周朝忠，康興東，毛金娣，曠春蘭

（江西普正制藥股份有限公司，江西 343100）

旱辣蓼為蓼科植物旱辣蓼（Polygonum flaccidum Meisn.）的干燥全草，又名辣蓼草、辣子草、紅辣蓼、蓼子草等，具有除濕，化滯，散瘀止血，祛風(fēng)止癢，解毒的功效，用于濕滯內(nèi)阻，脘悶腹痛，泄瀉，痢疾，小兒疳積，崩漏，經(jīng)閉痛經(jīng)，風(fēng)濕痹痛，便血，濕疹，皮膚瘙癢，足癬，癰腫等疾病的治療，主產(chǎn)于江西、廣西、貴州、福建等地［1］。旱辣蓼的成分包括揮發(fā)油、鞣質(zhì)、酚酸、黃酮、蒽醌等。沒(méi)食子酸等鞣質(zhì)類(lèi)成分具有收斂、止瀉、止血、抗菌、抗病毒等作用［3］；黃酮類(lèi)成分具有抗菌、抗病毒、抗炎等作用；鞣質(zhì)類(lèi)成分和黃酮類(lèi)成分均是辣蓼的主要藥效作用成分［3-5］。

辣蓼用藥歷史悠久，其標(biāo)準(zhǔn)收載于1977年版《中國(guó)藥典》、2010版《中國(guó)獸藥典》和北京、上海、貴州等多個(gè)省的地方標(biāo)準(zhǔn)中，其中1977年版《中國(guó)藥典》中辣蓼項(xiàng)下包括水辣蓼和旱辣蓼兩種來(lái)源，但標(biāo)準(zhǔn)較為粗疏，僅做性狀鑒別［2］。近年來(lái)對(duì)水辣蓼的研究相對(duì)較多，而旱辣蓼研究較少。本試驗(yàn)采集10批旱辣蓼，考查其顯微特征、TLC薄層色譜特征、水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物、重金屬及有害元素等方面；此外，因沒(méi)食子酸等鞣質(zhì)類(lèi)成分是辣蓼治療痢疾的主要作用成分，沒(méi)食子酸是沒(méi)食子酸鞣質(zhì)的單體成分［4］，故本研究選擇采用HPLC法測(cè)定沒(méi)食子酸含量，為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立和規(guī)范使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料、儀器與試藥

1.1 材料 試驗(yàn)所用旱辣蓼藥材共10批（其中產(chǎn)地采集6批，藥材市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)4批），經(jīng)江西普正制藥股份有限公司吳永忠研究員鑒定為旱辣蓼Polygonum flaccidum Meisn.的干燥全草。具體信息見(jiàn)表1。

表1 旱辣蓼樣品信息

1.2 儀器設(shè)備 美國(guó)Waters1525-2489型高效液相色譜儀；AUW2200十萬(wàn)分之一電子分析天平（SHIMADZU島津）；AB104-N萬(wàn)分之一天平（梅特勒-托利多）；JK-300型超聲波清洗儀（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司）；SK160 Digital生物顯微鏡（麥克迪奧光學(xué)儀器有限公司）；SX2-4-10馬弗爐（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠(chǎng)）；TAS-990AFT原子吸收分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 試劑與試藥 沒(méi)食子酸（批號(hào)110831-200803）、蘆丁（批號(hào)100080－200707）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，西隴科學(xué)股份有限公司）、甲醇（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司）、磷酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司）、鹽酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑有限公司），水為自制超純水；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠(chǎng)）、聚酰胺薄膜板（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠(chǎng)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別 取旱辣蓼莖橫切面切片，置顯微鏡下觀(guān)察；旱辣蓼藥材粉碎，過(guò)四號(hào)篩，挑取少許置載玻片上，分別制備裝片和透化片，置顯微鏡下觀(guān)察。

2.1.1 莖橫切面特征 表皮細(xì)胞1列，外被角質(zhì)膜，下皮層有2~3列厚角細(xì)胞，皮層為1列薄壁細(xì)胞，含有草酸鈣簇晶。中柱鞘纖維束斷續(xù)排列成環(huán)狀，壁木質(zhì)化。初生韌皮部較窄，部分形成層不明顯，木質(zhì)部導(dǎo)管單個(gè)或數(shù)個(gè)相聚，呈放射狀或環(huán)狀排列。髓射線(xiàn)寬7~16列細(xì)胞，線(xiàn)狀排列。髓部薄壁細(xì)胞大，壁薄，髓中細(xì)胞萎縮呈不規(guī)則空洞。本品皮層、髓部薄壁細(xì)胞內(nèi)含草酸鈣簇晶和淀粉粒，木質(zhì)部導(dǎo)管為螺紋導(dǎo)管。見(jiàn)圖1。

圖1 旱辣蓼莖橫切面顯微圖

2.1.2 粉末特征 淀粉粒單粒長(zhǎng)圓形，直徑20～30 μm；可見(jiàn)草酸鈣簇晶，直徑20～40 μm；草酸鈣方晶，長(zhǎng)20～40 μm；可見(jiàn)非腺毛，稍彎曲，長(zhǎng)100～300 μm；可見(jiàn)螺紋導(dǎo)管，長(zhǎng)60～80 μm。見(jiàn)圖2。

2.2 薄層色譜鑒別 黃酮類(lèi)成分是辣蓼的主要活性成分，本研究以蘆丁作為黃酮類(lèi)成分的代表性成分對(duì)辣蓼進(jìn)行定性質(zhì)量控制［5］。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取蘆丁對(duì)照品，加乙醇制成2 mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取旱辣蓼粉末1 g加乙醇15 ml，40 KHz超聲30 min，濾過(guò)，回收乙醇，濃縮成稠浸膏狀，加乙醇0.5 ml溶解后作為供試品溶液。

2.2.3 檢測(cè)方法 照薄層色譜法（2015年版《中國(guó)藥典》四部通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 μl分別點(diǎn)于聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，待乙醇揮干后，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的黃綠色熒光斑點(diǎn)。

2.3 水分、灰分和浸出物檢查 按2015年版《中國(guó)藥典》方法測(cè)定［6-7］，結(jié)果見(jiàn)表2，10批旱辣蓼中水分含量為6.5%～10.5%，平均值為8.8%；總灰分含量為8.5%～13.7%，平均值為11.7%；酸不溶性灰分含量為0.8%～3.7%，平均值為2.5%；水溶性浸出物含量為18.7%～23.7%，平均值為21.0%；醇溶性浸出物含量為5.5%～13.0%，平均值為7.6%。

表2 水分、灰分和浸出物含量測(cè)定結(jié)果

2.4 重金屬及有害元素 按2015年版《中國(guó)藥典》方法（通則2321原子吸收分光光度法）測(cè)定［7］，結(jié)果見(jiàn)表3。10批旱辣蓼中鉛含量為0.3～4.7 mg/kg，平均值為1.8 mg/kg；鎘含量為0.10～0.41 mg/kg，平均值為0.22 mg/kg；砷含量為0.2～1.2 mg/kg，平均值為0.5 mg/kg；汞含量為0.00～0.02 mg/kg，平均值為0.00 mg/kg；銅含量為17.8～54.5 mg/kg，平均值為36.0 mg/kg。

表3 鉛、鎘、砷、汞和銅測(cè)定結(jié)果 mg/kg

2.5 含量測(cè)定

2.5.1 色譜條件Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇-0.1%磷酸（12∶88）；檢測(cè)波長(zhǎng)：268 nm；流速1.0 ml/min，進(jìn)樣10 μl［4，8］。理論板數(shù)按沒(méi)食子酸峰計(jì)算應(yīng)不得低于2 000。色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 對(duì)照品（A）供試品（B）HPLC色譜圖

2.5.2 溶液制備

2.5.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)定沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加50%甲醇制備成0.384 5 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，再取儲(chǔ)備溶液5 ml，置50 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，即得38.45 μg/ml對(duì)照品溶液。

2.5.2.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過(guò)4號(hào)篩）約1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入10%鹽酸50 ml，稱(chēng)定重量，加熱回流3 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用10%鹽酸補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液2 ml轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.5.3 線(xiàn)性關(guān)系考查 精密量取0.384 5 mg/ml的沒(méi)食子酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，稀釋成3.845、7.690、15.38、23.07、30.76、38.45和76.90 μg/ml的系列溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（μg），峰面積為縱坐標(biāo)并進(jìn)行回歸分析，得回歸方程Y=29 631X-52 266，（r=0.999 6）。結(jié)果顯示沒(méi)食子酸在3.845～76.9 μg/ml范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.5.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取沒(méi)食子酸（38.45 μg/ml）對(duì)照品溶液10 μl，在“2.5.1”項(xiàng)色譜條件下重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)得沒(méi)食子酸峰面積RSD為1.28%，表明儀器精密度良好。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將HLL7的供試品溶液分別于0、1、2、3、5、8和12 h，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得樣品中沒(méi)食子酸峰面積RSD為1.5%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取HLL7樣品，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，測(cè)得樣品中沒(méi)食子酸峰面積RSD為1.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.7 回收率試驗(yàn) 取HLL7的粉末6份，每份約0.7 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含沒(méi)食子酸對(duì)照品（濃度18.164 μg/ml）的10%鹽酸溶液50 ml，稱(chēng)定重量，加熱回流3 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用10%鹽酸補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。按照“2.5.1”項(xiàng)下的方法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得平均回收率為97.2%，RSD為2.62%，結(jié)果表明本方法具有良好的回收率。見(jiàn)表4。

表4 沒(méi)食子酸回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5.8 樣品測(cè)定 取本品10批，每批約1 g，按“2.5.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 旱辣蓼藥材中沒(méi)食子酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 薄層鑒別 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，超聲提取和回流提取對(duì)供試品制備基本無(wú)差別，但超聲提取較方便，故選擇超聲提取。耐用性試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同薄層板（預(yù)制硅膠G板、聚酰胺薄膜板）對(duì)鑒別效果有明顯區(qū)別，聚酰胺薄膜分離效果較好，硅膠G板顯色效果不好；不同溫度（5、26℃）和不同濕度（32%、60%、90%）考查，發(fā)現(xiàn)溫、濕度變化對(duì)展開(kāi)效果影響不大。

3.2 水分、灰分和浸出物測(cè)定 參照2015年版《中國(guó)藥典》［3］方法，進(jìn)行了水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物樣品測(cè)定，其中醇溶性浸出物采用熱浸法，考查了不同醇濃度（50%、70%和95%乙醇）為浸出溶劑時(shí)的浸出物的量，結(jié)果顯示50%乙醇為浸出溶劑浸出效果最好，建議優(yōu)化浸出溶劑為50%乙醇，醇浸出物（熱浸法）不得少于5.0%。此外，水溶性浸出物含量較高，建議水溶性浸出物不得低于18.0%。

3.3 重金屬及有害元素 參照2015年版《中國(guó)藥典》對(duì)白芍等中藥材要求，鉛不得過(guò)百萬(wàn)分之五；鎘不得過(guò)千萬(wàn)分之三；砷不得過(guò)百萬(wàn)分之二；汞不得過(guò)千萬(wàn)分之二；銅不得過(guò)百萬(wàn)分之二十。經(jīng)檢測(cè)，10批樣品中的鉛、砷、汞含量均符合要求；3批樣品中的鎘含量超標(biāo)；8批樣品中的銅含量超標(biāo)；旱辣蓼藥材的鎘和銅含量超標(biāo)情況需要高度關(guān)注。由于旱辣蓼來(lái)源極廣，且多為野生，檢測(cè)結(jié)果提示旱辣蓼可能對(duì)鎘、銅等重金屬元素有一定的富集作用。

3.4 含量測(cè)定 紫外掃描顯示沒(méi)食子酸在268 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故確定檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm。再進(jìn)行方法學(xué)優(yōu)化，對(duì)不同提取溶劑及提取方式（50 ml 50%甲醇超聲30 min、50 ml 10%鹽酸超聲30 min、50 ml 10%鹽酸回流30 min）進(jìn)行考查，發(fā)現(xiàn)10%鹽酸回流提取率較高，故采用10%鹽酸回流提取制備供試品；再對(duì)提取時(shí)間（50 ml 10%鹽酸回流0.5、1、1.5、2、2.5、3和3.5 h）、提取溶劑用量（50%鹽酸25、50、75和100 ml）、不同品牌色譜柱（Sun Flre C18柱、Diamonsil C18柱、依利特C18柱）等進(jìn)行了考查，優(yōu)化確定提取時(shí)間為3 h，提取溶劑用量為50 ml，并發(fā)現(xiàn)不同色譜柱對(duì)檢測(cè)結(jié)果無(wú)影響。