葉 鶯，徐晶潔，李 瑾，鮑文麗，祁 文，江 飛,

口腔醫(yī)療器械清洗、消毒、滅菌在口腔臨床具有非常重要的意義，是預(yù)防傳染病在口腔醫(yī)生、工作人員和患者之間的傳播主要手段之一[1]。由于口腔科器械種類眾多、體積小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、表面形貌凹槽和扭曲多，而口腔內(nèi)微生物種類眾多、充填和修復(fù)材料多樣、分泌物(血液、唾液等)復(fù)雜，使用后的口腔器械可能被這些含有感染性物質(zhì)的組織、材料污染。常規(guī)機械和化學(xué)清潔都相當(dāng)困難[2]。即使目前在口腔臨床中已有許多不同的清洗工具的方法，包括手工清洗、超聲波清洗機和清洗消毒機，但仍可能有大量口腔材料和生物碎片殘留在器械表面。潛在的感染物質(zhì)可以從被感染的個體傳染給其他患者[3]。目前清洗消毒流程處理口腔醫(yī)療小器械效果尚存爭議。

氧化鋅丁香酚(zinc oxide eugenol, ZOE)水門汀，由氧化鋅(質(zhì)量分數(shù)70%)和松香組成的粉末部分與丁香酚液體部分調(diào)合制成，能提供很好的密封效果，且丁香酚本身具有殺菌作用。被應(yīng)用于臨時性修復(fù)體黏結(jié)、齲源性可復(fù)性牙髓炎安撫治療、根管治療封藥等治療[4-7]。但該水門汀的固化、密封性能也給臨床上清洗牙體組織、口腔器械上的剩余ZOE水門汀材料帶來難度[8]。清除口腔金屬表面ZOE水門汀材料的方法包括：蒸汽清洗、超聲清洗和有機溶劑溶解，但步驟繁瑣，不適用于臨床處理大量口腔小器械的集中處理[9]。

本研究旨在優(yōu)化臨床上口腔器械上殘留ZOE水門汀的清洗方法。以常用的金剛砂車針(TR-13)為例，表面負載Caviton親水ZOE水門汀暫封材，在清洗流程中應(yīng)用丁香酚液體溶解器械表面固化的ZOE水門汀材料。所得結(jié)果從金剛砂車針上ZOE水門汀殘留稱重、表面清潔度方面，與目前《口腔器械消毒滅菌技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定口腔器械、器具和物品的清洗操作方法所得結(jié)果進行比較。為有效清洗口腔器械表面ZOE水門汀提供可行方案。由于我國目前公立口腔醫(yī)療機構(gòu)日常門診量大，所使用的一般流程是在門診先收集、放置，再集中送消毒。因此，我們在本研究中驗證了丁香酚清洗對集中放置器械是否具有抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

全能強效多酶清洗液(3M，美國)、醫(yī)用泡沫保濕清洗劑預(yù)處理型(Cinma，美國)、丁香酚(常熟尚齒齒科材料有限公司，中國)、金剛砂車針(TR-13，Mani，日本)、Caviton親水ZOE水門汀(GC，日本)、PBS緩沖液(Biosharp，中國)、氯化鈉(滬試、中國)、瓊脂、胰蛋胨、酵母提取物(均購自O(shè)xoid，美國)。

1.2 實驗器械

超聲波清洗機(德瑞，中國)、電子天平(精度0.1 mg，華潮高科，上海)、優(yōu)瑪醫(yī)用干燥柜(優(yōu)瑪，中國)、潔凈工作臺(蘇凈泰安，中國)、恒溫培養(yǎng)箱(Shellab，美國)、離心機(Thermo，美國)、恒溫振蕩器(旻泉儀器，中國)、高壓蒸汽滅菌器(致微，美國)、微孔板分光光度計(Spectramax，美國)、細菌濁度計(昕銳，中國)、SBC-12離子濺射儀(中科科儀，中國)、Phenom LE場發(fā)射掃描電鏡(Phenom-World公司，荷蘭)。

1.3 實驗分組

取全新的金剛砂車針，分為9組，每組10支。A～E組進行ZOE水門汀清洗實驗，E′、F、G、H組進行抑菌實驗。具體分組及操作見表1。

表1 實驗分組及樣品處理

1.4 樣品預(yù)處理

1.4.1 ZOE水門汀污染樣品制備 A～E組金剛砂車針直接在工作端均勻涂布一層Caviton親水ZOE水門汀暫封材料，晾干備用。E′、F組在菌液污染后涂布。

1.4.2 菌液污染樣品制備 接種環(huán)取少量金黃色葡萄球菌，涂抹于LB瓊脂培養(yǎng)板上，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，24 h后可用。選取菌落置于1.5 mL EP管中，PBS緩沖液吹打混勻，4 000 r/min離心5 min后棄上清，重復(fù)一次后，用LB培養(yǎng)基重懸至1×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌備用。E′、F、H組車針置于菌液中浸泡30 min后備用。

1.5 實驗步驟

1.5.1 水門汀清洗實驗 A組浸泡于清水中，B組浸泡于1∶200 3M全能強效多酶清洗液中，C組浸泡于醫(yī)用泡沫保濕清洗劑，D組浸泡于丁香酚液體中。每組各浸泡30 min后撈出，按編號放置于醫(yī)用小器械清洗盒中，流水沖洗后，放入1∶200配制的3M全能強效多酶清洗液超聲清洗5 min。為節(jié)省清洗時間，設(shè)置E組為直接丁香酚超聲清洗5 min。完成清洗后，干燥，電子天平稱重。

1.5.2 抑菌實驗 E′組車針預(yù)處理后丁香酚超聲清洗5 min；F組車針預(yù)處理后丁香酚超聲清洗5 min，多酶清洗液浸泡30 min；G為陰性對照組，不進行預(yù)處理及清洗浸泡；H為陽性對照組，浸泡菌液30 min。將E′、F、G、H組的車針分別以無菌生理鹽水沖洗3 s后置于含1 mL LB培養(yǎng)液的1.5 mL EP管中，于37 ℃、200 r/min的恒溫振蕩器中搖菌6、24 h。每管取100 μL菌液置于96孔板中，用微孔板分光光度計測定在600 nm處的光密度D[10-11]，通過分析細菌渾濁度檢驗多酶清洗液抑菌作用。

1.5.3 掃描電鏡檢測 各組車針經(jīng)過固定、脫水后使用SBC-12離子濺射儀進行噴金處理。Phenom LE場發(fā)射掃描電鏡采用10 kV高電壓、低束流、二次電子模式進行表面掃描，選取車針工作段中1/3處掃描拍攝。

1.6 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 18.0和GraphPad Prism7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和作圖，定量資料以均數(shù)±標準差表示，各實驗組數(shù)據(jù)差異分析采用單因素方差分析和兩兩比較進行評價。

2 結(jié) 果

2.1 不同清洗劑浸泡再經(jīng)多酶清洗液超聲清洗效果

金剛砂車針原始質(zhì)量、負載ZOE水門汀后的車針質(zhì)量結(jié)果如表2所示：各組車針質(zhì)量、表面負載的ZOE水門汀無差異。

表2 各實驗組車針及ZOE稱重結(jié)果及清除率

在肉眼觀察各組車針清洗效果，可明顯看出A、B、C組仍殘留大量ZOE水門汀，經(jīng)過丁香酚浸泡的D組車針表面的ZOE水門汀清除得較為干凈(圖1)。

在掃描電鏡下觀察：A組車針表面，未見明顯的ZOE水門汀脫落，車針金剛砂粒之間嵌滿致密的ZOE水門汀，大部分金剛砂粒被覆蓋；B組雖然在車針表面仍存在大量ZOE水門汀，但在電鏡下顯示ZOE水門汀結(jié)構(gòu)疏松，并且有少量脫落；C組表面ZOE水門汀脫落區(qū)域增大，脫落的斑塊較為明顯；D組車針表面未見明顯的ZOE水門汀，高光亮點區(qū)域為車針表面的金剛砂，金剛砂顆粒明顯，車針表面未見明顯ZOE水門汀覆蓋(圖1)。

黃色虛線標注區(qū)域a為ZOE水門汀脫落區(qū)域，紅色虛線標注區(qū)域b為TR-13車針表面的金剛砂顆粒

統(tǒng)計使用單因素方差分析

電鏡觀察后對每組車針進行稱重，與負載ZOE水門汀后車針的質(zhì)量對比，如表2所示：D組的ZOE水門汀清除率明顯高于其余三組；而A、B、C組ZOE水門汀清除率無明顯差異。清洗后車針質(zhì)量與清洗后質(zhì)量相比，D組車針表面ZOE水門汀殘留顯著少于其他組。

2.2 丁香酚浸泡后多酶清洗液超聲清洗與丁香酚超聲清洗ZOE水門汀效果比較

雖然丁香酚浸泡后，車針表面ZOE水門汀已大部松解、剝脫，但仍會有部分殘留?？紤]超聲清洗會顯著提高清洗效率，因此，本研究嘗試直接采用丁香酚對負載ZOE水門汀的車針進行清洗。如圖1所示：D組為丁香酚浸泡30 min后多酶超聲清洗5 min，E組為丁香酚直接超聲清洗5 min，大體照片中未見清洗效果差異。再次對兩組車針進行稱重，結(jié)果所示：D、E兩組車針表面ZOE水門汀殘余質(zhì)量(P=0.162 3)和清除率(P=0.168 1)無差異。因此，直接用丁香酚超聲清洗器械表面ZOE水門汀可大大縮短椅旁預(yù)處理時間。

2.3 丁香酚抑菌效果

在電鏡下觀察如圖2A所示，全新金剛砂車針(陰性對照G組)上未見有菌。金黃色葡萄球菌液浸泡的車針(陽性對照H組)上吸附大量細菌，劃紅色線區(qū)域為菌落部分。通過丁香酚超聲清洗后，車針表面僅存在少量細菌。經(jīng)過6 h搖菌培養(yǎng)，陽性對照組中渾濁度已有明顯增加(圖3，P<0.01)。而丁香酚超聲清洗后的實驗組中無明顯變化；直到搖菌培養(yǎng)24 h后，LB培養(yǎng)液明顯渾濁，說明已有較多細菌擴增(P<0.05)。因此，我們嘗試在丁香酚超聲清洗后配合使用多酶清洗液，觀察是否可以有較好的抑菌效果(各實驗組與陰性對照組相比)，結(jié)果如圖3顯示：丁香酚超聲清洗后，經(jīng)多酶浸泡(F組)可明顯抑制細菌增殖。

圖2 不同處理組抑菌效果(掃描電鏡)

*:P<0.05；**：P<0.01

3 討 論

根據(jù)國家頒布的WS 310-2016《醫(yī)院消毒供應(yīng)中心規(guī)范》[12]和WS 506-2016《口腔器械消毒滅菌技術(shù)規(guī)范》[9]的相關(guān)細則要求，對于結(jié)構(gòu)復(fù)雜不易清洗的口腔器械(如口腔小器械、刮匙等)：①宜保濕放置，保濕液可選擇應(yīng)用飲用水或酶類清洗劑；②使用專用超聲網(wǎng)籃超聲清洗；③要達到滅菌水平。目前，我院對于車針、銼針等口腔小器械使用后，在椅旁階段，采用多酶清洗液浸泡后送供應(yīng)室集中處理；當(dāng)車針器械進入供應(yīng)室后，再次用多酶溶液并配合超聲設(shè)備進行清洗；之后清水漂洗，進行煮沸預(yù)消毒；預(yù)消毒處理后對器械進行干燥并打包，最后使用高溫蒸汽滅菌。經(jīng)過這些流程，對于器械表面的活性微生物已可以達到滅菌效果。但由于沒有針對ZOE水門汀材料的專門清洗流程，因此，臨床中依然經(jīng)常肉眼可見ZOE水門汀材料附著在口腔小器械表面。我們針對這一現(xiàn)狀，在本研究中應(yīng)用臨床廣泛使用的成品Caviton親水ZOE水門汀暫封材污染粗糙表面的口腔小器械，希望通過清洗流程上的優(yōu)化，來解決這一問題。因為ZOE水門汀在器械表面有黏結(jié)性，清理不凈對滅菌后的口腔器械再次使用時雖無微生物來源的危害，但會降低器械在后續(xù)使用中的切削效率；另一方面，再次使用過程中先前黏附在器械上的材料碎屑還可能再次剝脫[13]。因此，我們需要對目前的口腔小器械清洗流程進行優(yōu)化。

對照上述規(guī)范中要求口腔小器械回收后在椅旁保濕的原則和方法，我們在實驗分組中設(shè)置了對車針進行清水浸泡、多酶浸泡的實驗組。因為ZOE水門汀有遇水加速凝固的性能[6]，顯然清水浸泡不利于溶解器械表面的ZOE水門汀。本研究通過對清水浸泡后車針表面進行掃描電鏡觀察和殘留物稱重，證實清水浸泡后金剛砂車針表面依然殘留大量ZOE水門汀。關(guān)于酶類清洗液，目前有單酶類和多酶類清洗液[14]。單酶類清洗液主要是蛋白酶，只能分解蛋白污物。多酶清洗液中主要包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，能更全面地分解清除醫(yī)療器械上的活性污染物[15]。目前我院使用的多酶溶液是全能強效多酶清洗液，其中包含了蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、表面活性液等成分。雖然這兩個實驗組車針稱重結(jié)果中多酶浸泡處理后的殘余重量(17.7±4.1)mg和清除率(50.83±17.16)%與清水浸泡處理組無明顯差別，但電鏡下能觀察到多酶浸泡后ZOE水門汀已有明顯的脫落(圖1中黃色虛線區(qū)域)，且ZOE水門汀表面出現(xiàn)多孔，質(zhì)地明顯更松散。類似的結(jié)果也可在保濕劑浸泡組觀察到。Cinma醫(yī)用保濕清洗劑中同樣含有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碳水化合物分解酶和表面活性劑。多酶浸泡組、保濕劑浸泡組對ZOE清理效果似乎與多酶中的酶成分關(guān)系不大，而得益于清洗液中的表面活性劑。而經(jīng)過丁香酚浸泡的實驗組不論從肉眼觀察，還是電鏡觀察，車針表面的ZOE水門汀已基本清除(殘余重量僅為(1.3±0.9)mg，清除率高達(95.06±3.69)%)。該結(jié)果說明：丁香酚也是ZOE水門汀的有效溶劑，以丁香酚浸泡表面黏有ZOE水門汀的處理是合理且有效的。本研究中僅用丁香酚浸泡30 min即可達到該清除效果，省時且并未增加門診椅旁護理過多負擔(dān)。丁香酚是口腔材料調(diào)配中的常用的液體溶劑，除ZOE水門汀外，還用于調(diào)制根管糊劑[16]。本研究應(yīng)用丁香酚清洗ZOE水門汀后，經(jīng)過流水沖洗、多酶浸泡，以及后續(xù)口腔器械常規(guī)清洗、消毒流程，本身丁香酚也具有揮發(fā)性，因此，清洗后未見器械表面有殘留。另一方面，丁香酚的安全性方面也有文獻報道：丁香酚對于不同物種細胞肽的親和力不同，其中哺乳動物細胞的親和力較差，這也證明其對人體細胞也具有較好的安全性[17]。即便器械表面有很微量的殘留，在口腔外用操作中，也不會有生物安全性方面的風(fēng)險。

目前在口腔器械消毒流程方面已有團隊提出“處理提前”[18]。臨床針對不同種類、不同污染源的器械進行針對性預(yù)處理，有利于提高后期供應(yīng)室集中處理的效率[19-20]。對口腔臨床大量使用后的污染的口腔小器械進行預(yù)處理，更有必要。上述討論中，雖然丁香酚浸泡30 min，再行多酶超聲5 min已能基本清除表面黏附的ZOE水門汀，但根據(jù)規(guī)范中的提示在“椅旁預(yù)處理”中加入超聲清洗，是否使得對ZOE水門汀的清理更快更簡便？因此，本研究比較丁香酚浸泡+多酶超聲清洗與直接丁香酚超聲清洗對清除口腔小器械表面ZOE水門汀的效果。結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)：直接將黏滿ZOE水門汀的TR-13車針置于丁香酚溶液中超聲5 min，與先丁香酚浸泡、再用多酶清洗液超聲清洗結(jié)果無明顯差異(P=0.162 3)。因此，在椅旁預(yù)處理時預(yù)備丁香酚溶液，將所收集的黏有ZOE水門汀的口腔小器械進行5 min超聲，即可解決目前消毒流程中無法有效清理口腔小器械表面殘留ZOE水門汀的問題。

上述實驗結(jié)果已說明使用丁香酚液超聲清洗含有ZOE水門汀的表面粗糙小器械能夠獲得很好效果。目前公立口腔醫(yī)療機構(gòu)日常門診大，難以做到每位患者診療后的器械逐一、立即送供應(yīng)室消毒。一般在門診先收集、放置，再集中送消毒流程。這就意味著門診集中放置時可能存在病原微生物滋生。目前臨床消毒清洗流程中所使用的多酶清洗液本身對病原微生物、蛋白質(zhì)等感染性物質(zhì)有滅活作用[14]。雖然在清除ZOE水門汀方面沒有明顯優(yōu)勢，但是否需要在丁香酚超聲去除ZOE水門汀后再次應(yīng)用多酶清洗液來應(yīng)對門診集中放置時可能存在的病原微生物滋生問題？本研究將消毒滅菌研究中常用的金黃色葡萄球菌[21-23]摻入ZOE水門汀，模擬口內(nèi)去除ZOE水門汀時口腔內(nèi)微生物與ZOE水門汀混合，觀察丁香酚超聲清除TR-13車針表面ZOE后，金黃色葡萄球菌的增殖情況。結(jié)果顯示單純使用丁香酚超聲清除表面ZOE水門汀后，TR-13車針表面依然有散在的金黃色葡萄球菌(圖2)，單純丁香酚超聲清洗的實驗組和丁香酚超聲清洗+多酶浸泡處理的實驗組，經(jīng)過6 h細菌培養(yǎng)，均未見明顯細菌增殖。經(jīng)過24 h的細菌培養(yǎng)后單純丁香酚超聲清洗的實驗組中金黃色葡萄球菌有輕微擴增。這一結(jié)果也與已有報道中所提及丁香酚具有抑菌作用相印證[24-25]，而追加多酶浸泡處理后的實驗組中抑菌效果更優(yōu)于單純使用丁香酚超聲清洗的實驗組(圖3)。說明在應(yīng)用丁香酚清除ZOE水門汀污染的粗糙小器械后，配合使用多酶浸泡處理，可獲得更好的抑菌效果。因此，我們提出直接用丁香酚超聲清洗粗糙器械表面的ZOE水門汀，可以明顯縮短椅旁預(yù)處理的時間，但在集中存放門診使用后器械的環(huán)節(jié)中需應(yīng)用多酶浸泡預(yù)處理后的器械，有效抑菌，防止在集中存放時發(fā)生二次污染。

4 結(jié) 論

針對口腔臨床粗糙表面的口腔小器械上難以清洗ZOE水門汀的問題，在椅旁應(yīng)用丁香酚超聲清洗，即可有效清除粗糙器械表面ZOE水門汀。但如果需要在集中消毒前暫時存放，則需要在丁香酚超聲清洗后，用多酶消毒劑浸泡保存，防止病原微生物的滋生造成二次污染。本研究所述對ZOE水門汀污染器械行椅旁消毒預(yù)處理，對口腔小器械上ZOE水門汀清除效果好，且方法簡便易行。