羅 倩,吳祖芳,翁佩芳

（寧波大學 食品與藥學學院,浙江 寧波 315832）

水蜜桃(Prunus persica)色澤鮮艷,營養(yǎng)豐富,屬呼吸躍變型水果,極易變軟腐爛[1],將其加工為水蜜桃酒,在延長貨架期的同時,能夠最大限度保留其水分載體,是一種較為理想的加工方式.果酒發(fā)酵是很復雜的生化過程,易受多種因素影響,如酵母菌種類、原料種類[2]、接種方式等.酵母菌生長代謝過程中產(chǎn)生的一系列風味物質在果酒風味方面起著關鍵性作用[3].但由于釀酒酵母發(fā)酵能力過強,導致生化反應復雜程度下降,酒體口味單一同質化[4].近年來,人們越來越重視非釀酒酵母在釀酒過程中的應用.酵母菌混合發(fā)酵可有效降低果酒有機酸及乙醇產(chǎn)量[5],增強酒體香氣特征[6],進而改善果酒風味與口感[7].然而混菌發(fā)酵中組合比例、接種順序等均會對結果產(chǎn)生較大影響,如過高比例的非釀酒酵母接種易產(chǎn)生一些不好的次級代謝物[8];共同發(fā)酵時,釀酒酵母會對非釀酒酵母產(chǎn)生一定抑制作用,而不同順序接種能延長非釀酒酵母生長期,從而更大程度保留酒中原果香特征.曾朝珍等[9]研究發(fā)現(xiàn),先接種非釀酒酵母24 h后接種釀酒酵母,能夠促進蘋果白蘭地中香氣物質的合成,改善酒體風味和品質.Lee 等[10]以同時接種發(fā)酵組為對照發(fā)現(xiàn),在釀酒酵母發(fā)酵7 d后,接種非釀酒酵母得到的木瓜酒風味獨特,品質優(yōu)良.

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)是一種風味酶,能夠通過水解糖苷前體釋放風味物質,進而豐富果酒風味[11],在食品增香中有廣泛應用.研究表明,相比釀酒酵母,非釀酒酵母具有較高的分泌β-葡萄糖苷酶能力[12],且β-葡萄糖苷酶在東方伊薩酵母中有較高的活性[13].香氣特征是果酒的重要品質特征之一,果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物是果酒香氣特征的主要貢獻者.釀酒酵母主要完成乙醇發(fā)酵,非釀酒酵母則是將原料中的前體物質轉化為風味物質,并合成多種酶,從而影響果酒色澤和風味等[14].Renault 等[15]研究發(fā)現(xiàn),與釀酒酵母純種發(fā)酵相比,混合發(fā)酵能夠增多一種特定的乙基酯,從而增強葡萄酒的復雜性和果味.而東方伊薩酵母除了能產(chǎn)生較多高級醇物質以外[16],還具有耐熱、耐酸、產(chǎn)酯能力強等特點[17].

本研究選用釀酒酵母PY01 以及東方伊薩酵母Io,按照不同接種方式混合菌種來發(fā)酵水蜜桃果酒,同時以2 種菌單獨發(fā)酵為對照,研究果酒發(fā)酵過程中產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活性的影響;通過氣相色譜-質譜法(GC-MS)測定水蜜桃酒中揮發(fā)性風味物質,探究不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒香氣成分差異,以期為提升水蜜桃酒品質作為理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用水蜜桃: 購買于浙江省寧波市奉化區(qū)種植基地,選取9～10 成熟(外觀微黃,略帶紅色,柔軟多汁,桃香濃郁)的水蜜桃[18].

菌種: 釀酒酵母PY01(Saccharomyces cerevisiae,PY01)及東方伊薩酵母Io(Issatchenkio orientalis,Io)均保存于寧波大學食品生物技術實驗室.

試劑: YPD 培養(yǎng)基,β-GC 活性檢測試劑盒,北京Solarbio 科技有限公司;檸檬酸(食品級),江蘇科倫多食品配料有限公司;果膠酶,源葉生物科技有限公司;偏重亞硫酸鉀、3,5-二硝基水楊酸、異抗壞血酸鈉均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;乙醇檢測試劑盒,愛爾蘭Megazyme 公司.

1.2 儀器與設備

多功能榨汁機,韓國惠人電子有限公司;Spectramax190 型全波長酶標儀,美國美谷分子儀器Molecular Devices 有限公司;7890B-7000C 氣相色譜-質譜(GC-MS)聯(lián)用儀,美國Agilent 公司;DVB/CAR/PDMS 萃取頭(50/30 μm),美國Supelco 公司.

1.3 方法

1.3.1 水蜜桃酒釀造流程

9～10 成熟水蜜桃→清洗去核→破碎打漿→偏重亞硫酸鉀、異抗壞血酸鈉抑菌護色→果膠酶酶解→過濾→調節(jié)pH、含糖量→巴氏滅菌→接種酵母主發(fā)酵→后發(fā)酵→殼聚糖下膠→澄清過濾→滅菌→陳釀→灌裝→成品[19].

PY01和Io的接種比例為1:1,種子液濃度分別為6×105、6×106CFU·mL-1,不同接種方式處理組編號見表1.

表1 2 種酵母菌接種方式及編號

1.3.2 水蜜桃酒部分理化指標、酵母菌發(fā)酵效率和活菌數(shù)量及β-葡萄糖苷酶的測定

還原糖含量采用DNS 法[20];酒精度采用愛爾蘭Megazyme 公司乙醇測定試劑盒測定;pH 采用PHS-3C 型pH 計測定;總酸采用GB/T 12456-2008酸堿滴定法測定[21].酵母菌發(fā)酵效率的測定采用CO2失重法,每24 h 測定1 次,以發(fā)酵時間為橫坐標,CO2釋放量為縱坐標,繪制不同接種方式酵母菌發(fā)酵效率變化曲線.酵母菌活菌數(shù)量測定采用酵母菌平板計數(shù)法;β-葡萄糖苷酶活性采用北京Solarbio 科技有限公司β-GC 活性檢測試劑盒測定.

1.3.3 水蜜桃果酒揮發(fā)性成分測定

前處理: 取5 mL 發(fā)酵水蜜桃果酒樣品放入20 mL 頂空進樣小瓶內(nèi),其氣相部分(頂空)導入頂空進樣裝置連接的氣相色譜.

GC-MS 分析-頂空進樣以及定性定量分析參照楊海寧等[22]的方法.

1.3.4 感官評定

參照GB 15038-2006 和李華敏等[23]的評定方法并稍作修改;由12 位年齡在21～36 歲訓練有素的感官品評員(6 名女性和6 名男性)分別從香氣(花香、果香、乙醇香)、口感(甜度、酸度)、外觀(酒體澄清度、色澤)等方面對水蜜桃酒進行綜合評價打分.實驗重復3 次,打分為10 分制,即0～3 為低強度,4～6 為中強度,7～10 為高強度.

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3 次取平均值.對揮發(fā)性風味物質進行主成分分析,采用軟件OrignPro 8.5 作圖,SPSS 25.0 進行統(tǒng)計方差分析.

2 結果與分析

2.1 總糖、還原糖、乙醇以及pH 的分析

表2 列示了不同接種方式水蜜桃酒發(fā)酵結束后的部分理化指標.Io 參與發(fā)酵的酒精度含量明顯低于PY01 單獨發(fā)酵組;混菌發(fā)酵組中,PI2 酒精度最低,PI1 次之,這與Varela 等[24]報道中采用同時或順序接種的混合發(fā)酵可有效降低乙醇含量的結果一致.同時PI2還原糖含量明顯低于其他處理組,說明PI2順序發(fā)酵方式能夠在發(fā)酵過程中消耗更多的糖.每組間pH 和總酸含量差異不大,均符合2015 版果酒行業(yè)標準[25].

表2 5 種發(fā)酵酒樣的部分理化指標

2.2 接種方式對酵母菌發(fā)酵效率的影響

酵母菌發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)物有CO2,因此檢測發(fā)酵過程中的CO2失重能夠很好地反映其發(fā)酵效率.不同接種方式酵母菌發(fā)酵效率變化如圖1 所示,由圖可知,P1 組單獨發(fā)酵失重最多,I1 組單獨發(fā)酵失重最少,即PY01 發(fā)酵效率高于Io.非釀酒酵母前期生長較快,后期釀酒酵母較強的生存能力和對其他微生物的抑制能力逐漸發(fā)揮作用,生長速度加快[26],PI1 的趨勢與此一致.PI2 由于Io 的存在前期上升緩慢,48 h 接種PY01 后迅速增長.

圖1 接種方式對酵母菌發(fā)酵效率的影響

2.3 接種方式對酵母菌活菌數(shù)量的影響

接種方式對酵母菌活菌數(shù)影響如圖2 所示.發(fā)酵初期,2 種菌均能適應發(fā)酵環(huán)境且迅速生長,單菌發(fā)酵中PY01 生長速率高于Io.由圖2(a)可以看出,PI1-Io 組在第1 天生長到峰值后開始下降,5 d后平緩上升,這說明其前期生長受到了PY01 的阻礙.可能是受到Io 限制的原因,該組PY01 前期生長弱于PY01 單菌發(fā)酵,PY01 于第5 天達到峰值(8.1×107CFU·mL-1),而后逐漸趨于穩(wěn)定.圖2(b)表示2組順序發(fā)酵酵母菌活菌數(shù)量變化,初期Io迅速生長到峰值(2.7×107CFU·mL-1),而接種PY01 后,由于受到其阻礙活菌數(shù)開始下降,PY01 迅速生長,與PI1 基本一致.PI3 接種Io 后趨勢與PI2-Io 組相似.由上可知,釀酒酵母與非釀酒酵母同時存在時,易受其阻礙導致生長緩慢,而先接種非釀酒酵母后48 h 接種釀酒酵母能夠有效緩解此現(xiàn)象,對果酒的風味多樣性有積極貢獻[27].

圖2 接種方式對酵母菌活菌數(shù)量的影響

2.4 β-葡萄糖苷酶活性分析

由圖3 可知,在整個發(fā)酵過程中,β-葡萄糖苷酶活力先升后降,第1 周幾組上升趨勢差異小.單菌發(fā)酵組酶活力較低,PI2 組β-葡萄糖苷酶活力于第2 周上升至峰值10.34 U·L-1,高于其他處理組,說明混菌發(fā)酵能夠促進β-葡萄糖苷酶的增長,其中先接種Io 48 h后接種PY01 更有利于β-葡萄糖苷酶的積累.高β-葡萄糖苷酶活性能夠有效促進香氣化合物的釋放[28],混合發(fā)酵體系的高糖苷酶活性有利于增加葡萄酒的品種香和香氣復雜度.

圖3 接種方式對水蜜桃酒β-葡萄糖苷酶活力的影響

2.5 接種方式對發(fā)酵水蜜桃酒揮發(fā)性風味物質產(chǎn)生的影響

果酒中風味物質的組成及其含量顯著影響酒的品質,同時也會影響消費者的購買欲[29].采用GC-MS 對不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒揮發(fā)性風味物質進行測定,結果見表3.通過對不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒部分揮發(fā)性物質的聚類分析,混菌發(fā)酵的3 組風味物質有一定的相似性,但PI2 的物質濃度略高,單菌發(fā)酵組風味相似性較低.

由表3 可知,5 種不同接種方式發(fā)酵后得到的水蜜桃酒共檢出64 種揮發(fā)性風味物質,其中酯類42 種、醇類5 種、酸類7 種、醛酮類3 種和其他類7 種,貢獻顯著的特征香氣成分為癸酸乙酯、乙酸乙酯和苯乙醇等.

表3 不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒部分揮發(fā)性風味物質相對含量

續(xù)表

續(xù)表

酯類物質由酵母菌在乙醇發(fā)酵過程中催化高級醇和脂而形成[30],是水蜜桃酒中種類最多的香氣物質,對香氣特征起決定性作用.混菌發(fā)酵有效增加了酯類物質的種類及含量,PI1 組中酯類物質種類及相對含量較低,PI2 組的酯類物質種類及相對含量最高,達到了93.16%,這主要歸因于癸酸乙酯、月桂酸乙酯以及乙酸乙酯的貢獻,這與文獻報道中采用順序接種發(fā)酵玫瑰葡萄酒增加酒體酯類物質含量的研究結果一致[31].

醇類物質是乙醇發(fā)酵期間的副產(chǎn)物,當其在含量較低的情況下,能夠有效增加酒體的復雜性,然而含量高時,會對酒體香氣有消極影響[32].PI2組苯乙醇的相對含量最高.苯乙醇不僅能夠賦予酒體玫瑰花香,還能作為其他易揮發(fā)風味物質的溶劑[33],豐富酒體層次.酸類物質能賦予水蜜桃酒果香,各組間酸類及醛酮類物質相對含量差異不大.其中,2-乙基丁酸、3-甲基戊酸為PI2 組所特有,賦予酒體新鮮水果味.醛類物質在微生物作用下易被還原為酸類[34],故含量較少.結果表明,在Io發(fā)酵后48 h 接種PY01 順序發(fā)酵能有效增加揮發(fā)性風味物質對酒體的積極影響.

2.6 多元統(tǒng)計分析

為了更直觀地分析不同接種方式發(fā)酵酒體呈香物質的差異性,對各組揮發(fā)性風味物質相對含量進行主成分分析[35],得到主成分特征值、貢獻率、得分圖、載荷圖(表4 和圖4).由表4 可知,主成分1、2 的貢獻率分別為51.1%和32.2%,累積貢獻率83.3%,說明前2 個主成分能夠有效解釋變量信息.

表4 主成分特征值及貢獻率

圖4 不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒PCA 得分(a)和載荷(b)

從圖4(a)可以觀察到,混菌發(fā)酵組位于同一象限,且距離近,說明其風味特征等也較為接近,但其與單菌發(fā)酵組距離較遠,而且2 組單菌發(fā)酵組也位于不同象限,而且2 組單菌發(fā)酵組也各自位于不同象限,其風味特征差異較大,這與聚類分析結果一致.P1 在第一成分上得分與PI2 較為接近,可能是因為PI2 前期Io 消耗較快,48 h 后接種的PY01后期起主導作用.

載荷系數(shù)的大小反映了初始變量(各揮發(fā)性風味物質)與主成分之間的相關性,主成分對該變量的代表性強弱與載荷系數(shù)呈正相關[36].從載荷圖4(b)可以看出,第一主成分與大部分酯類物質和苯乙醇呈正相關,與辛酸和巴豆酸乙酯等則呈負相關.第二主成分與桃醛和棕櫚酸乙酯等正相關,與苯乙醇和苯乙烯等其他類物質負相關.有些揮發(fā)性風味物質的數(shù)量變化在主成分分析分離中沒有主要影響或貢獻,因此在載荷圖中未觀察到.PI2組在第一、第二主成分上得分都較高,說明該組發(fā)酵后呈香物質含量較高.綜合圖4(a)可以說明,接種Io 48 h后接種PY01 能夠有效改善水蜜桃酒品質風味單一的問題.

為進一步確定對風味貢獻較大的物質,可生成一個變量投影重要性(Variable Important for the Projection,VIP)評分圖[37],由此來量化每個變量對分類的貢獻,通常VIP 值越大,變量在不同組間差異就越顯著.計算得出,VIP＞1 的有11 種揮發(fā)性風味物質,其中十四酸乙酯、辛酸甲酯、乙酸乙酯、壬酸乙酯的VIP 值都超過了1.4,是區(qū)分不同處理組香氣特征的主要成分.而且在PI2 組中的這些物質含量都較高,說明該組香氣特征比其他處理組突出.

2.7 感官評定結果

從香氣、口感、外觀對不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒進行感官評分(圖5).在澄清度色澤方面,幾組差異不大.因為混菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生更高含量的酒精,所以混菌發(fā)酵組乙醇香和花香都高于單菌組.混菌發(fā)酵中,PI2 酯類物質含量較高,故該組果香得分最高,但該組發(fā)酵過程中消耗了更多的糖,導致甜度得分較低.Io 發(fā)酵主要帶來的是果味和酸度,故I1 組酸度高.綜合感官分析可知,在整體上PI2組表現(xiàn)最優(yōu),即接種非釀酒酵母Io 后48 h 接種釀酒酵母PY01 能夠有效豐富酒體的果香、花香,從而增加水蜜桃酒風味的復雜性和協(xié)調性.

圖5 不同接種方式發(fā)酵水蜜桃酒感官評分圖

3 結論

選用釀酒酵母PY01 結合非釀酒酵母東方伊薩酵母Io 進行混合發(fā)酵研究表明,各組間pH 及總酸無太大差別,Io 的參與降低了水蜜桃酒的酒精度,先接種非釀酒酵母48 h 再接種釀酒酵母酒精度和還原糖最低,β-葡萄糖苷酶活性最高.混菌發(fā)酵組揮發(fā)性風味物質種類高于單菌發(fā)酵組,且先接種非釀酒酵母48 h 后接種釀酒酵母組揮發(fā)性風味物質種類最多,該組酯類物質種類(37 種)及相對含量(93.16%)也最高.該復合菌接種方式有效增加了水蜜桃酒中的癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯以及苯乙醇等物質相對含量,賦予酒體濃郁的奶油、水果香氣、葡萄白蘭地香韻,豐富了水蜜桃酒香氣層次.主成分和感官分析表明,先接種非釀酒酵母48h 后接種釀酒酵母組香氣特點最為明顯,綜合感官得分最高.綜上所述,東方伊薩酵母Io和釀酒酵母PY01 混菌發(fā)酵能夠產(chǎn)生更多的香氣物質,而且優(yōu)先接種Io 后48 h 接種PY01 發(fā)酵組能夠更大程度地發(fā)揮2 種菌的生長優(yōu)勢,有利于β-葡萄糖苷酶的積累,更大程度上促進水蜜桃酒揮發(fā)性風味物質的釋放,增加酯類物質對水蜜桃酒香氣的積極影響,發(fā)酵完成后的酒體香氣更為濃郁,有利于提升水蜜桃酒品質.本研究優(yōu)先接種東方伊薩酵母Io 后48h 接種釀酒酵母PY01 發(fā)酵水蜜桃酒取得良好的效果,為提升水蜜桃果酒品質提供了理論依據(jù).