吳媛霞，劉俊芬，康榮彥，崔向榮，武學(xué)清，劉艷玲

(山西省兒童醫(yī)院，山西省婦幼保健院，山西 太原 030013)

子宮內(nèi)膜厚度與容受性是體外受精—胚胎移植妊娠成敗的關(guān)鍵。其中，一定的子宮內(nèi)膜厚度是胚胎著床的基本條件，子宮內(nèi)膜過薄可導(dǎo)致胚胎種植率明顯降低[1-4]。子宮內(nèi)膜薄常見的全身性原因有雌激素水平低、孕激素水平不足、存在排卵障礙和缺乏生長激素等，也有局部的原因，例如內(nèi)膜損傷、粘連和缺失等。單純內(nèi)分泌因素造成的子宮內(nèi)膜薄，臨床上可以用激素調(diào)整，適量的雌激素、孕激素可以在一定程度上增加子宮內(nèi)膜的厚度，改善子宮內(nèi)膜薄的癥狀。而局部原因，如內(nèi)膜損傷、粘連和缺失多因?yàn)槎啻嗡幬锪鳟a(chǎn)，或者人工流產(chǎn)動(dòng)作過重、感染等，都可能引起子宮內(nèi)膜變薄，甚至嚴(yán)重?fù)p傷子宮內(nèi)膜，這種情況下一般需要很長時(shí)間恢復(fù)，有的患者甚至無法恢復(fù)。目前臨床上治療薄型子宮內(nèi)膜的方法很多，包括西藥、手術(shù)和傳統(tǒng)中醫(yī)療法，但無特效方法。非正常生理性子宮內(nèi)膜薄治療需根據(jù)病因補(bǔ)充激素或進(jìn)行手術(shù)治療，各家治療效果報(bào)道不一，對(duì)頑固性的薄型內(nèi)膜治療效果不明顯。由于倫理等問題，某些實(shí)驗(yàn)性治療方法及病理機(jī)制的探討難以直接在患者體內(nèi)進(jìn)行，而有效的薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型可以為研究其病理特點(diǎn)及探索有效治療方法提供實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。

目前，國內(nèi)外對(duì)于建立薄型子宮內(nèi)膜的動(dòng)物模型均有研究和報(bào)道。模型有大鼠[5-7]、小鼠[8-9]、新西蘭兔[10]、比格犬[11]及恒河猴[12]；方法有機(jī)械損傷、感染損傷、缺血損傷、熱損傷、化學(xué)損傷、光學(xué)損傷等。其中無水乙醇灌注SD大鼠宮腔建立薄型子宮內(nèi)膜模型[6]使用最多最廣泛。張引紅等[13]借鑒了該方法，選用雌性C57BL/6J完成了小鼠薄型子宮內(nèi)膜模型。本實(shí)驗(yàn)在該方法上進(jìn)行改良，將無水乙醇通過陰道灌注進(jìn)入小鼠宮腔，利用無水乙醇的脫水及蛋白質(zhì)變性作用，對(duì)內(nèi)膜進(jìn)行損傷，完成小鼠薄型子宮內(nèi)膜模型的改良。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與造模方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來源

性成熟的有正常動(dòng)情周期的健康雌性ICR小鼠(清潔級(jí)，30只，鼠齡6～8周，體質(zhì)量25～35 g)由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)條件：山西醫(yī)科大學(xué)屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫23～27 ℃，日溫差不超過3 ℃，濕度50%～60%，光照明暗時(shí)間各為12 h，自由獲取食物和水。

1.2 方法與步驟

1.2.1 分組

將納入實(shí)驗(yàn)的小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組、模型1組和模型2組，每組10 只。對(duì)照組：經(jīng)陰道宮腔注射生理鹽水；模型1組：開腹宮腔注射無水乙醇，0.9%氯化鈉溶液沖洗2次。模型2組：為改良模型組，經(jīng)陰道宮腔注射無水乙醇，0.9%氯化鈉溶液沖洗2次。

1.2.2 造模步驟

模型1組：擇動(dòng)情期行造模術(shù)，以0.2 mL/100 g，5%水合氯醛腹腔注射麻醉動(dòng)物，生效后用膠布仰臥位固定好四肢。小鼠沿腹部正中白線處剪毛，腹部用75%乙醇進(jìn)行消毒，鑷子提起皮膚，剪刀沿腹中線開腹，逐層分離，各層切口約1 cm。進(jìn)入腹腔，膀胱后方可見粉紅色V狀子宮，粗細(xì)均勻。分離子宮(小鼠子宮為一個(gè)Y型子宮，主要造模選取上部分V段兩側(cè)，暴露出子宮的近陰道端及卵巢端即可)，用血管鉗鉗夾子宮近端和遠(yuǎn)端，將注射器針頭輕輕插入小鼠陰道一側(cè)子宮近端，用無菌鹽水紗布保護(hù)周圍組織以防無水乙醇外溢。注射器針頭進(jìn)入宮腔，且與子宮縱軸保持平行，于子宮近陰道端緩慢注入0.1 mL無水乙醇，保持宮腔處于充盈狀態(tài)，同時(shí)盡量保證乙醇不外溢。針頭停留4～5 min后緩慢將乙醇抽吸出來，保持注射器針頭在宮腔內(nèi)，輕輕擠壓出殘留的乙醇，并用生理鹽水沖洗1～2次。另一側(cè)子宮采用同樣方法處理(見圖1a)，常規(guī)給予青霉素粉劑適量均勻涂抹在小鼠腹部創(chuàng)面，逐層關(guān)腹。

模型2組：模型1組所需無水乙醇藥量為每只0.2 mL，推算模型2組通過陰道灌注95%乙醇造模注射乙醇藥量為每只0.2～0.3 mL。為了測試經(jīng)陰道灌注無水乙醇是否會(huì)經(jīng)輸卵管流入小鼠腹腔引起損傷，先用美蘭經(jīng)陰道灌注子宮，用靜脈留置針(退內(nèi)芯4～5 mm)沿小鼠陰道順勢(shì)插入小鼠子宮近端(雌性小鼠子宮角與輸卵管連接，輸卵管呈盤曲狀，左右各一條，前端喇叭口朝向卵巢，后端緊接于子宮)。固定留置針，緩慢注入美蘭，保持宮腔處于充盈狀態(tài)，共需推注0.2～0.3 mL美蘭(需操作者推注手感略有阻力時(shí)立即停止)，盡量保證美蘭不經(jīng)陰道外溢，切開小鼠腹壁皮膚，暴露雙側(cè)子宮，觀察可見雙側(cè)子宮充盈呈現(xiàn)藍(lán)色，腹腔內(nèi)無美蘭流出(見圖1b和圖1c)。

(a) (b) (c)

對(duì)照組：用靜脈留置針(退內(nèi)芯約4～5 mm)沿小鼠陰道順勢(shì)插入小鼠子宮近端，固定留置針，緩慢注入0.9%氯化鈉注射液0.2～0.3 mL，針頭停留4～5 min后緩慢將其抽吸出來。所有小鼠造模后正常清潔飼養(yǎng)3個(gè)動(dòng)情周期，過量麻醉處死小鼠，再以同樣方式行剖腹手術(shù)取雙側(cè)子宮，以40 g/L多聚甲醛固定小鼠子宮，包埋后切片(厚度4 μm)，采用蘇木精-伊紅(HE)染色，在正置光學(xué)顯微鏡下(Nikon Eclipse Ci，日本尼康)觀察。

1.3 薄型子宮小鼠的鑒定

1.3.1 子宮外觀觀察

術(shù)后第3 個(gè)動(dòng)情期取樣，對(duì)是否有腹腔粘連、宮腔粘連、子宮外觀形態(tài)等進(jìn)行觀察。

1.3.2 子宮內(nèi)膜厚度測量

常規(guī)HE染色后，采用正置光學(xué)顯微鏡圖像分析系統(tǒng)測量子宮內(nèi)膜厚度。小鼠子宮由內(nèi)至外分為漿膜層、肌層、內(nèi)膜層，子宮內(nèi)膜厚度選取子宮肌層到子宮腔距離的平均值。

1.3.3 組織形態(tài)學(xué)觀察

常規(guī)HE染色后，在正置光學(xué)顯微鏡下觀察子宮內(nèi)膜腺體結(jié)構(gòu)及數(shù)量、子宮內(nèi)膜血管分布情況、各層細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)小鼠基本情況

造模過程中，對(duì)照組無小鼠死亡；模型1組和模型2組各有1只小鼠死亡，補(bǔ)齊小鼠繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)，兩組其余存活小鼠飲食正常，精神狀態(tài)良好，動(dòng)情周期規(guī)律。對(duì)照組與模型1組、模型2組小鼠的一般狀況相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析原因：模型1組小鼠死亡與麻醉手術(shù)操作過程中失溫或小鼠自身體質(zhì)差有關(guān)。模型2組小鼠死亡是由于靜脈留置針從陰道插入過深，刺破子宮壁導(dǎo)致無水乙醇漏入腹腔所致。

2.2 造模手術(shù)過程觀察

模型1組術(shù)前小鼠子宮外觀呈粉紅色，有光澤，注射過程中損傷側(cè)子宮充盈明顯，子宮腔膨脹增粗、顏色偏白、彈性降低、質(zhì)地變硬。模型2組術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后均未見明顯異常，個(gè)別小鼠在灌注過程中可見下腹部略隆起。

2.3 子宮內(nèi)膜厚度測量

對(duì)照組子宮內(nèi)膜厚度為(426.21±31.27) μm，模型1組為(145.50±23.36) μm，模型2組為(209.46±24.59) μm。單因素方差分析結(jié)果顯示：三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=305.025，P<0.01)。對(duì)照組與模型1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.738，P<0.01)；對(duì)照組與模型2組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.228，P<0.01)；模型2組與模型1組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.963，P<0.01)(見圖2)。

(a) (b) (c)

2.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

與對(duì)照組相比，模型1組、模型2組子宮內(nèi)膜層明顯變薄，宮腔隙增大，其中模型1組變化更明顯；內(nèi)膜上皮及腺上皮細(xì)胞扁平化，腺體、血管稀疏(見圖3)。

(a) (b) (c)

3 討 論

注射無水乙醇損傷子宮內(nèi)膜建立薄型子宮內(nèi)膜動(dòng)物模型是高紅等[14]最先建立的SD大鼠薄型子宮內(nèi)膜模型，其表現(xiàn)符合內(nèi)膜生長受限的特點(diǎn)，但術(shù)后大鼠存活率為70%，常常造成大鼠腹腔嚴(yán)重粘連。研究者[14]在此基礎(chǔ)上采用血管鉗鉗夾子宮近端和遠(yuǎn)端，用生理鹽水紗布?jí)|入腹腔保護(hù)周圍臟器，以避免損傷粘連，大大提高了造模后存活率，同時(shí)將該方法應(yīng)用于小鼠模型獲得成功。目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型多是采取開腹宮腔灌注造模，缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，可能引起小鼠感染甚至死亡，具有創(chuàng)傷性，因此作者結(jié)合臨床觀察，經(jīng)過多次文獻(xiàn)研究、預(yù)實(shí)驗(yàn)、反復(fù)討論與分析，最終確定創(chuàng)立了一種改良方法，創(chuàng)傷性較小。在技術(shù)熟練的情況下通過陰道灌注無水乙醇造模，雙側(cè)子宮均可成功灌注無水乙醇，該方法同時(shí)可以陰道給藥治療，避免開腹對(duì)小鼠造成的傷害，降低了感染率，與臨床發(fā)病過程更相似。本研究模型2組子宮內(nèi)膜厚度與對(duì)照組相比明顯變薄，同時(shí)發(fā)現(xiàn)模型1組子宮內(nèi)膜厚度與模型2組相比，子宮內(nèi)膜明顯更薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分析其原因，與模型1組采用血管鉗鉗夾子宮近端和遠(yuǎn)端后注射無水乙醇導(dǎo)致子宮過度充盈或模型2組無水乙醇灌注后子宮充盈不足有關(guān)。經(jīng)上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)，通過經(jīng)陰道向?qū)m腔注射無水乙醇可成功建立薄型子宮內(nèi)膜的ICR小鼠模型，為臨床研究薄型子宮內(nèi)膜的病理機(jī)制、修復(fù)機(jī)制，尋求有效治療方法，提供了理想的動(dòng)物模型。