李 祥，安雅婷，周 淼

（天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

消炎止痛膏（津藥制字Z20070286號(hào)）是天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，其處方組成包括木瓜、大黃、醋乳香、醋沒(méi)藥、蒲公英等7味中藥。消炎止痛膏為外用軟膏劑，涂敷于跌打損傷及瘡瘍腫毒處，可發(fā)揮活血散瘀、清熱消腫止痛的功效［1-2］。蒲公英被譽(yù)為“天然抗生素”，有廣譜殺菌和抑菌作用，與酚酸類(lèi)物質(zhì)有一定關(guān)系［3］。咖啡酸是蒲公英的主要成分之一，是一種酚酸類(lèi)化合物，為黃色晶體，微溶于冷水，易溶于熱水及冷乙醇，能吸收紫外線?？Х人嵊休^廣泛的抑菌和抗病毒活性，也是消炎止痛膏發(fā)揮藥效的主要活性成分。消炎止痛膏雖然臨床上已取得較好的治療效果，但該劑型使用不方便。消炎止痛膏巴布膏劑將消炎止痛膏原劑型的缺點(diǎn)進(jìn)行改進(jìn)，不僅能使藥物有效成分透皮快速吸收，提高生物利用度，增強(qiáng)療效，而且攜帶方便，更有利于患者的使用，可提高用藥依從性。為使消炎止痛膏在臨床上發(fā)揮更好療效，延長(zhǎng)釋藥時(shí)間，控制藥物進(jìn)入體內(nèi)的速率，維持平穩(wěn)的血藥濃度，減少皮膚的刺激，根據(jù)中醫(yī)藥特色理論，結(jié)合現(xiàn)代制劑手段，可將傳統(tǒng)中藥膏劑消炎止痛膏制備成巴布膏劑。本文對(duì)消炎止痛膏巴布膏劑中咖啡酸含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。

1 儀器與試劑

1.1 設(shè)備儀器ACQUITY UPLCTM I-Class System超高效相色譜儀（美國(guó)Waters公司），HWS-150B恒溫恒濕培養(yǎng)箱（中國(guó)北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），Smart2Pure超純水儀（美國(guó)賽默飛公司），WGLL-125BE鼓風(fēng)干燥箱（中國(guó)天津泰斯特公司），Sorvall Legend Micro 21微量離心機(jī)（美國(guó)賽默飛公司），AS62.R2十萬(wàn)分之一天平（波蘭RADWAG公司），渦旋儀（中國(guó)江蘇天翎儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑 大黃（批號(hào)121200401，產(chǎn)地：青海，購(gòu)于北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司），蒲公英（批號(hào)21051511，產(chǎn)地：甘肅省天水市，購(gòu)于安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司），木瓜（批號(hào)388210401，產(chǎn)地：安徽，購(gòu)于北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司），梔子［4］（批號(hào)585210401，產(chǎn)地：浙江，購(gòu)于北京宏濟(jì)藥業(yè)有限公司），土鱉蟲(chóng)（批號(hào)2101012-01，產(chǎn)地：江蘇，購(gòu)于天津中藥飲片廠有限公司），乳香（批號(hào)201203207，產(chǎn)地：埃塞俄比亞，購(gòu)于天津市中藥飲片廠有限公司），沒(méi)藥（批號(hào)2012068-03，產(chǎn)地：索馬里，購(gòu)于天津市中藥飲片廠有限公司），上述藥材經(jīng)天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院孫浩主任中藥師鑒定、藥檢室檢測(cè)均符合《中國(guó)藥典》2020年版［5］及《天津市中藥炮制規(guī)范》2018版［5］的要求；咖啡酸對(duì)照品（批號(hào)110885-201703，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；酒石酸（批號(hào)150722）、甘羥鋁（批號(hào)150514）、EDTA（批號(hào)150616）均為藥用（上海森磊化工有限公司）；二氯甲烷、鹽酸、甲醇、甲酸等均為分析純，乙腈為色譜純（天津康科德科技有限公司），水為超純水（自制）。消炎止痛膏巴布膏劑樣品為本院制劑室提供（批號(hào)001、002、003）。

2 處方組成及制法

2.1 處方組成 本制劑由大黃、土鱉蟲(chóng)、蒲公英、梔子、木瓜、醋乳香、醋沒(méi)藥7味飲片提取液及酒石酸、甘油、AP-800、甘羥鋁、EDTA等組成。

2.2 制法 上述7味飲片1 647 g，加適量水浸泡，分別加8倍量的水，煎煮3次，每次煎煮2 h，合并煎液，過(guò)濾，濃縮至規(guī)定相對(duì)密度，冷卻。加入酒石酸等5種輔料約310 g至溶，攪拌至糊狀，制成1 000 g膏體。傾至背襯上，并覆蓋上壓花膜，滾壓至約1.5~2 mm厚，固化，剪切成每塊為5 cm×10 cm的成品。每貼含膏量為20 g。

3 含量測(cè)定方法研究

3.1 溶液的制備

3.1.1 供試品溶液制備 取樣品1片，除去蓋襯，置于錐形瓶中，加入25 ml 8%鹽酸，超聲10 min，二氯甲烷萃取3次，每次25 ml，合并二氯甲烷層，水浴蒸干，甲醇溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至50 ml量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，續(xù)濾液備用。

3.1.2 對(duì)照品溶液制備 精密量取咖啡酸對(duì)照品，加甲醇定容至5 ml量瓶中，制得對(duì)照品溶液濃度為1.02 mg/ml。

3.1.3 陰性樣品溶液制備 取不含蒲公英的巴布膏劑，按“3.1.1”項(xiàng)下方法制備。

3.2 色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫：45℃；樣品室溫度：4℃；進(jìn)樣體積：2 μl；流動(dòng)相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫，洗脫程序如表1所示；流速：0.3 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm。

表1 梯度洗脫程序

3.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液各2 μl，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，對(duì)照品的理論塔板數(shù)不低于5 000。在此色譜條件下，咖啡酸色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度大于1.5，對(duì)稱(chēng)因子在0.95~1.05之間，咖啡酸與其他成分可以有效地進(jìn)行分離，陰性樣品對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）UPLC色譜圖

3.4 線性試驗(yàn) 精密量取“3.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，將其稀釋為不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取各2 μl注入色譜柱，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以濃度為X軸，峰面積為Y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為Y=36 652.543 1 X-5 463.025 4（r=0.999 9）。在0~70 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取“3.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，每次1 μl，峰面積RSD值為0.2%，表明精密度良好。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批樣品（批號(hào)003），制備供試品溶液，平行6份，處理后分別進(jìn)樣5 μl測(cè)定，RSD值為1.02%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將供試品溶液及對(duì)照品溶液分別于室溫下放置0、6、12、18和24 h時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積。結(jié)果顯示供試品溶液中咖啡酸色譜峰面積的RSD為1.24%，對(duì)照品溶液中咖啡酸色譜峰面積的RSD為1.1%，表明供試品溶液及對(duì)照品溶液于室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的樣品（批號(hào)003）共6份，精密加入對(duì)照品溶液（156.4 μg/ml）1 ml，制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，平均回收率為88.04%，RSD值為2.95%，見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.9 含量測(cè)定 取3批樣品各1貼按“3.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄咖啡酸色譜峰面積，將峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各批次樣品含量，咖啡酸含量見(jiàn)表3。

表3 消炎止痛膏巴布膏劑含量

3.10 檢測(cè)限度 根據(jù)前期研究及轉(zhuǎn)移率的試驗(yàn)結(jié)果，按測(cè)定平均含量的80%計(jì)算，每貼含咖啡酸不得少于0.62 mg。

4 討論

4.1 測(cè)定方法 本文對(duì)消炎止痛膏巴布膏劑中咖啡酸含量測(cè)定方法進(jìn)行研究。UPLC方法與傳統(tǒng)的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）相比，具有高分離度、高速度以及高靈敏度的優(yōu)勢(shì)，其色譜柱填料粒徑更?。?.7 μm）、檢測(cè)器采樣速度更快。在本試驗(yàn)中，使用UPLC可提高分離度、改善峰形，且能夠提高樣品分析效率。

4.2 色譜條件篩選 本研究采用UPLC方法建立咖啡酸含量測(cè)定方法，經(jīng)過(guò)優(yōu)化不同色譜柱型號(hào)（BEH C18、BEH shield RP18、CSH C18）、不同流動(dòng)相體系（甲醇-水、乙腈-水）、不同柱溫（30、35和40℃）、不同流速（0.3和0.4 ml/min）等色譜條件，結(jié)果顯示前文所述條件為最佳色譜條件，可以滿(mǎn)足咖啡酸含量測(cè)定的分離檢測(cè)要求。

4.3 樣品提取 巴布貼劑中由于基質(zhì)具有一定的黏性，對(duì)樣品的提取方法具有一定要求，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前采用的提取方法有以甲醇等有機(jī)試劑進(jìn)行加熱回流提取或超聲提取?？Х人崾且环N有機(jī)酸，屬于酚酸類(lèi)化合物，有較廣泛的抑菌和抗病毒活性，微溶于冷水，易溶于熱水及冷乙醇。本項(xiàng)目綜合考慮咖啡酸理化性質(zhì)，最終采用的是甲醇超聲方法提取巴布膏劑中指標(biāo)成分，加樣回收率結(jié)果顯示該方法滿(mǎn)足相關(guān)要求。

4.4 回收率試驗(yàn) 研究結(jié)果顯示平均回收率為88.04%，按照《中國(guó)藥典》2020年版［6］四部分析方法指導(dǎo)原則中數(shù)據(jù)要求規(guī)定，樣品中待測(cè)定成分含量和回收率限度關(guān)系，在基質(zhì)復(fù)雜組分含量低于0.01%及多成分等分析中，可適當(dāng)放寬回收率限度?；|(zhì)處方中AP-800、甘羥鋁、EDTA、甘油對(duì)處方的影響較大。AP-800是構(gòu)成巴布膏劑親水性凝膠骨架形體的基本物質(zhì)，是一種優(yōu)質(zhì)的巴布膏劑骨架材料，其聚丙烯酸和聚丙烯酸鈉的比例相等，黏度、分子鏈長(zhǎng)度、交聯(lián)程度和pH等適中。研究表明，甘羥鋁中的Al3+與AP-800中的羧基交聯(lián)形成交聯(lián)型基質(zhì)，交聯(lián)速度適中，有利于巴布膏劑的制備和涂布。甘油為保濕劑。螯合劑EDTA可控制交聯(lián)反應(yīng)程度，增強(qiáng)巴布膏劑的保濕性及黏附性。因?yàn)樘崛∥镏谢瘜W(xué)成分復(fù)雜，含有倍半萜內(nèi)酯、糖類(lèi)、三萜類(lèi)、有機(jī)酸、生物堿類(lèi)、黃酮等，其復(fù)雜的化學(xué)成分與空白基質(zhì)中的Al3+、羧基、螯合劑EDTA等產(chǎn)生反應(yīng)，導(dǎo)致膏體黏性變大，內(nèi)聚力減小。本制劑為中藥制劑，組分多且基質(zhì)成分具有吸附性及不易洗脫等因素，同時(shí)實(shí)際樣品測(cè)定中每克膏體中含咖啡酸約38 μg/g，因此按照《中國(guó)藥典》規(guī)定要求回收率可在80%~115%之間。