吳延華 ,郭 賀 ,梅麗敏 ,潘淵博 ,徐建峰 ,周成旭,4*

（1.寧波大學 食品與藥學學院,浙江 寧波 315832;2.寧波大學 海洋學院,浙江 寧波 315832;3.福建省連江縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站,福建 連江 350500;4.寧波大學 應用海洋生物技術(shù)教育部重點實驗室,浙江 寧波 315832）

微藻是濾食性貝類的重要食物來源,其組成結(jié)構(gòu)影響著養(yǎng)殖貝類的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-5].有毒有害微藻存在時,貝類可能減少或避免攝食[6-7],生長率下降,甚至死亡[8-9].

甲藻是海洋微藻的主要類群之一,有些種類具有明確的毒素,而有些種類沒有毒素.卡羅藻屬(Karlodinium)是一類沿海養(yǎng)殖水域廣泛分布的小型裸甲藻[10-13].其中,劇毒卡羅藻(Karlodinium veneficum)能分泌卡羅藻毒素(Karlotoxins)[13-15],具有多種毒性特征,在全球各大洲沿海水域赤潮時,能致死養(yǎng)殖生物[16-21].周氏卡羅藻(Karlodinium zhouanum)是一種無毒的卡羅藻[22],與劇毒卡羅藻具有一致的細胞大小和形態(tài)特征.2 種卡羅藻在中國南北沿海水域均有廣泛分布[22-23].在早期研究中,由于卡羅藻細胞微小,常規(guī)鏡檢方法不易檢出而常被忽視.近年來在我國沿海水域,卡羅藻屬種的分布和生物量上升,赤潮發(fā)生并致害事件也呈增加趨勢[19,24-25],對生態(tài)環(huán)境和不同海水養(yǎng)殖生物的影響還需大量研究.對有毒甲藻毒素的食物鏈累積、致害機制、赤潮時的生態(tài)效應等研究較多,但對非赤潮密度時的作用以及對有毒和無毒甲藻類影響貝類生長、生理生化代謝的比較等方面研究尚存不足.

菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)是典型濾食性雙殼貝類,在我國沿海灘涂分布廣泛,是重要養(yǎng)殖物種,其養(yǎng)殖規(guī)模和產(chǎn)量均位列前茅[26].由于濾食性貝類的攝食受到食物顆粒形態(tài)、大小等的影響,在以攝食率和濾水率等攝食生理指標為研究目標時,以顆粒大小、形態(tài)一致的藻種做比較研究為宜.本文以菲律賓蛤仔為研究對象,比較分析產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒卡羅藻對菲律賓蛤仔生長、存活、攝食生理的影響及其差異,并對不同組織中的糖原含量在攝食前后的變化特征進行解析.研究的主要目的: (1)比較2 種細胞顆粒大小、形態(tài)完全一致的有毒和無毒甲藻對菲律賓蛤仔生長及生理生化的影響;(2)初步探究卡羅藻屬種對菲律賓蛤仔潛在的影響效應機制.研究結(jié)果可為評價該屬種赤潮甲藻對雙殼類養(yǎng)殖生產(chǎn)的影響提供科學依據(jù).

1 材料與方法

1.1 卡羅藻藻種

2 種卡羅藻均分離自東海養(yǎng)殖水域,為寧波大學微藻種質(zhì)庫保存藻種,分別為有毒的劇毒卡羅藻(庫存編號NMBjah047-1,株系編號GM2)和無毒的周氏卡羅藻(NMBjah056-9,株系編號GM17).藻種擴大培養(yǎng)至足量以用于實驗.

1.2 有毒和無毒卡羅藻對菲律賓蛤仔稚貝生長和存活的影響

菲律賓蛤仔稚貝采自于福建寧德育苗場,平均殼長約(2.62±0.19)mm,殼高約(2.16±0.18)mm.在實驗室暫養(yǎng)期間,投喂球等鞭金藻(Isochrysis galbana),隔天換水,連續(xù)充氣.

生長實驗前,以篩網(wǎng)篩取大小均勻的稚貝.在白色塑料方盆中加入5 L 過濾海水(鹽度25),均勻撒入2 g 的稚貝.分為2 組,各組3 平行,投喂有毒或無毒卡羅藻.每天定時投喂2 次(8:00 和20:00),每次投喂使水體中的藻密度約為2×106～2.5×106cells·L-1.充氣培養(yǎng),隔天更換海水,同時隨機取稚貝于顯微鏡下測量10 粒活貝的殼長和殼高,計算其相對規(guī)格大小(殼長×殼高,mm2),測量完成后,稚貝放回對應實驗組.

稚貝相對生長率R= (St-St-1)/St-1×100%,式中,St為t時間點的規(guī)格大小,St-1為t時間點前一個采樣時間點的規(guī)格大小.

投喂9 d 后,各組分別隨機取樣,計數(shù)100 粒稚貝,其中空殼記為死亡個體,以計算存活率,重復3 次計數(shù).

1.3 有毒和無毒卡羅藻對菲律賓蛤仔濾水率和攝食率的影響

1.3.1 成貝攝食率和濾水率

成貝取自福建定海灣貝類養(yǎng)殖基地,選取健康活力好的個體,放入塑料盆中馴養(yǎng)1 周,以球等鞭金藻投喂.馴養(yǎng)期間每天換水1 次.實驗前,放入抽濾海水中饑餓24 h.實驗用成貝平均規(guī)格大小即殼長、殼寬、殼高分別約為33、22、14 mm,濕重約(6.6±0.6)g.

預實驗確定菲律賓蛤仔攝食2 種微藻在1 h 內(nèi)不產(chǎn)生假糞的最大藻密度,以排除藻密度過高造成貝類形成假糞的影響.正式實驗時,設置藻密度梯度為10×105、15×105、20×105、25×105、30×105cells·L-1,各密度組投放3 個成貝,不投放菲律賓蛤仔的對應藻密度組為無攝食對照組.水體體積1 L,各組3 平行.實驗于控溫培養(yǎng)室(23±2)℃進行,海水鹽度25,pH 值7.82.

經(jīng)1 h 后,取2 mL 各實驗組藻液,以20μL 魯哥氏碘液固定,用浮游計數(shù)框計數(shù)藻細胞密度.貝類濾水率和攝食率計算公式如下[27-28]:

式中:VFR為一個菲律賓蛤仔(shell)單位時間(h)的濾水體積(濾水率,L·(shell·h)-1);V為藻液體積(L);n為菲律賓蛤仔數(shù)目(個);t為試驗持續(xù)時間(h);C0、Ct分別為實驗起始和t時間的微藻密度(cells·mL-1);S為無攝食對照組微藻的變化系數(shù);C1和C2分別為對照組起始和t時間后的微藻密度(cells·mL-1);IIR為一個菲律賓蛤仔(shell)單位時間(h)攝食的藻細胞數(shù)(攝食率,cells·(shell·h)-1).

1.3.2 稚貝攝食率和濾水率

稚貝材料與生長實驗相同.實驗前,將稚貝于抽濾海水中饑餓24 h.攝食實驗時,設置卡羅藻密度梯度5×105、10×105、15×105、20×105、25×105cells·L-1,藻液體積1 L,各密度組放入2 g 稚貝,不加稚貝的對應藻密度組為無攝食對照組,各組3 平行.實驗與成貝相同環(huán)境下進行.1 h 后,各實驗組取2 mL 藻液,以20μL 魯哥氏碘液固定,浮游植物計數(shù)框計數(shù)藻密度.稚貝濾水率和攝食率計算同成貝,其中,貝類生物量為質(zhì)量(g),因此,稚貝濾水率和攝食率單位分別為L·(g·h)-1和cells·(g·h)-1.

1.4 菲律賓蛤仔攝食有毒和無毒卡羅藻時各組織糖原的變化

利用成貝攝食實驗的貝類樣品進行分析.攝食實驗結(jié)束后,取攝食前以及3 組不同藻密度(10×105、20×105、30×105cells·L-1,記為低、中、高密度)實驗組的成貝,置于冰面上及時解剖,取閉殼肌、外套膜、足、肝胰腺組織,將各組3 只菲律賓蛤仔的相同組織分別混合后,置于-80 ℃冰箱保存,待測其糖原.

糖原含量采用蒽酮比色法測定[29].精確稱取待檢組織各100 mg,加入8 mL 5%(體積百分比)三氯醋酸,勻漿1 min,以3 000 r·min-1離心勻漿液15 min,取1 mL 上清液放入10 mL 離心管中,加入4 mL 95%(體積百分比)乙醇,將試管放置在37～40 ℃水浴鍋中水浴加熱3 h.沉淀完全后,3 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,離心管倒立放置10 min.加入1 mL蒸餾水溶解糖原后,加入5 mL蒽酮硫酸試劑,攪拌均勻,沸水浴中反應15 min(反應液呈藍綠色)后,在流水下迅速冷卻以停止反應.以酶標儀測定620 nm 吸光值.根據(jù)標準曲線計算糖原含量.

標準曲線制定: 配制葡萄糖質(zhì)量濃度梯度為0.2、1.0、1.8、2.6、3.4、4.2、5.0 mg·mL-1的工作溶液各1 mL,加入5 mL 蒽酮硫酸試劑,沸水浴15 min,取出后迅速于流水下冷卻以停止反應.酶標儀測定620 nm 吸光值.以1.0 mL 蒸餾水同樣方式操作,作為空白對照.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

結(jié)果數(shù)據(jù)以“平均值±標準偏差”表示.SPSS 19.0對實驗組間結(jié)果進行One-Way ANOVA單因子方差分析.顯著水平設置為P＜0.05.

2 結(jié)果

2.1 有毒和無毒卡羅藻對菲律賓蛤仔稚貝生長和存活的影響

2 組甲藻投喂菲律賓蛤仔,其大小變化如圖1所示.在相同的策略下投喂9 d 后,相對于初始規(guī)格,無毒藻組(GM17)和有毒藻組(GM2)分別增長了16%±2.6%和8%±1%.由圖可見,在投喂初期(1～3 d)和后期(7～9 d),每2 d 的相對生長率均呈現(xiàn)GM17 組顯著大于GM2組(P＜0.05),大小規(guī)格也是GM17 組顯著大于GM2 組(P＜0.05).在第5 天和第7 天時,2 組的規(guī)格大小和相對生長率沒有顯著差異(P＞0.05).

圖1 GM2 和GM17 投喂下稚貝的規(guī)格和相對生長率

從稚貝存活結(jié)果來看,在相同投喂策略下,稚貝生長8 d后,GM17組存活率約76.3%±3.2%,GM2組約為58.0%±2.6%,有毒組顯著低于無毒組(P＜0.05).

2.2 有毒和無毒卡羅藻對菲律賓蛤仔成貝的濾水率和攝食率的影響

由圖2 可見,在2 種卡羅藻液中,菲律賓蛤仔的濾水率隨藻密度增加而增加,在出現(xiàn)最大濾水率后,濾水率下降.GM2 組中,最大濾水率為(0.28±0.03)L·(shell·h)-1,出現(xiàn)在藻密度為15×105cells·L-1的實驗組;GM17 組中,最大濾水率為(0.46±0.03)L·(shell·h)-1,出現(xiàn)在藻密度較高的實驗組(20×105cells·L-1).GM17 組濾水率均大于GM2 組.在最低實驗藻密度組中(10×105cells·L-1),GM2 組濾水率已出現(xiàn)顯著低于GM17 組(P＜0.05).除藻密度為15×105cells·L-1的實驗組以外(P＞0.05),在其他更高密度下,GM2組濾水率均顯著低于GM17組濾水率(P＜0.05).

圖2 不同密度的GM2 和GM17 中成貝的濾水率

菲律賓蛤仔攝食率與藻密度的相關(guān)特征如圖3所示.較低藻密度中(10×105～15×105cells·L-1),2 組貝類攝食率相同.當藻液密度大于15×105cells·L-1后,隨著藻密度增加,攝食率出現(xiàn)差異.與濾水率不同,實驗藻密度范圍內(nèi),攝食率未出現(xiàn)增加至最大值后下降的趨勢.GM17 組攝食率隨藻密度增加而增加.GM2 組中攝食率增加幅度降低,各密度下,其攝食率均顯著低于GM17 組攝食率(P＜0.05).

圖3 不同密度的GM2 和GM17 中成貝的攝食率

2.3 有毒和無毒卡羅藻對菲律賓蛤仔稚貝攝食率和濾水率的影響

稚貝濾水率和攝食率與卡羅藻密度相關(guān),藻密度小于15×105cells·L-1時,濾水率和攝食率隨藻密度增加而增加(圖4 和圖5);與成貝不同,稚貝攝食率和濾水率均在相同藻密度(15×105cells·L-1)達到最大.無毒藻組(GM17)中,最大濾水率和攝食率分別為(0.46±0.04)L·(g·h)-1和(7.00×105±0.63×105)cells·(g·h)-1;有毒藻組(GM2)中,分別為(0.37±0.02)L·(g·h)-1和(5.65×105±0.41×105)cells·(g·h)-1.藻 密度進一步增加(＞15×105cells·L-1)時,濾水率和攝食率均下降,并在2 種藻液中具有相同下降特征,呈現(xiàn)冪函數(shù)相關(guān)特征.當藻密度低于15×105cells·L-1時,2 組濾水率和攝食率無顯著差異(P＞0.05).藻密度大于15×105cells·L-1以后,GM2 組濾水率和攝食率均顯著低于GM17 組(P＜0.05).

圖4 不同密度的GM2 和GM17 中稚貝的濾水率

圖5 不同密度的GM2 和GM17 中稚貝的攝食率

2.4 攝食有毒和無毒卡羅藻時菲律賓蛤仔成貝各組織糖原的變化

糖原含量分析的工作曲線如圖6 所示.實驗檢測的OD 值范圍內(nèi),糖原量與吸光值的關(guān)系式為:

圖6 糖原量分析的工作曲線

式中:y為OD620nm;x為糖原量(mg·mL-1).

攝食前以及低、中、高藻密度組攝食1 h 后,菲律賓蛤仔各組織糖原含量結(jié)果如圖7 所示.不同組織糖原含量水平不同,其中,外套膜具有最高糖原相對含量(約640～1 890 mg·g-1),其次為足(約140～600 mg·g-1)和閉殼肌(約100～220 mg·g-1),肝胰腺糖原相對含量最低(約18～60 mg·g-1).除高藻密度下GM2 組的外套膜和閉殼肌糖原含量與未攝食組沒有顯著差異外(P＞0.05)(圖7(a)、(c)),攝食后,組織中的糖原均出現(xiàn)顯著增加(P＜0.05).攝食1 h 后,GM17 低藻密度組外套膜中糖原含量最高,且顯著大于GM2 低藻密度組(P＜0.05);中、高藻密度組中,GM17 和GM2 糖原含量沒有顯著差異(P＞ 0.05)(圖7(a)).足的低藻密度組中,GM17 組和GM2 組的糖原含量沒有顯著差異(P＞0.05),高密度組中,GM2組顯著低于GM17組(P＜0.05)(圖7(b)).各藻密度組的閉殼肌和肝胰腺中(圖7(c)、(d)),GM17 和GM2組的糖原含量均未呈現(xiàn)顯著差異(P＞ 0.05).

圖7 菲律賓蛤仔攝食不同密度GM2 和GM17 后各組織的糖原量

研究結(jié)果顯示,有毒和無毒卡羅藻對菲律賓蛤仔生長、存活以及攝食生理產(chǎn)生了不同的影響.有毒種使菲律賓蛤仔生長和存活率顯著降低,并使其濾水率和攝食率顯著下降,與藻密度相關(guān)性發(fā)生變化,且對菲律賓蛤仔軟組織糖原的存儲和組織間分布產(chǎn)生了影響.

3 討論

濾水率和攝食率是反映貝類攝食生理的重要指標[30].環(huán)境顆粒物的大小、密度、形態(tài)、生化成分等都是影響貝類攝食生理的重要因子[2-5],攝食有毒有害顆粒物時,貝類生長、存活及攝食生理代謝等方面會發(fā)生顯著改變[6-7].本研究顯示,在細胞大小、形態(tài)和投喂策略完全一致的情況下,2 種卡羅藻對菲律賓蛤仔成貝攝食生理產(chǎn)生了顯著不同的影響,與其含毒與否顯著相關(guān).Binzer 等[9]就卡羅藻屬另一有毒種(K.armiger)對紫貽貝(Mytilus edulis)成貝的影響研究發(fā)現(xiàn),相對于貝類喜食的無毒隱藻對照組,貽貝在卡羅藻藻密度大于1.5×106cells·L-1時,開始避免濾食(相當于本文中成貝實驗密度1×106～3×106cells·L-1);密度約為3.6×107cells·L-1時(大于本文中成貝實驗密度1×106～3×106cells·L-1),貽貝在24 h 和48 h 出現(xiàn)不同程度的死亡.塔瑪亞歷山大藻(Alexandrium tamarensis)也是一種赤潮甲藻,具有有毒和無毒生態(tài)型,不同雙殼貝類的攝食活動對該藻的響應不同,且與海域相關(guān)[31];不同貝類攝食生理受到不同影響時,有濾水率升高的,也有降低的;而有的貝類可能發(fā)展了某種適應機制,能夠適應此赤潮種類,而沒有受到任何不利影響[31].本研究中,從攝食率響應藻密度增加的變化關(guān)系來看,菲律賓蛤仔成貝較稚貝對高密度卡羅藻具有更高的耐受力.高藻密度影響下,其攝食率未下降,但稚貝攝食率顯著下降.雖然不同微藻對養(yǎng)殖生物的影響效應不能在絕對細胞密度上進行比較,且貝藻相互作用關(guān)系具有種類特異性[32].但研究結(jié)果均顯示,產(chǎn)毒甲藻對貝類的攝食生理過程產(chǎn)生了影響.本研究顯示,菲律賓蛤仔在攝食卡羅藻有毒和無毒種時,其濾水率和攝食率始終是無毒組高于有毒組.可見其對于卡羅藻的無毒種和有毒種具有不同的攝食活力.但如果需要完全明確2 種株藻共存時,菲律賓蛤仔是否有偏愛濾食,目前尚難以在實驗中做到,原因是此2 種藻在顯微鏡鏡檢條件下無法進行區(qū)分.因此,需要在今后的研究中進一步提高外形無法區(qū)分的藻株識別技術(shù),比如采用特異性的熒光標記或分子探針技術(shù)等,以明確其對有毒株和無毒株共存時攝食偏好問題.

2 種卡羅藻在不同程度上支持菲律賓蛤仔個體生長,但生長率和存活率均顯著不同,且攝食后,短期內(nèi)即表現(xiàn)出糖原存儲差異,說明有毒與無毒卡羅藻使菲律賓蛤仔在生化代謝層面上也發(fā)生了變化.糖原主要參與貝類的能量代謝[33-34],其含量在生理代謝過程中變化迅速[35-36],是評價貝類營養(yǎng)健康狀況的重要指標.尚未見關(guān)于貝類攝食不同微藻短期內(nèi)造成各組織糖原含量變化的報道.Galimany 等[37]對劇毒卡羅藻影響紫貽貝貝苗的免疫功能和組織病理學變化進行了研究.投喂的劇毒卡羅藻終密度為(6.25×104cells·L-1),小于本研究稚貝實驗中的藻密度(2×106～2.5×106cells·L-1),并且為每天1 次投喂.投喂3 d 后,貝類已顯示免疫功能受到影響,6 d 暴露后,血細胞釋放活性氧增加.本研究中,菲律賓蛤仔攝食2 種卡羅藻1 h 后,糖原含量均有不同程度的上升,說明在獲得可攝食顆粒后,饑餓的菲律賓蛤仔迅速啟動了糖原儲存機制.并且低藻密度組的貝類攝食率和濾水率均沒有顯著差異,但有毒藻組外套膜糖原含量顯著小于無毒藻組,說明在相同攝食率情況下,有毒卡羅藻可能對糖原存儲和相關(guān)代謝過程產(chǎn)生了影響.Tatsuya[38]研究發(fā)現(xiàn),菲律賓蛤仔不同組織的糖原含量具有差別,外套膜糖原在生理活動中變化迅速.本研究結(jié)果顯示,菲律賓蛤仔外套膜糖原含量最高,且與有毒和無毒卡羅藻的影響顯著相關(guān).在所有藻密度組中,肝胰腺和閉殼肌的糖原沒有顯示有毒和無毒組的差異,且其糖原含量相對低,也可能說明2 個組織中的糖原代謝響應不如外套膜迅速.由于劇毒卡羅藻不僅細胞內(nèi)含毒,且毒素釋放到環(huán)境水體,還具有主動獵食多細胞動物的行為[13],使其貝藻相互作用過程較為復雜.在高密度組中,可能在過高的藻密度及毒素的作用下,對菲律賓蛤仔不同組織及其他生理生化過程造成了影響,其機制尚待研究挖掘.但本研究顯示,饑餓處理的菲律賓蛤仔可在攝入卡羅藻后,迅速儲存糖原,說明2 種甲藻提供了菲律賓蛤仔能量代謝的物質(zhì)基礎(chǔ),但有毒種可能造成其糖原累積以及組織間分布不同.

本研究結(jié)果顯示,常以非赤潮密度分布于海水養(yǎng)殖水域中的劇毒卡羅藻可能通過影響濾食性貝類的攝食生理活動及糖原等生化代謝過程對貝類的生長和存活產(chǎn)生影響,在沿海養(yǎng)殖水域中劇毒卡羅藻生物量趨于增加的背景下,該藻對貝類養(yǎng)殖業(yè)的影響值得關(guān)注.