證這一結(jié)果。GSE28735 芯片中，KPNA4 在腫瘤組的mRNA表達(dá)量高于正常組[（5.899±0.329）vs（5.675±0.359），圖1B]；GSE15471芯片也得到了相似結(jié)果[（6.856±0.548）vs（6.100±0.829），圖1C]；GSE62165 芯片中，KPNA4 在腫瘤組mRNA的表達(dá)量也高于正常組[（8.311±0.314）vs（7.632±0.151），圖1D]。

圖1 數(shù)據(jù)庫(kù)中KPNA4在胰腺正常組織和胰腺癌組織的表達(dá)水平

2.2 TCGA胰腺癌數(shù)據(jù)中KPNA4 mRNA表達(dá)與TN分期相關(guān)

提取TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床信息完整的165 個(gè)胰腺癌樣本進(jìn)行分析，按照KPNA4 mRNA表達(dá)量的均值將所有樣本分為KPNA4高表達(dá)組和KPNA4低表達(dá)組。通過比較兩組間的臨床基線資料發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)組患者的腫瘤T分期和N分期均高于低表達(dá)組患者（P＜0.05），而其他臨床變量的組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），如表1所示。通過Spearman分析進(jìn)一步評(píng)估KPNA4 mRNA表達(dá)量與T分期和N分期的相關(guān)性，結(jié)果顯示T分期（r=0.261，P＜0.001）和N分期（r=0.193，P＜0.05）均和KPNA4 mRNA表達(dá)正相關(guān)，如表2 所示。這些結(jié)果提示，KPNA4 可能與胰腺癌的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表1 胰腺癌患者臨床基線資料和KPNA4 mRNA表達(dá)量[例(%)]

表2 胰腺癌患者臨床基線資料與KPNA4表達(dá)量的相關(guān)性

2.3 本院臨床樣本驗(yàn)證KPNA4的表達(dá)水平

為了進(jìn)一步驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)中的結(jié)論，我們采用免疫組化檢測(cè)了42例胰腺癌組織和42例匹配癌旁組織中KPNA4的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在42例胰腺癌組織中，KPNA4蛋白表達(dá)水平上調(diào)（高表達(dá)29例，69%），而在42 例匹配癌旁組織中KPNA4 蛋白表達(dá)水平下調(diào)（高表達(dá)18例，42.9%）。與癌旁組織相比，胰腺癌組織中KPNA4的蛋白表達(dá)水平異常上調(diào)（χ2=5.845，P＜0.05，如圖2）。

圖2 本院臨床樣本胰腺癌組織和癌旁組織中KPNA4的表達(dá)

2.4 KPNA4關(guān)聯(lián)基因的功能分析

通過LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取胰腺癌中與KPNA4 mRNA表達(dá)相關(guān)的基因集，符合相關(guān)系數(shù)≥0.5 和P＜0.05 的基因定義為KPNA4 關(guān)聯(lián)基因（n=886個(gè)）。GO分析的結(jié)果如圖3A所示，關(guān)聯(lián)基因的功能主要富集在細(xì)胞增殖過程和蛋白激酶活性。KEGG的結(jié)果如圖3B所示，關(guān)聯(lián)基因參與了多種類型的腫瘤通路，包括胰腺癌、肺癌、前列腺癌等；還參與了一些和腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的通路，例如肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)、PI3K-Akt信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路等。GSEA分析進(jìn)一步評(píng)估KPNA4對(duì)于腫瘤通路的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果顯示高表達(dá)的KPNA4促進(jìn)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、TGF-β信號(hào)通路、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）受體相互作用等與腫瘤密切相關(guān)的通路，如圖4。這些結(jié)果提示，KPNA4 可能通過參與多種腫瘤相關(guān)的生物學(xué)過程從而促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展。

圖3 KPNA4關(guān)聯(lián)基因的GO分析（A）和KEGG分析（B）

圖4 KPNA4關(guān)聯(lián)基因的GSEA分析

2.5 KPNA4與患者的不良預(yù)后有關(guān)

通過Cox單因素分析評(píng)估臨床基線資料和KPNA4 mRNA表達(dá)量對(duì)于胰腺癌患者的預(yù)后意義，結(jié)果顯示，患者接受的手術(shù)方式、腫瘤N分期和KPNA4是影響患者生存時(shí)間的因素（如表2）。將單因素變量納入Cox多因素分析，結(jié)果顯示，手術(shù)方式、腫瘤N分期和KPNA4 mRNA是胰腺癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素（如表3）。Kaplan-Meier生存曲線用于評(píng)估KPNA4高表達(dá)組和KPNA4低表達(dá)組之間患者總生存時(shí)間的差異，結(jié)果顯示，高表達(dá)組的總生存時(shí)間顯著少于低表達(dá)組（如圖5）。

圖5 不同KPNA4 mRNA表達(dá)水平的患者Kaplan-Meier生存曲線圖

表3 胰腺癌不良預(yù)后相關(guān)因素的Cox回歸分析

3 討論

胰腺癌是最致命的惡性腫瘤之一，尋找潛在的生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)可以為胰腺癌的治療提供新的角度[11]。最近的研究報(bào)道了一些胰腺癌潛在的生物標(biāo)記物。外泌體ZIP4 可以顯著促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展，并且血清外泌體ZIP4是新的診斷生物標(biāo)記物[12]。胰腺癌患者的血漿EVL水平下調(diào)，是與患者預(yù)后相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物[13]。另外，研究發(fā)現(xiàn)ZMAT1-SIRT3-p53 信號(hào)通路在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且ZMAT1 作為一種腫瘤抑制因子也是胰腺癌的新型生物標(biāo)記物[14]。在本研究中，通過TCGA、GTEx和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的聯(lián)合分析以及本院臨床樣本，尋找與胰腺癌患者預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)記物。

KPNA4是核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員，在介導(dǎo)細(xì)胞成分運(yùn)輸?shù)倪^程中發(fā)揮作用。KPNA4在小細(xì)胞肺癌、肝癌、甲狀腺癌、卵巢癌、骨肉瘤中均有異常表達(dá)，涉及到腫瘤的增殖和侵襲、遷移機(jī)制[5，15-18]。但是關(guān)于KPNA4在胰腺癌功能和臨床價(jià)值的研究較少。本研究的結(jié)果顯示，KPNA4的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平在胰腺癌組織中上調(diào)，這與KPNA在其他類型腫瘤中的表達(dá)趨勢(shì)一致。KPNA4的mRNA表達(dá)水平與胰腺癌患者的腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且高表達(dá)KPNA4 組的患者預(yù)后不良，Cox多因素分析提示KPNA4是胰腺癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。Feng等[16]報(bào)道KPNA4 的mRNA和蛋白在乳頭狀甲狀腺癌的腫瘤組織和細(xì)胞中均高表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤大小、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。肝細(xì)胞癌組織的KPNA4表達(dá)在mRNA和蛋白水平均高于正常組織，并且高表達(dá)KPNA4的肝癌患者具有較高的腫瘤分期和組織分級(jí)，同時(shí)也是不良預(yù)后的獨(dú)立影響因素[5]。由此可見，KPNA4在胰腺癌中扮演癌基因的角色，可為胰腺癌的早期診斷提供重要的支持證據(jù)。

Hu等[19]提出KPNA4 可以介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路中p65和p50二聚體的入核轉(zhuǎn)運(yùn)，而lncRNA ST7-AS1通過結(jié)合miR-181b-5p從而抑制KPNA4在肺癌中的促癌作用。在膠質(zhì)瘤中，miR-181b通過阻斷KPNA4表達(dá)來抑制腫瘤的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換，從而限制膠質(zhì)瘤在體內(nèi)和體外的侵襲能力[20]。另外，KPNA4 還通過介導(dǎo)p53的核轉(zhuǎn)運(yùn)，參與了白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制[21]。KPNA4在胰腺癌中發(fā)揮的功能尚不明確，我們通過功能富集分析，顯示KPNA4 可以激活與胰腺癌相關(guān)的多種通路，包括肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、TGF-β信號(hào)通路和ECM-受體相互作用。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的關(guān)鍵下游環(huán)節(jié)，EMT通過改變肌動(dòng)蛋白的形態(tài)導(dǎo)致細(xì)胞骨架重塑，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的前期準(zhǔn)備[22]。TGF-β信號(hào)通路和ECM-受體信號(hào)通路在胰腺癌中也發(fā)揮著重要的促癌作用[23-24]，這些富集分析的結(jié)果提示KPNA4可能參與了胰腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制。

綜上所述，KPNA4 在胰腺癌組織中高度表達(dá)，是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。KPNA4 可能通過多種腫瘤相關(guān)的信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展，表現(xiàn)出癌基因的特征，是潛在的預(yù)后生物標(biāo)記物。但是本研究尚有不足之處：KPNA4在胰腺癌mRNA水平的差異表達(dá)和和預(yù)后價(jià)值雖然得到多組數(shù)據(jù)庫(kù)隊(duì)列的支持，但是沒有使用本院樣本進(jìn)行驗(yàn)證。關(guān)于KPNA4功能富集分析的結(jié)果具有局限性，我們將基于試驗(yàn)進(jìn)一步闡述KPNA4的作用機(jī)制。