韓雨薇，王晨辰，梁國標(biāo)，李曉明

早期腦損傷(early brain injury,EBI)被認(rèn)為是蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)后預(yù)后不良的關(guān)鍵因素[1]。炎癥是早期腦損傷的重要機制之一[2]。半乳糖結(jié)合蛋白-3(Galectin-3,Gal-3)屬于β-半乳糖苷結(jié)合凝集素超家族，由1或2個碳水化合物識別域(carbohydrate recognition domains,CRDs)組成[3]，與碳水化合物結(jié)合并影響細(xì)胞功能的蛋白質(zhì)。Galectin-3廣泛分布于人體各處，可在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外間隙中發(fā)現(xiàn)，并可分泌到血液中[4]。它參與細(xì)胞粘附、增殖、凋亡、細(xì)胞激活、細(xì)胞的遷移和吞噬[5-7]。Galectin-3是一種促炎蛋白，與癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性心力衰竭和系統(tǒng)性硬化的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[8-10]。

在腦缺血和腦創(chuàng)傷實驗?zāi)Ｐ椭斜砻鳎珿alectin-3由膠質(zhì)細(xì)胞分泌，作為Toll like receptor 4(TLR)4配體激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子上調(diào)[11-13]。最近發(fā)現(xiàn)，Galectin-3水平與SAH的嚴(yán)重程度和不良預(yù)后之間存在關(guān)聯(lián)[14]。研究表明，蛛網(wǎng)膜下腔出血后1～3 d血漿Galectin-3水平升高是非嚴(yán)重動脈瘤性SAH患者發(fā)生遲發(fā)性腦缺血的獨立預(yù)測因子。然而，Galectin-3在SAH中的功能作用及分子機制尚不清楚。故本研究將探討Galectin-3在SAH小鼠模型中的作用影響，并證實其可能的作用機制。

1 方法與材料

1.1 實驗動物本研究是根據(jù)1996年修訂的“美國國立衛(wèi)生研究院實驗動物護理和使用指南”(NIH NO.80-23號)進(jìn)行的。C57BL/6雄性成年小鼠(10～12周齡，體質(zhì)量25～30 g)購自北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心，許可證號SCXK(遼)2020-0001。動物在12 h的光暗循環(huán)環(huán)境中飼養(yǎng)的，給予充足的食物和水。

1.2 動物模型用40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，將小鼠放入加熱毯中，將直腸溫度保持在37±0.5℃。然后暴露頸內(nèi)動脈、頸外動脈和左頸總動脈，結(jié)扎并切割左頸外動脈，留下3 mm的動脈殘端。通過大腦中動脈分支將尼龍縫線插入左側(cè)，并將縫線進(jìn)一步推進(jìn)約3～5 mm以刺穿動脈，持續(xù)時間為10 s。假手術(shù)小鼠用相同的程序處理，但不刺血管。

1.3 動物分組及側(cè)腦室注射實驗分為4組，每組32只小鼠，分別為假手術(shù)+control-siRNA組(sham+si-con)，SAH模型+control-siRNA組(SAH+si-con)，假 手術(shù)+Gal-siRNA組(sham+si-Gal)，SAH模 型+Gal-siRNA組(SAH+si-Gal)。參照[15]方法進(jìn)行腦室內(nèi)注射操作，在顱骨上鉆一個1.0 mm的孔，不刺破硬腦膜。然后，將10 μL Hamilton注射器(Hamilton公司，美國)的針頭立體垂直地插入孔中，位于前囟的水平面下方3.0 mm處，進(jìn)入左側(cè)腦室?？偣? μL體積的Gal-siRNA(500 pmol，Santa Cruz公司，美國)在SAH誘導(dǎo)前48 h以相同的速率注入，在輸液后10 min緩慢取出注射器。

1.4 神經(jīng)功能評分在SAH造模24 h后進(jìn)行神經(jīng)功能評分。采用改良的Garcia評分[16]，分別進(jìn)行了以下六項測試：自發(fā)活動、肢體運動的對稱性、前爪伸展、攀登、身體本體感覺和對觸碰的反應(yīng)。將所有測試的所有單項得分相加后，神經(jīng)行為得分最低為3分，代表小鼠神經(jīng)功能嚴(yán)重受損，最高得分為18分，代表小鼠神經(jīng)功能正常。

1.5 SAH分級參照文獻(xiàn)[17]對SAH嚴(yán)重程度進(jìn)行分級評分。根據(jù)蛛網(wǎng)膜下腔凝血量將基底池分為6個區(qū)域，每個區(qū)域0～3分。0級：無蛛網(wǎng)膜下腔血；1級：微量蛛網(wǎng)膜下腔血；2級：中度凝血；3級：血塊覆蓋所有動脈。總分由6個部分(0～18分)相加而得。

1.6 腦水含量大腦樣本被迅速取出，分成左右大腦半球和小腦。大腦的這三個部分分別稱重(濕重)，然后將大腦樣本在105℃的烤箱中烘干72 h，然后再次稱重(干重)。含水量公式為：(濕重-干重)/濕重×100%。

1.7 伊文思藍(lán)滲出小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉。SAH 24 h后注射伊文思藍(lán)染料(2%，5 mL/kg；Sigma公司，美國)左股靜脈注射，循環(huán)60 min。通過心內(nèi)灌PBS對小鼠實施安樂死。取腦，快速分為左右大腦半球和小腦，稱重，用甲酰胺(10 mL/g)浸泡，60℃孵育24 h。然后，離心收集上清液，在620 nm處用酶標(biāo)儀測定量吸光值。

1.8 Western blot每組8只大鼠，SAH 24 h后，PIRA裂解液(碧云天生物技術(shù)有限公司)提取樣品蛋白，將等量的樣品蛋白(50 μg)上樣到聚丙烯酰胺凝膠(碧云天生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行電泳分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜在5%BSA室溫下封閉1 h，并在4℃下與以下一抗孵育過夜：Galectin-3(1:800,Abcam)，緊密連接蛋白ZO-1(1:500,Cell signaling technology)，緊密連接蛋白claudin-5(1:500,Cell signaling technology)，閉合蛋白Occludin(1:500,cell signaling technology)，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β，1:500，Cell signaling technology)，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α，1:500,Cell signaling technology)，β-actin(1:1000,Santa Cruz)孵育過夜。用TBS-T洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔、山羊抗小鼠IgG二抗在室溫下孵育1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)顯影，Image J軟件統(tǒng)計條帶灰度值。

1.9 ELISA檢測提取SAH 24 h后各組蛋白樣品，采用ELISA試劑盒（南京建成生物工程研究所）對TNF-α和IL-1β含量進(jìn)行檢測，具體方法參照說明說書。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS軟件(17.0版)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。符合正態(tài)分布的連續(xù)性變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Galectin-3對SAH后EBI的影響在SAH后24 h以內(nèi)，假手術(shù)+control-siRNA組和假手術(shù)+GalsiRNA組 無 小 鼠 死 亡,SAH模 型+control-siRNA組小 鼠24 h死 亡 率(14/46,30.43%)，SAH模 型+GalsiRNA組小鼠24 h死亡率(9/41，21.95%)。與假手術(shù)組比較，SAH模型+control-siRNA組SAH評分顯著增加，而SAH模型+Gal-siRNA組SAH評分顯著降低(P＜0.01，F(xiàn)=32.47，圖1A)，說明干擾Galectin-3的表達(dá)可以顯著減少SAH后的出血量。SAH模型+control-siRNA組小鼠神經(jīng)功能評分顯著低于假手術(shù)組，而SAH模型+Gal-siRNA組神經(jīng)功能評分顯著提高，說明干擾Galectin-3的表達(dá)能夠改善SAH后的神經(jīng)功能(P＜0.01，F(xiàn)=40.68，圖1B)。

圖1 Galectin-3對SAH后(A)SAH評分和(B)神經(jīng)功能評分的影響。

2.2 Galectin-3對SAH后血腦屏障的影響Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAH模型+control-siRNA組Galectin-3的蛋白表達(dá)量增加，緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的蛋白表達(dá)量顯著降低。與SAH模型+control-siRNA組比較，而SAH模型+Gal-siRNA組Galectin-3表達(dá)降低，并且緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的蛋白表達(dá)量顯著增加(P＜0.01，F(xiàn)=24.23，圖2A)。腦水腫和依文思藍(lán)滲出實驗結(jié)果顯示，SAH模型+GalsiRNA組抑制Galectin-3表達(dá)能夠顯著減少腦水含量和降低依文思藍(lán)的滲出含量(P＜0.01，F(xiàn)=25.98，圖2C)。以上實驗結(jié)果提示，抑制Galectin-3的表達(dá)能夠保護血腦屏障的破壞。

圖2 Galectin-3對蛛網(wǎng)膜下腔出血后血腦屏障的影響

2.3 Galectin-3對SAH后炎癥的影響與假手術(shù)組比較，SAH后TLR4表達(dá)增加，而抑制Galectin-3后TLR4的表達(dá)顯著降低(P＜0.01，F(xiàn)=31.55，圖3A)。ELISA實驗結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，SAH模型+control-siRNA組IL-1β和TNF-α的蛋白水平顯著升高，而抑制Galectin-3后IL-1β和TNF-α的蛋白水平明顯降低(P＜0.01F=40.02，圖3)。提示抑制Galectin-3能夠抑制SAH后炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

圖3 Galectin-3對蛛網(wǎng)膜下腔出血后炎癥的影響

2.4 Galectin-3對SAH后凋亡的影響與假手術(shù)組相比較，SAH+si-con組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目顯著增加，說明神經(jīng)元凋亡數(shù)量增多。而SAH+si-Gal組中，抑制Galectin-3能夠顯著減少TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)目。提示抑制Galectin-3能夠顯著抑制凋亡的發(fā)生。

圖4 Galectin-3對SAH后凋亡的影響（×400倍）

3 討論

SAH被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最具破壞性的疾病之一。在過去的幾十年里，對SAH的研究主要集中在防止SAH后遲發(fā)性腦缺血和改善預(yù)后的腦血管痙攣。然而，越來越多的證據(jù)表明，早期腦損傷是導(dǎo)致遲發(fā)性腦缺血、腦血管痙攣和預(yù)后不良的重要機制。最近的研究表明，SAH急性期血漿中基質(zhì)細(xì)胞蛋白Galectin-3水平升高與SAH程度、遲發(fā)性腦梗死和SAH患者預(yù)后差密切相關(guān)[14,18]。報道顯示[19]，檢測120例中國動脈瘤性SAH患者的血漿Galectin-3水平，并與同等數(shù)量的對照組進(jìn)行比較，患者血清Galectin-3水平高于對照組。Galectin-3是6個月病死率和不良預(yù)后的獨立預(yù)測因子，但Galectin-3在SAH中具體分子機制尚未報道。Galectin-3在腦損傷中的可能作用和分子機制，特別是SAH后的EBI。

本研究證實Galectin-3在小鼠實驗性SAH后蛋白表達(dá)上調(diào)，而小RNA干擾抑制Galectin-3的表達(dá)后，Galectin-3表達(dá)減少，腦出血量減少，神經(jīng)功能評分增加。并且與SAH模型組比較，抑制Galectin-3表達(dá)后，緊密連接蛋白ZO-1、claudin-5、occludin表達(dá)量顯著增加，從而減輕腦水腫和血腦屏障破壞。此外，Galectin-3可能通過TLR4引起SAH后血腦屏障的破壞。以上實驗結(jié)果提示抑制Galectin-3的表達(dá)能夠保護SAH后的早期腦損傷。

最初人們認(rèn)為Galectin-3在健康的大腦中正常情況下不會強烈表達(dá)，而最近的研究表明，Galectin-3在腦組織的星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在腦發(fā)育過程中起著神經(jīng)母細(xì)胞遷移的作用[20]。腦損傷后Galectin-3的表達(dá)增加[21]，主要來自小膠質(zhì)細(xì)胞，部分來自少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[22-23]。在神經(jīng)疾病中，Galectin-3與各種形式的缺血性腦血管病的關(guān)系研究最多，但也有些研究表明它與廣泛的神經(jīng)病理學(xué)有關(guān)。在小鼠缺血模型中，釋放的Galectin-3作為內(nèi)源性旁分泌TLR4配體，而去除Galectin-3則發(fā)揮了神經(jīng)保護作用[12]，這與我們的結(jié)果相一致。我們的研究為Galectin-3作為SAH后腦損傷潛在的新的治療或研究靶點提供基礎(chǔ)依據(jù)。