馬 萍，程璐瑤，金武龍，王 寧，翟榮萍

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)惡性程度高，侵襲性強(qiáng)，是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC)發(fā)生率較高的腫瘤。OSCC是口腔癌最常見的病理類型，約占口腔癌的90%[1]，其五年生存率較低[2]，晚期OSCC化療極易產(chǎn)生耐藥，且化療效果差[3-4]。因此，尋找新的分子靶標(biāo)對于OSCC的早期診斷和治療具有重要的意義。非SMC凝集素Ⅰ復(fù)合亞基D2(non-SMC condensin Ⅰ complex subunit D2, NCAPD2)是凝集素Ⅰ的一個(gè)組成亞基，位于染色體12p13.3上。凝縮素Ⅰ復(fù)合體是由兩個(gè)“染色體的結(jié)構(gòu)維護(hù)”ATPase SMC2/SMC4異源二聚體和三個(gè)調(diào)節(jié)亞基NCAPD2、CAP-G、CAP-H組成[5]。在真核細(xì)胞有絲分裂過程中對染色體結(jié)構(gòu)的改變和分離起著不可或缺的作用[6-7]。有研究表明NCAPD2與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在三陰乳腺癌中，NCAPD2與腫瘤細(xì)胞的周期、增殖和侵襲相關(guān)[8]。NCAPD2與OSCC的關(guān)系如何目前尚不清楚。鑒于HNSCC中一半以上病例是OSCC，因此本研究首先通過數(shù)據(jù)庫分析NCAPD2在HNSCC中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。我們發(fā)現(xiàn)NCAPD2在HNSCC組織中表達(dá)較高，這提示NCAPD2可能與OSCC的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，考慮為OSCC的一個(gè)分子治療靶點(diǎn)。因此，本研究旨在使用免疫組織化學(xué)的方法探討NCAPD2在OSCC中的表達(dá)情況，同時(shí)在OSCC細(xì)胞中探究NCAPD2的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 病例選擇

本實(shí)驗(yàn)所用組織標(biāo)本取自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔頜面外科經(jīng)手術(shù)治療，并且術(shù)后經(jīng)過病理學(xué)診斷確診的35例OSCC患者，為2018年1月至2020年12月期間手術(shù)患者。同時(shí)對應(yīng)收集距腫瘤邊緣≥2.0 cm的癌旁正常口腔黏膜組織作為對照。5例癌旁正常組織和35例OSCC組織，其中舌癌4例，頰癌13例，腭癌8例，牙齦癌6例，唇癌4例。其中男16例，女19例，患者年齡38～87歲，平均年齡65歲。按照口腔癌WHO臨床病理分級，Ⅰ～Ⅱ級為26例，Ⅲ～Ⅳ級為9例；按照AJCC口腔癌臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ級8例；按照是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為11例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24例。

1.2 細(xì)胞系

OSCC細(xì)胞系CAL-27和Tca8113購自北納生物。

1.3 主要試劑

NCAPD2抗體購自美國Abcam公司(1∶50，Abcam，英國，ab198019)，免疫組織化學(xué)試劑盒購自DAKO公司(貨號(hào)：Denmark, K8000)，磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)、檸檬酸緩沖液、蘇木精染劑和二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色劑均購自上海齊一生物有限公司，DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購自美國Gibco公司。

1.4 生物信息學(xué)分析

應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析HNSCC組織和正常頭頸組織中NCAPD2的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。

1.5 免疫組化染色

將組織切片脫蠟、修復(fù)、檸檬酸封閉，并與NCAPD2 抗體在4 ℃下孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5次后，加入通用二抗 IgG，樣品在25 ℃下孵育30 min。隨后用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺和蘇木精對組織切片進(jìn)行染色以進(jìn)行可視化。 使用顯微鏡(奧林巴斯，日本)獲取圖像。結(jié)果判讀：NCAPD2的表達(dá)以細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為組織化學(xué)染色陽性反應(yīng)。根據(jù)染色強(qiáng)度的評分標(biāo)準(zhǔn)：陰性無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，深褐色為3分。根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)所占比例的評分標(biāo)準(zhǔn)：0%～25%(包含0%，不包含25%)為1分，25%～50%(包含25%，不包含50%)為2分，50%～75%(包含50%，不包含75%)為3分，≥75%為4分。結(jié)果判讀：陽性細(xì)胞評分×染色顏色強(qiáng)度評分判斷IHC結(jié)果，分值越高抗體表達(dá)越高。0 分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)， 9～12分為(+++)。其中(+)和(++)為低表達(dá)，(++)和(+++)為高表達(dá)。

1.6 質(zhì)粒構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)和慢病毒感染

以NCAPD2基因?yàn)槟０逶O(shè)計(jì)了NCAPD2 特異性靶序列shNCAPD2(5′-CAGGTTCTCAGTGGCGATCAA-3′)和一個(gè)陰性對照序列shCtrl (5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)并整合到 BR-V108載體(上海生物科學(xué)有限公司)。使用 EndoFree Maxi Plasmid Kit (Tiangen, DP118)擴(kuò)增和提取質(zhì)粒。用3種質(zhì)粒(BRV-108、PMD2.G 和 pSPAX2)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞以獲得慢病毒。CAL-27和Tca8113細(xì)胞中加入10% DMEM的完全培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后，用含Opti-MEM和 Polybrene的慢病毒載體感染細(xì)胞12 ～ 16 h，然后更換新鮮的培養(yǎng)基。72 h后用熒光顯微鏡觀察感染效率。通過qPCR和蛋白印跡法驗(yàn)證NCAPD2敲低效率。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

通過Celigo全視野細(xì)胞成像分析儀對細(xì)胞實(shí)現(xiàn)拍照和自動(dòng)計(jì)數(shù)，從而大通量地檢測基因?qū)?xì)胞增殖的影響。Celigo是基于全自動(dòng)圖像采集與圖像數(shù)據(jù)分析的高通量篩選系統(tǒng)。通過慢病毒感染細(xì)胞，使目標(biāo)細(xì)胞表達(dá)GFP(綠色熒光)，在HCS增殖檢測實(shí)驗(yàn)中，檢測目標(biāo)即為感染病毒后表達(dá)GFP的目標(biāo)細(xì)胞(96孔板)。Celigo能識(shí)別帶綠色熒光的細(xì)胞并拍照即讀板。然后通過軟件對拍照的圖像進(jìn)行分析處理，計(jì)算孔板中不同組別含有的細(xì)胞數(shù)目。連續(xù)讀板5 d后，即可繪制出細(xì)胞生長曲線圖，從而反映出細(xì)胞增殖狀況。增殖率=((每組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)值-該組第一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)值)/該組第一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)值)×100%。抑制率=((實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)值-實(shí)驗(yàn)組第一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)值)/(對照組細(xì)胞各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞計(jì)數(shù)值-對照組第一天的細(xì)胞計(jì)數(shù)值))×100%。

1.8 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)組(感染慢病毒shNCAPD2組)和對照組(感染慢病毒shCtrl組)細(xì)胞分別進(jìn)行慢病毒感染，通過胰酶消化，進(jìn)行離心和洗滌后棄上清，將binding buffer加入細(xì)胞沉淀中收集細(xì)胞，使用Annexin V-APC進(jìn)行染色，24 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，按照凋亡檢測試盒說明書及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)

用RIPA裂解液裂解細(xì)胞后提取總蛋白，用BCA試劑盒測蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠后進(jìn)行蛋白電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過夜。洗膜后加二抗室溫下孵育1 h，之后進(jìn)行顯色反應(yīng)，使用電化學(xué)發(fā)光(electrochemical luminescence，ECL)曝光液曝光。

1.10 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)

使用Trizol試劑提取RNA，然后用Hiscript QRT Supermix for qPCR (+gDNA wiper)(Vazyme，南京)試劑盒獲得cDNA，最后使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (Vazyme, Q111-02)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR。引物序列為NCAPD2：正向5′-TCCATCAAACATCTTCCACCAC-3′；反向5′-TGAGGCCAGGATCTATACTTCG-3′。GAPDH:正向5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；反向5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。GAPDH作為內(nèi)參，用2-ΔΔCT法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。數(shù)據(jù)分析采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，配對比較采用Student′st檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用Mann-WhitneyU分析和Spearman相關(guān)性分析NCAPD2表達(dá)與OSCC病理分級的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)庫分析NCAPD2在HNSCC中的表達(dá)

應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)NCAPD2 mRNA在520例HNSCC組織中表達(dá)水平顯著高于44例正常頭頸組織(P<0.001，圖1A)。進(jìn)一步通過Ualcan數(shù)據(jù)庫分析NCAPD2 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與HNSCC臨床分期、病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在不同臨床分期及不同病理分級的HNSCC組織中NCAPD2的表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織(P<0.001，圖1B～1C)；且HNSCC中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)水平均高于癌旁正常組織(P<0.001，圖1D)。

A:HNSCC中NCAPD2的表達(dá)；B:不同臨床分期的HNSCC組織中NCAPD2的表達(dá)；C:不同病理分級的HNSCC組織中NCAPD2的表達(dá)；D:HNSCC中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中NCAPD2的表達(dá)

2.2 NCAPD2蛋白在臨床OSCC病例組織中的表達(dá)

為了驗(yàn)證NCAPD2在OSCC組織中的表達(dá)情況，我們使用免疫組化染色的方法驗(yàn)證了NCAPD2蛋白在OSCC組織及正常組織的表達(dá)情況，結(jié)果顯示NCAPD2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，NCAPD2在OSCC組織中的低表達(dá)占比為45.7%(16/35)，高表達(dá)為54.3%(19/35)。與癌旁正常組織相比，NCAPD2蛋白表達(dá)水平在OSCC組織中明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，圖2，表1)。

表1 NCAPD2在OSCC和對照組織中的表達(dá)

A:癌旁組織中NCAPD2蛋白的表達(dá) (-);B:OSCC組織NCAPD2弱陽性(+);C:OSCC組織NCAPD2陽性染色(++);D:OSCC組織NCAPD2強(qiáng)陽性(+++)。標(biāo)尺：100 μm

2.3 NCAPD2蛋白的表達(dá)水平與OSCC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

為進(jìn)一步分析NCAPD2蛋白表達(dá)水平與OSCC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系，通過Mann-WhitneyU

分析和Spearman相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)NCAPD2蛋白的表達(dá)與OSCC的病理分級顯著相關(guān)，但與患者的年齡、性別、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況均無關(guān)(P>0.05，表2)。提示NAPD2蛋白可能參與OSCC發(fā)生、發(fā)展的過程。

表2 NCAPD2表達(dá)與OSCC患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

2.4 NCAPD2基因敲減細(xì)胞模型的構(gòu)建

在Tca8113和CAL-27細(xì)胞株中，通過轉(zhuǎn)染shNCAPD2構(gòu)建NCAPD2敲減細(xì)胞模型，陰性對照為轉(zhuǎn)染shCtrl。通過觀察固定在慢病毒載體上的綠色熒光蛋白(GFP)證實(shí)兩株細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率均>80%(圖3A)。qPCR結(jié)果表明，NCAPD2在Tca8113和CAL-27細(xì)胞中的表達(dá)分別下降77.41%和61.94%(P<0.001，圖3B)。Western Blot結(jié)果顯示，NCAPD2敲減細(xì)胞模型成功建立(圖3C)。

A:通過觀察熒光評估 Tca8113和CAL-27 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率, 放大200倍，標(biāo)尺：100 μm； B:qPCR 檢測Tca8113和CAL-27 細(xì)胞中NCAPD2的敲低效率; C:蛋白質(zhì)印跡證實(shí) NCAPD2在Tca8113和CAL-27細(xì)胞中的敲除情況；*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001

2.5 NCAPD2基因表達(dá)變化對CAL-27和 Tca-8113 細(xì)胞增殖的影響

通過HCS探究NCAPD2敲減后對OSCC細(xì)胞系CAL-27和Tca8113增殖能力的影響。結(jié)果表明，相比對照shCtrl組，NCAPD2敲減的shNCAPD2組細(xì)胞增殖能力明顯下降。此外，與對照組shCtrl相比，NCAPD2敲減后細(xì)胞的生長受到明顯抑制，Tca8113和CAL-27細(xì)胞的增殖抑制率分別為45.3%和53.2%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4A、B)。

2.6 NCAPD2基因表達(dá)變化對口腔癌CAL-27和Tca-8113 細(xì)胞凋亡的影響

通過流式細(xì)胞儀檢測NCAPD2敲減后對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，NCAPD2的敲減促進(jìn)了OSCC細(xì)胞Tca8113和CAL-27的凋亡，凋亡率分別為5.04%(倍數(shù)變化=5)和1.91%(倍數(shù)變化=1.9)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4C、D)。

2.7 Tca8113細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的檢測

從Western Blot結(jié)果可以看出，相比于對照組，NCAPD2敲減后，Tca8113細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和p53表達(dá)上調(diào)，而抗凋亡蛋白Bcl-2和p21表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4E)。

A:NCAPD2敲減后對Tca8113細(xì)胞增殖能力的影響；B:NCAPD2敲減后對CAL-27細(xì)胞增殖能力的影響；C:NCAPD2敲減后對Tca8113細(xì)胞凋亡的影響；D:NCAPD2敲減后對CAL-27細(xì)胞凋亡的影響；E:Tca8113細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的檢測。與對照組相比，*:P<0.05，**:P<0.01，***:P<0.001

3 討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是口腔癌最常見的亞型，約占口腔癌的90%，它是一種易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤[9]，且治療效果不佳，五年生存率僅有50%[10]。因此， 迫切需要探索OSCC的分子基礎(chǔ)并制定有效的治療策略， 從而最終提高OSCC患者的生存率。

凝集素在有絲分裂染色體凝聚過程中起著重要作用[11]。在真核細(xì)胞中有兩種不同類型的凝集素復(fù)合物，分別稱為凝集素Ⅰ復(fù)合物和凝集素Ⅱ復(fù)合物。經(jīng)典凝集素復(fù)合物共享同一對核心亞基，稱為染色體結(jié)構(gòu)維持蛋白(structural maintenance of chromosome proteins，SMC)和3個(gè)不同的非SMC亞基[12]。在人類細(xì)胞中，凝集素Ⅰ的非SMC亞基是NCAPD2、NCAPG和NCAPH，而凝聚素Ⅱ復(fù)合物中的相應(yīng)對應(yīng)物是NCAPD3、NCAPG2和NCAPH2[13]。NCAPD2是位于染色體12p13.3上的凝集蛋白Ⅰ中的三個(gè)非SMC亞基之一。NCAPD2在真核細(xì)胞有絲分裂過程中對染色體結(jié)構(gòu)的改變和分離起著不可或缺的作用[6-7]。轉(zhuǎn)染研究和定點(diǎn)誘變證實(shí)非SMC亞基NCAPD2是E2F的靶標(biāo)[14]。NCAPD2具有HEAT重復(fù)序列，介導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用[15]。NCAPD2通過其羧基末端的雙核核定位信號(hào)介導(dǎo)凝集素復(fù)合體在染色質(zhì)上的募集和靶向定位[16]，主要參與細(xì)胞周期過程中染色體的凝集和分離。

20多年的研究，NCAPD2的基本生物學(xué)功能已被闡明。其與人類疾病關(guān)系的研究處于起步階段。據(jù)報(bào)道NCAPD2與神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病有關(guān)。NCAPD2基因多態(tài)性與晚發(fā)性阿爾茨海默病[17-18]和漢族人群帕金森病有關(guān)[19]。Zhang等[8]報(bào)道了NCAPD2與乳腺癌之間具有密切關(guān)系。NCAPD2在三陰乳腺癌細(xì)胞中參與了包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂和侵襲等多種與腫瘤惡性表型密切相關(guān)的生物學(xué)功能。除此之外，也有研究表明卵巢癌中 NCAPD2的異常表達(dá)可能是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素[20]。最近有研究表明NCAPD2在結(jié)直腸癌臨床組織和腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，并在促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生和生長中發(fā)揮作用[21]。

本研究結(jié)果表明NCAPD2在OSCC中表達(dá)上調(diào)，并參與OSCC細(xì)胞的增殖、凋亡等過程。IHC染色顯示NCAPD2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，這與Schmiesing等的研究結(jié)果相符，即在間期至分裂前期大部分NCAPD2與SMC4-SMC2復(fù)合物從染色體解離分布在細(xì)胞質(zhì)中，少部分復(fù)合物保留在染色體上[22]。此外，免疫組化結(jié)果表明與癌旁正常組織相比，NCAPD2蛋白表達(dá)水平在OSCC組織中明顯升高，這與Jing等的研究結(jié)果一致，即在結(jié)腸癌中NCAPD2的表達(dá)水平較癌旁組織升高[21]。

之后，我們使用慢病毒感染構(gòu)建了NCAPD2低表達(dá)的OSCC細(xì)胞模型進(jìn)行驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，NCAPD2敲減組細(xì)胞增殖能力明顯下降。Tca8113和CAL-27細(xì)胞的增殖抑制率分別為45.3%和53.2%，與此同時(shí)，Tca8113細(xì)胞的凋亡率為5.04%，而CAL-27細(xì)胞的凋亡率為1.91%，兩組細(xì)胞的增殖與凋亡結(jié)果相反。在Tca8113細(xì)胞中進(jìn)行的凋亡相關(guān)蛋白的檢測結(jié)果表明相比于對照組，NCAPD2敲減后，Tca8113細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax和p53表達(dá)增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2和p21表達(dá)水平降低，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測結(jié)果與細(xì)胞的表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。本研究表明NCAPD2在負(fù)性調(diào)控促凋亡蛋白Bax和p53表達(dá)的同時(shí)，可正向調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2和p21的表達(dá)，從而通過抑制Tca8113和CAL-27細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮促癌作用。

綜上所述，NCAPD2在OSCC中高表達(dá)，且與病理分級和臨床分期相關(guān)，同時(shí)，NCAPD2能夠促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡，可能與其抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。這些結(jié)果表明NCAPD2可能與OSCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，有望成為OSCC治療的潛在靶點(diǎn)。

盡管我們的研究發(fā)現(xiàn)NCAPD2在OSCC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，并與OSCC細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)，是一種潛在的OSCC預(yù)后標(biāo)志物。但是具體分子機(jī)制如何，我們需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。